本發(fā)明涉及一種結(jié)核感染的試劑盒，尤其涉及采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)來檢測包含潛伏期在內(nèi)的全程結(jié)核感染的試劑盒及其引物對和探針。
背景技術(shù)：
：從全球范圍來看，結(jié)核至今為止仍然是傳染病中發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，據(jù)估計每年新發(fā)病例約900，0000人，每年約有200，0000人死于結(jié)核病。結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患傳染病，是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料顯示：全年齡組結(jié)核感染率為44.5％，活動性結(jié)核患者451萬，每年死亡人數(shù)達13萬，結(jié)核病死亡占各種傳染病，寄生蟲病死亡的65.1％，幾乎為其它各種傳染病、寄生蟲病死亡總和的2倍。由于人類免疫缺陷病毒的廣泛傳播及耐藥結(jié)核分枝桿菌的日益增多，使得這一古老的疾病再次引起人們的廣泛關(guān)注。結(jié)核病成為危害人類健康的重要傳染病之一。由于診斷潛伏性結(jié)核感染的檢測方法研究進展緩慢，導(dǎo)致結(jié)核疫情控制不佳。目前，全血γ-干擾素釋放試驗(igra)已經(jīng)在歐美地區(qū)和日本等多個低結(jié)核疫情國家廣泛使用，igra采用起源于卡介苗接種菌及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌所缺失的結(jié)核菌致病菌中的rd1-區(qū)所編碼的特異性刺激蛋白如esat-6和cfp-10來進行檢測，該類刺激物已經(jīng)有商品化igra試劑，例如quantiferontbgoldtest和tspot.tbtest。有研究者在igra檢測中量化干擾素-γ(ifn-γ)mrna表達水平，將其作為ifn-γ指示物，但ifn-γrt-pcr的特異性和靈敏度較差，且無法鑒別活躍期和潛伏期結(jié)核感染(ltbi)。在中國，tst作為一種基于對結(jié)核菌衍生的純化蛋白(ppd)所產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的檢測方法仍然是用來診斷結(jié)核菌潛伏性感染(ltbi)的主要方法。tst的敏感度和特異度都依賴于一個特定群體中所定義的不同截斷值而定。如果提高反應(yīng)硬結(jié)直徑截斷值特異度就會增加(同時敏感度下降)。該實驗的特異度變化很大而且主要依賴與非結(jié)核分支桿菌之間的交叉反應(yīng)的可能性而定。另外，tst不能區(qū)分陳舊感染與新近感染，與卡介苗及環(huán)境非結(jié)核分支桿菌之間存在交叉免疫而導(dǎo)致假陽性，更由于在免疫抑制人群中檢測結(jié)果存在假陰性甚至可能導(dǎo)致誤診。重復(fù)tst反應(yīng)或者兩步法tst檢測可能導(dǎo)致助推效應(yīng)從而引起敏感度的增加。tst和igras均不能鑒別潛伏期和活動期結(jié)核，而根除結(jié)核的關(guān)鍵之一在于鑒別潛伏性結(jié)核感染。因此，探索一種特異性強、靈敏度高的診斷潛伏性結(jié)核感染的檢測方法至關(guān)重要。實時熒光定量pcr(fq-pcr)是近年在普通pcr基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸檢測方法，它將熒光值的積累與pcr產(chǎn)物的擴增過程相結(jié)合，通過測量指數(shù)擴增期的熒光值來計算待測樣本中核酸的原始量。其具有操作簡便、耗時短、可定量等傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)點。另外，趨化因子是一類結(jié)構(gòu)功能相似，具有趨化吸引性的小分子量蛋白，其一級結(jié)構(gòu)十分相似，當(dāng)趨化因子與其相應(yīng)受體相結(jié)合后，通過激活g蛋白偶聯(lián)受體，產(chǎn)生級聯(lián)信號傳導(dǎo)，對多種炎性細(xì)胞趨化和激活，在呼吸系統(tǒng)、心血管和肝腎等疾病中起重要作用。比如，由活化的淋巴細(xì)胞分泌的下游趨化因子γ-干擾素在結(jié)核感染檢測中敏感度達80％。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的針對結(jié)核感染的檢測方法不能鑒別潛伏性結(jié)核感染以及現(xiàn)有檢測方法特異性或敏感度不強等缺陷，提供一種檢測包含潛伏期在內(nèi)的全病程結(jié)核感染的試劑盒、特別是熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fq-pcr)試劑盒及其引物對和探針。該試劑盒具有操作簡便、特異性強、靈敏度高、耗時短以及可定量等優(yōu)點，特別能夠檢測潛伏期和/或早期的結(jié)核感染。本發(fā)明人首先選擇結(jié)核感染、特別是潛伏結(jié)核感染時，活化的t細(xì)胞被激活時，特異的靶分子會發(fā)生上調(diào)，意外發(fā)現(xiàn)趨化因子cxcl9、cxcl11和cxcl13中的一種或兩種以上的組合均對于潛伏結(jié)核感染有較好的靈敏度和特異性。然后進一步針對上述趨化因子挑選合適的檢測方法。由于與基于擴增反應(yīng)完成后進行單一終點檢測的傳統(tǒng)pcr方法不同，fq-pcr方法可以在擴增反應(yīng)進行的過程中隨時監(jiān)測擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而極大的提高了定量檢測的準(zhǔn)確性和精密度，故本發(fā)明優(yōu)選fq-pcr方法。實時熒光定量pcr(taqman探針法)在pcr的擴增中，同時加入了引物和在5’末端和3’末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結(jié)合，探針序列保持完整，熒光發(fā)生基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，故沒有熒光信號的產(chǎn)生，而當(dāng)探針與靶序列能夠互補結(jié)合時，在pcr擴增進行的過程中，dna聚合酶在引導(dǎo)dna序列復(fù)制的同時其5’-3’端外切酶活性將切斷熒光探針，導(dǎo)致熒光發(fā)生基團與熒光淬滅基團的分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可以接收并記錄熒光信號。每擴增一條dna鏈即有一個熒光信號的產(chǎn)生，熒光信號的積累與pcr產(chǎn)物的形成完全同步，故可以實時地監(jiān)測整個pcr反應(yīng)過程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線或表達量恒定的內(nèi)對照產(chǎn)物對未知的靶多核苷酸進行絕對或相對的定量分析。因此，探針和引物的設(shè)計對于實現(xiàn)靶多核苷酸的定量檢測至關(guān)重要。本發(fā)明人為此反復(fù)試驗和研究，在特異性和敏感度等方面進行平衡，篩選出了測定趨化因子cxcl9、cxcl11和cxcl13的相關(guān)引物對和探針。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一是：一種檢測包含潛伏期結(jié)核感染的試劑盒，其包括至少一種反應(yīng)液，所述反應(yīng)液包括目的基因的一引物對和一探針，所述的引物對和探針針對結(jié)核分枝桿菌特異性t細(xì)胞分泌的下游趨化因子cxcl9、cxcl11或cxcl13的基因序列設(shè)計；其中，針對趨化因子cxcl9設(shè)計的所述引物對的正向引物(引物1)是如seqidno.1所示序列的核酸，反向引物(引物2)是如seqidno.2所示序列的核酸，所述探針(探針1)的核苷酸序列如seqidno.9所示；針對趨化因子cxcl11設(shè)計的所述引物對的正向引物(引物3)是如seqidno.3所示序列的核酸，反向引物(引物4)是如seqidno.4所示序列的核酸，所述探針(探針2)的核苷酸序列如seqidno.10所示；或者針對趨化因子cxcl13設(shè)計的所述引物對的正向引物(引物5)是如seqidno.5所示序列的核酸，反向引物(引物6)是如seqidno.6所示序列的核酸，所述探針(探針3)的核苷酸序列如seqidno.11所示。其中，引物1位于人的cxcl9基因序列的197-221位，引物2位于289-265位，擴增片段長度為93bp，所對應(yīng)的探針位于234-260位；引物3位于人的cxcl11基因序列的113-136位，引物4位于255-230位，擴增片段長度為143bp，所對應(yīng)的探針位于184-211位；引物5位于人的cxcl13基因序列的199-224位，引物6位于314-293位，擴增片段長度為116bp，所對應(yīng)的探針位于226-249位。較佳地，使結(jié)果可靠，抗干擾能力更強，作為表達量參照，本發(fā)明選用管家基因作為內(nèi)部參照，優(yōu)選人β-globin(β-球蛋白)基因，所述的反應(yīng)液均還包括針對人β-globin基因設(shè)計的管家基因的一引物對和一探針；所述引物對中，正向引物(引物7)是如seqidno.7所示序列的核酸，反向引物(引物8)是如seqidno.8所示序列的核酸，所述探針(探針4)的核苷酸序列如seqidno.12所示。其中，引物7位于人β-globin基因組序列的hbb基因(62137-63742)的62627-62647位，引物8位于62756-62775位，擴增片段長度為149bp，所對應(yīng)的探針位于β-globin基因序列反向序列的62731-62755位。較佳地，所述的反應(yīng)液均還包括pcr反應(yīng)緩沖液和2’-脫氧核苷三磷酸；較佳地，所述2’-脫氧核苷三磷酸的濃度為100mm。本發(fā)明所述的試劑盒優(yōu)選為實時熒光定量pcr(fq-pcr)試劑盒。較佳地，上述試劑盒還可以包括普通pcr、熒光pcr、尤其fq-pcr的其他常規(guī)試劑：eztaq混合液和陰性質(zhì)控品等；所述eztaq混合液包括熱啟動taq酶，濃度優(yōu)選1-5u/μl。更佳地，為提高血液樣本中趨化因子的含量，相應(yīng)地提高試劑盒檢測的靈敏度和特異性，所述試劑盒還可以包括結(jié)核抗原管和本底對照管，所述結(jié)合抗原管中包含抗原刺激物或其組合物；所述抗原刺激物或其組合物優(yōu)選抗原cfp10衍生肽、抗原esat6衍生肽、抗原ppe衍生肽以及抗原ag85a衍生肽中的至少一種。所述抗原cfp10衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.13所示，所述抗原esat6衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.14所示，所述抗原ppe衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.15所示，所述抗原ag85a衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.16所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之二是：一種檢測包含潛伏期結(jié)核感染的探針，所述探針的核苷酸序列如seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11或者seqidno.12所示。較佳地，上述探針為適用fq-pcr檢測的熒光探針，其上述序列的兩端連接的均為常規(guī)的熒光報告基團和淬滅基團。其中，目的基因(seqidno.9-11)報告基團：fam；管家基因報告基團(seqidno.12)：vic；目的基因和管家基因的淬滅基團：bhqmgb)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之三是：一種檢測包含潛伏期結(jié)核感染的引物對，所述引物對的一條是如seqidno.1所示序列的核酸，另一條是如seqidno.2所示序列的核酸；所述引物對的一條是如seqidno.3所示序列的核酸，另一條是如seqidno.4所示序列的核酸；所述引物對的一條是如seqidno.5所示序列的核酸，另一條是如seqidno.6所示序列的核酸；或者所述引物對的一條是如seqidno.7所示序列的核酸，另一條是如seqidno.8所示序列的核酸。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之四是：一種反應(yīng)液，其包括一引物對和一探針，所述的引物對和探針針對結(jié)核分枝桿菌特異性t細(xì)胞分泌的下游趨化因子cxcl9、cxcl11或cxcl13的基因序列設(shè)計；其中，針對趨化因子cxcl9設(shè)計的所述引物對的正向引物是如seqidno.1所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.2所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.9所示；針對趨化因子cxcl11設(shè)計的所述引物對的正向引物是如seqidno.3所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.4所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.10所示；或者針對趨化因子cxcl13設(shè)計的所述引物對的正向引物是如seqidno.5所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.6所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.11所示。較佳地，所述反應(yīng)液均還包括作為表達量參照檢測管家基因人β-globin基因的管家基因的一引物對和一探針；所述引物對中，正向引物是如seqidno.7所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.8所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.12所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之四是：所述的探針、所述的引物對或者所述的反應(yīng)液在制備檢測包括潛伏期結(jié)核感染的試劑盒、優(yōu)選fq-pcr試劑盒中的應(yīng)用。較佳地，所述應(yīng)用為將上述試劑盒用于血液樣本的檢測。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進步效果在于：如上所述，為了檢測出臨床血液樣本是否為潛伏結(jié)核感染樣本，本發(fā)明將趨化因子cxcl9、cxcl11、cxcl13的核苷酸序列進行分析，特別設(shè)計適用本發(fā)明檢測試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實時定量檢測，不僅操作簡便、耗時短、特異性強，而且極大地提高了結(jié)核檢測靈敏度，避免卡介苗或陳舊感染等的干擾導(dǎo)致假陽性而結(jié)果不準(zhǔn)確，降低了模板使用量。實驗證明，本發(fā)明對潛伏結(jié)核檢測的靈敏度在97％以上。利用本發(fā)明的試劑盒能夠及早發(fā)現(xiàn)潛伏的結(jié)核感染并采取應(yīng)對措施，以減輕患者痛苦，提高結(jié)核治愈率。附圖說明圖1為擴增曲線不呈現(xiàn)“s”型或ct值＞35的樣本。圖2為ct值空白樣本。圖3為擴增曲線呈現(xiàn)“s”型且結(jié)核刺激樣本ct值<本底對照樣本ct值；其中，圖1-3中的“a”和“b”分別指的是“目的基因”和“管家基因”。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例1試劑盒各組成成分的制備以及試劑盒的組裝表1.各組分名稱、濃度以及含量上述反應(yīng)緩沖液選用市售商品(購自上海多澤生物科技有限公司)，dntp(購自上海兆維科技發(fā)展有限公司)，eztaq酶或混合液(購自上海多澤生物科技有限公司)，引物和探針(商業(yè)合成，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(abi))。(1)制備包括下列組成成份的試劑盒：反應(yīng)液1(650μl/管)1管：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于擴增cxcl9的正向引物(引物1)和反向引物(引物2)，寡核苷酸探針為探針1；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4。反應(yīng)液2(650μl/管)1管：反應(yīng)液2由如下組分組成：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于cxcl11靶多核苷酸擴增的正向引物(引物3)和反向引物(引物4)，寡核苷酸探針為探針2；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4。反應(yīng)液3(650μl/管)1管：反應(yīng)液3由如下組分組成：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于cxcl13靶多核苷酸擴增的正向引物(引物5)和反向引物(引物6)，寡核苷酸探針為探針3；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴增的正向引物(引物7)和反向引物(引物8)，寡核苷酸探針為探針4。eztaq酶混合液(150μl/管)1管：taq酶。表2eztaq酶混合液組成標(biāo)準(zhǔn)液：陰性質(zhì)控品(80μl/管)：純化水。結(jié)核抗原管(采血管1)：抗原刺激物放到采血管中，每支采血管含有抗原刺激物20μg(0.5mg/ml)和肝素鈉干粉30iu(900iu/ml)。本底對照管(采血管2)：采血管中只含有肝素鈉干粉30iu(900iu/ml)。反應(yīng)液1與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對照管作為體系i；反應(yīng)液2與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對照管作為體系ii；反應(yīng)液3與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對照管作為體系iii。其中，引物1-8構(gòu)成了各體系中的核酸擴增體系，探針1-4構(gòu)成了各體系中的熒光檢測體系；各引物和探針具體組成如下：表3各引物和探針具體組成引物名稱核苷酸組成序列號引物15’-ccacctacaatccttgaaagacctt-3’seqidno.1引物25’-tgaactccattcttcagtgtagcaa-3’seqidno.2引物35’-tcaatttcctttcatgttcagcat-3’seqidno.3引物45’-acacaatatcacagccaaggctatag-3’seqidno.4引物55’-gtctttatccctagacgcttcattga-3’seqidno.5引物65’-gggtccacacacacaattgact-3’seqidno.6引物75’-ttcctcctcctgagcagt-3’seqidno.7引物85’-aaggtcataacctggttcatc-3’seqidno.8探針15’-ccaagcccttcctgcgagaaaattgaa-3’seqidno.9探針25’-caccagcagcaacagcaaaaaacaaaca-3’seqidno.10探針35’-cgaattcaaatcttgccccgtggg-3’seqidno.11探針45’-ccctggcgtcgtgattagtgatgatgaac-3’seqidno.12上述探針1～3的5’端連接有報告基團fam，3’端連接有淬滅基團bhqmgb；探針4的5’端連接有報告基團vic，3’端連接有淬滅基團bhqmgb。(2)試劑盒的組裝根據(jù)需求，可將eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液等試劑管以及結(jié)核抗原管和本底對照管分別與裝有上述反應(yīng)液1～3的單個離心管分隔包裝組成分別測定趨化因子cxcl9、cxcl11、cxcl13的試劑盒；也可以將上述各試劑管以及采血管和2個以上分別裝有不同的上述反應(yīng)液1～3的離心管包裝成雙靶點或三靶點的試劑盒。實施例2試劑盒的使用方法1)抽取樣本血液至本底對照管和結(jié)核抗原管中樣本采集、運送和保存：用一次性真空采血器，無菌操作，取待檢個體血液樣本，做好標(biāo)示后將獲取的血液樣本置于低溫冰箱(-70℃或-20℃)中冷凍保存。如集中檢驗，標(biāo)本需在0℃以下環(huán)境中運送并于24小時內(nèi)送達實驗室。臨床抽取2ml樣本血液加入本底對照管中，標(biāo)記為本底對照樣本；另抽取同一個體樣本血液2ml，加入含有20μg抗原刺激物(包含cfp10、esat6、ppe4和ag85a的衍生肽段(摩爾比為1:1:1:1)，由金斯康科技(南京)有限公司合成)的結(jié)核抗原管中于35℃下刺激6h后，標(biāo)記為結(jié)核抗原樣本。其中，4種抗原衍生肽的序列為：cfp10衍生肽：qgqwrgaagtaa(如seqidno.13所示)；esat6衍生肽：elnnal(如seqidno.14所示)；ppe衍生肽：agwqtlsaaldaqaveltar(seqidno.15所示)；ag85a衍生肽：rhvkptgsavvgl(如seqidno.16所示)。2)提取本底對照管和結(jié)核抗原管血液樣本中的rna取兩管中待測血樣各300μl(所述待測血液是指需要檢測是否為潛伏結(jié)核感染的臨床血液樣本)，用磁珠法同批次提取(提取試劑購自深圳市安必勝科技有限公司)血液樣本mrna，使用rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用分光光度計或類似的儀器確認(rèn)cdna的質(zhì)量(od260/280在1.8-2.0之間)。3)將所述cdna加入到反應(yīng)液中，通過核酸擴增體系、用實時熒光pcr儀進行擴增反應(yīng)，循環(huán)擴增待測樣品中的靶多核苷酸；使所述熒光檢測體系中的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結(jié)合。將逆轉(zhuǎn)錄的每份結(jié)核抗原管cdna和本底對照管cdna分別置于3個pcr反應(yīng)管或pcr板的3個孔中，每孔2μl。然后，在加入同一dna樣本的3個孔中各加入一種pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3)15μl，再在每個孔中加入3μl的eztaq酶混合液?；靹螂x心后，將pcr反應(yīng)體系置于自動熒光檢測熱循環(huán)儀(abi7500)上，選擇fam通道(reporter:fam,quencher:none)收集特異擴增信號；選擇vic通道(reporter:vic,quencher:none)檢測內(nèi)標(biāo)；參比熒光(passivereference)設(shè)置為none；設(shè)置samplevolume為20。按照儀器操作說明做好相應(yīng)設(shè)置后開始試驗。具體pcr擴增反應(yīng)體系、反應(yīng)條件見表4和表5。表4pcr擴增反應(yīng)體系組分含量反應(yīng)液1或2或315μleztaq酶混合液3μl模板2μl總計20μl表5pcr擴增反應(yīng)條件4)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值判定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件，點選儀器的數(shù)據(jù)分析選項后可查看各個pcr反應(yīng)體系的結(jié)果，如pcr擴增曲線，待檢樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本的ct值等。計算方法：以擴增過程前3～15循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值(threshold)，以熒光值超過閾值的循環(huán)數(shù)為閾值循環(huán)數(shù)(值)ct值。若管家基因ct值＞35，結(jié)果不可靠，請重新測定或觀察血液本身是否存在問題。若管家基因ct值≦35時進行以下計算：本底對照管：△cta＝ct值(目的基因)-ct值(管家基因)結(jié)核抗原管：△ctb＝ct值(目的基因)-ct值(管家基因)結(jié)果判讀：t值＝△ctb–△cta。1.無效結(jié)果判定：與存在于體系ⅰ、ⅱ、ⅲ中的寡核苷酸熒光探針1、探針2、探針3和探針4相關(guān)的擴增曲線不呈現(xiàn)“s”型或ct值空白又或ct值＞35的樣本，報告為無效(見圖1、圖2)；2.陽性結(jié)果判定：滿足與體系ⅰ或體系ⅱ或體系ⅲ中的寡核苷酸探針1、探針2、探針3和探針4相關(guān)的擴增曲線呈現(xiàn)“s”型且t值≤-1.04，報告為陽性(見圖3)；3.陰性結(jié)果判定：屬于無效結(jié)果判定和陽性結(jié)果判定以外的情況且t值＞-1.04。則報告為陰性(陰性對照品就是沒有出現(xiàn)擴增，說明本實驗體系未受到外界污染)。實施例3使用本發(fā)明的試劑盒檢測30例臨床血液樣本的結(jié)果與分析采用單盲實驗法，從來自(南京胸科醫(yī)院)的500例血液樣本中選擇30例(均為需要檢測是否為潛伏結(jié)核感染的臨床血液樣本)用本發(fā)明的試劑盒進行試驗，以臨床診斷對實驗結(jié)果進行復(fù)核。實驗過程：臨床抽取2ml樣本血液至本底對照管中，標(biāo)記為本底對照樣本；另抽取2ml血液樣本，加入到含有20μg抗原刺激物的結(jié)核抗原管中，于35℃刺激6h后，標(biāo)記為結(jié)核抗原樣本。將待檢測血樣取300μl，用磁珠法同批次提取血液樣本mrna，購買市售rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用分光光度計或類似的儀器確認(rèn)cdna的質(zhì)量(od260/280在1.8-2.0之間)，將逆轉(zhuǎn)錄的每份待檢樣本cdna和標(biāo)準(zhǔn)品cdna分別置于3個pcr反應(yīng)管或pcr板的3個孔中，每孔2μl。然后，在加入同一dna樣本的3個孔中各加入一種pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3)15μl，再在每個孔中加入3μl的eztaq酶混合液。具體pcr擴增反應(yīng)體系見表3?；靹螂x心后，將pcr反應(yīng)體系置于自動熒光檢測熱循環(huán)儀上，選擇fam通道(reporter:fam,quencher:none)收集特異擴增信號；選擇vic通道(reporter:vic,quencher:none)檢測內(nèi)標(biāo)；參比熒光(passivereference)設(shè)置為none；設(shè)置samplevolume為20。按照儀器操作說明做好相應(yīng)設(shè)置后開始試驗。本試劑盒的所使用的反應(yīng)條件(如表5所示)是：(1)95℃預(yù)變性5分鐘；(2)95℃15秒；(3)58℃35秒；(4)72℃20秒；步驟(2)-(4)循環(huán)40次。試驗數(shù)據(jù)以及數(shù)據(jù)分析：表6反應(yīng)液1檢測結(jié)果表7反應(yīng)液2檢測結(jié)果表8反應(yīng)液3檢測結(jié)果表93種反應(yīng)液的檢測結(jié)果比較表10不同反應(yīng)液組合時的靈敏度實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明對潛伏結(jié)核檢測的靈敏度最高達97％以上。<110>蘇州創(chuàng)瀾生物科技有限公司<120>一種檢測包含潛伏期的結(jié)核感染的試劑盒及其引物對和探針<130>p1611497c<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物1<400>1ccacctacaatccttgaaagacctt25<210>2<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物2<400>2tgaactccattcttcagtgtagcaa25<210>3<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物3<400>3tcaatttcctttcatgttcagcat24<210>4<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物4<400>4acacaatatcacagccaaggctatag26<210>5<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物5<400>5gtctttatccctagacgcttcattga26<210>6<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物6<400>6gggtccacacacacaattgact22<210>7<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物7<400>7ttcctcctcctgagcagt18<210>8<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物8<400>8aaggtcataacctggttcatc21<210>9<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針1<400>9ccaagcccttcctgcgagaaaattgaa27<210>10<211>28<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針2<400>10caccagcagcaacagcaaaaaacaaaca28<210>11<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針3<400>11cgaattcaaatcttgccccgtggg24<210>12<211>29<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針4<400>12ccctggcgtcgtgattagtgatgatgaac29<210>13<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>cfp10衍生肽段<400>13glnglyglntrpargglyalaalaglythralaala1510<210>14<211>6<212>prt<213>artificialsequence<220><223>esat6衍生肽段<400>14gluleuasnasnalaleu15<210>15<211>20<212>prt<213>artificialsequence<220><223>ppe衍生肽段<400>15alaglytrpglnthrleuseralaalaleuaspalaglnalavalglu151015leuthralaarg20<210>16<211>13<212>prt<213>artificialsequence<220><223>ag85a衍生肽段<400>16arghisvallysprothrglyseralavalvalglyleu1510當(dāng)前第1頁12