本發(fā)明屬于微生物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種用于半滑舌鰨養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑。

背景技術(shù)：

微生態(tài)制劑是一種替代抗生素的新型產(chǎn)品，以其無殘留、無耐藥性、無毒副作用、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖、動(dòng)物養(yǎng)殖、種植業(yè)以及疾病治療等領(lǐng)域，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

乳桿菌作為最早應(yīng)用的、歷史最悠久的有益菌，是一類能夠分解碳水化合物以產(chǎn)生乳酸為主要代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽(yáng)性菌。此類菌屬是動(dòng)物腸道中的正常微生物，自然定植于消化道，可以代謝生成低能脂肪酸降低ph值，從而對(duì)腸道中的有害微生物起抑制作用，調(diào)整腸道菌群平衡，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高機(jī)體的免疫能力。將乳桿菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)是解決水產(chǎn)存活率低等問題的一個(gè)有效途徑。

芽孢桿菌在腸道中存在數(shù)量極少，但是芽孢桿菌能夠形成芽孢，在干燥、高壓、高溫、低溫等惡劣環(huán)境中的生存力較強(qiáng)，且能在腸道內(nèi)進(jìn)行出芽、生長(zhǎng)和繁殖等生理過程，并具有多種高效的酶促效應(yīng)。芽孢桿菌可以迅速降解養(yǎng)殖水體中的各種有機(jī)物，包括殘留餌料、水產(chǎn)動(dòng)物的排泄物、死亡的生物的殘?bào)w及池底淤泥中的有機(jī)物，除此之外，還能降低水體中的氨氮與亞硝態(tài)氮的含量、增加溶解氧的含量，進(jìn)而有效地改良水質(zhì)，營(yíng)造良好的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。將芽孢桿菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)是解決抗生素污染問題的一個(gè)有效方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于半滑舌鰨養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑。所得微生態(tài)制劑既能提高半滑舌鰨幼苗存活率，又能改善養(yǎng)殖水質(zhì)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面具有廣闊的市場(chǎng)前景。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于半滑舌鰨養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑，其制備方法包括以下步驟：

1）芽孢桿菌和低溫乳桿菌的培養(yǎng)：將芽孢桿菌和乳桿菌菌種從試管斜面培養(yǎng)基中取出，分別接種到裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后置于搖床中，于20℃、150-250r/min條件下培養(yǎng)24h；

2）將步驟1）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌菌液及乳桿菌菌液分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時(shí)間為48-72h；

3）將步驟2）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌發(fā)酵液和乳桿菌發(fā)酵液分別于10000r/min離心20min，以分離菌體與上清液；將所得菌體共同加入保護(hù)劑中攪拌混勻，再經(jīng)真空冷凍干燥制得所述微生態(tài)制劑。

步驟1）中芽孢桿菌所用的液體培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g；ph值7.6-7.8，使用前于121℃滅菌15-20min；乳桿菌所用液體培養(yǎng)基為mrs培養(yǎng)基，使用前于121℃滅菌15-20min。

步驟2）中乳桿菌菌液及乳桿菌菌液的接種量均為2vol%，兩者所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含可溶性淀粉3-3.5g、蛋白胨10-12g、酵母膏3-5g、kh2po41.5-4g、khpo42-4g、mgso40.1-1g、zncl21-3g；ph值7.4-7.6，使用前于121℃滅菌15-20min。

步驟3）中所述保護(hù)劑由低聚木糖、β-葡聚糖、海藻糖、脫脂乳及水組成；其中，低聚木糖和β-葡聚糖的濃度均為2.0g/l，海藻糖的濃度為5wt%，脫脂乳的濃度為20wt%。

所述微生態(tài)制劑可作為飼料添加劑用于半滑舌鰨的養(yǎng)殖。

低溫乳桿菌具有優(yōu)良的產(chǎn)酶能力，且在低溫條件下，產(chǎn)酶能力沒有明顯下降。添加低溫乳桿菌的飼料可以顯著增加半滑舌鰨的體重，改善半滑舌鰨的消化能力。

芽孢桿菌具有保濕性強(qiáng)、有機(jī)質(zhì)分解力強(qiáng)、抑菌滅害力強(qiáng)等特點(diǎn)，又能產(chǎn)生豐富的代謝生成物，如多種有機(jī)酸、消化酶等，可抑制有害菌、病原菌等有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，并能夠有效地減少水中氨氮和亞硝酸鹽的含量，進(jìn)而改善水質(zhì)、改善養(yǎng)殖水體微環(huán)境。

本發(fā)明將芽孢桿菌與低溫乳桿菌混合制備的微生態(tài)制劑，能起到功能性協(xié)同作用，從生態(tài)學(xué)的角度，利用微生物降低養(yǎng)殖水體氨氮含量，具有天然、無毒、無副作用、無污染、無殘留、安全可靠的優(yōu)越性；且利用有益微生物改善水質(zhì)，抑制病原菌，減少疾病，能夠有效的促進(jìn)半滑舌鰨的生長(zhǎng)，提高其幼苗的存活率。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所得微生態(tài)制劑可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料直接投入養(yǎng)殖水體中，其具有良好改善養(yǎng)殖水體微環(huán)境的作用，可以降低養(yǎng)殖水體氨氮含量，氨氮清除率可達(dá)65%，亞硝酸鹽的去除率可達(dá)75%，并能促進(jìn)水產(chǎn)生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，顯著提高半滑舌鰨的增重率以及幼苗的存活率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明微生態(tài)制劑在不同時(shí)間下對(duì)養(yǎng)殖水體的氨氮清除率變化曲線。

圖2為本發(fā)明微生態(tài)制劑在不同時(shí)間下對(duì)養(yǎng)殖水體的亞硝酸鹽清除率變化曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實(shí)施例1

一種用于半滑舌鰨養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑，其制備方法包括以下步驟：

1）芽孢桿菌和低溫乳桿菌的培養(yǎng)：將芽孢桿菌和乳桿菌菌種從試管斜面培養(yǎng)基中取出，分別接種到裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后置于搖床中，于20℃、150r/min條件下培養(yǎng)24h；

2）將步驟1）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌菌液及乳桿菌菌液分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時(shí)間為72h；

3）將步驟2）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌發(fā)酵液和乳桿菌發(fā)酵液分別于10000r/min離心20min，以分離菌體與上清液；將所得菌體共同加入到含低聚木糖和β-葡聚糖的水溶液中混勻，再加入海藻糖，攪拌均勻制得懸浮液，最后加入脫脂乳作為基質(zhì)，經(jīng)真空冷凍干燥制得所述微生態(tài)制劑。

步驟1）中芽孢桿菌所用的液體培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含蛋白胨5g、酵母粉1g；ph值7.6，使用前于121℃滅菌20min；乳桿菌所用液體培養(yǎng)基為mrs培養(yǎng)基，使用前于121℃滅菌20min。

步驟2）中乳桿菌菌液及乳桿菌菌液的接種量均為2vol%，兩者所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、酵母膏3g、kh2po41.5g、khpo42g、mgso40.1g、zncl21g；ph值7.6，使用前于121℃滅菌15min。

步驟3）混合液中低聚木糖和β-葡聚糖的濃度均為2.0g/l，海藻糖的濃度為5wt%，脫脂乳的濃度為20wt%。

實(shí)施例2

一種用于半滑舌鰨養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑，其制備方法包括以下步驟：

1）芽孢桿菌和低溫乳桿菌的培養(yǎng)：將芽孢桿菌和乳桿菌菌種從試管斜面培養(yǎng)基中取出，分別接種到裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后置于搖床中，于20℃、200r/min條件下培養(yǎng)24h；

2）將步驟1）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌菌液及乳桿菌菌液分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時(shí)間為60h；

3）將步驟2）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌發(fā)酵液和乳桿菌發(fā)酵液分別于10000r/min離心20min，以分離菌體與上清液；將所得菌體共同加入到含低聚木糖和β-葡聚糖的水溶液中混勻，再加入海藻糖，攪拌均勻制得懸浮液，最后加入脫脂乳作為基質(zhì)，經(jīng)真空冷凍干燥制得所述微生態(tài)制劑。

步驟1）中芽孢桿菌所用的液體培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含蛋白胨6g、酵母粉2g；ph值7.4，使用前于121℃滅菌18min；乳桿菌所用液體培養(yǎng)基為mrs培養(yǎng)基，使用前于121℃滅菌18min。

步驟2）中乳桿菌菌液及乳桿菌菌液的接種量均為2vol%，兩者所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含可溶性淀粉3.2g、蛋白胨11g、酵母膏4g、kh2po42.5g、khpo43g、mgso40.6g、zncl22g；ph值7.5，使用前于121℃滅菌18min。

步驟3）混合液中低聚木糖和β-葡聚糖的濃度均為2.0g/l，海藻糖的濃度為5wt%，脫脂乳的濃度為20wt%。

實(shí)施例3

一種用于半滑舌鰨養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑，其制備方法包括以下步驟：

1）芽孢桿菌和低溫乳桿菌的培養(yǎng)：將芽孢桿菌和乳桿菌菌種從試管斜面培養(yǎng)基中取出，分別接種到裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后置于搖床中，于20℃、150-250r/min條件下培養(yǎng)24h；

2）將步驟1）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌菌液及乳桿菌菌液分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時(shí)間為48h；

3）將步驟2）處于對(duì)數(shù)期的芽孢桿菌發(fā)酵液和乳桿菌發(fā)酵液分別于10000r/min離心20min，以分離菌體與上清液；將所得菌體共同加入到含低聚木糖和β-葡聚糖的水溶液中混勻，再加入海藻糖，攪拌均勻制得懸浮液，最后加入脫脂乳作為基質(zhì)，經(jīng)真空冷凍干燥制得所述微生態(tài)制劑。

步驟1）中芽孢桿菌所用的液體培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含蛋白胨8g、酵母粉3g；ph值7.8，使用前于121℃滅菌20min；乳桿菌所用液體培養(yǎng)基為mrs培養(yǎng)基，使用前于121℃滅菌20min。

步驟2）中乳桿菌菌液及乳桿菌菌液的接種量均為2vol%，兩者所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：每1000ml蒸餾水中含可溶性淀粉3.5g、蛋白胨12g、酵母膏5g、kh2po44g、khpo44g、mgso41g、zncl23g；ph值7.6，使用前于121℃滅菌20min。

步驟3）混合液中低聚木糖和β-葡聚糖的濃度均為2.0g/l，海藻糖的濃度為5wt%，脫脂乳的濃度為20wt%。

性能測(cè)試

測(cè)試1：微生態(tài)制劑去除氨氮試驗(yàn)

氨氮的測(cè)定：在亞硝基鐵氰化鈉存在下，銨離子能與水楊酸鹽和次氯酸離子反應(yīng)生成藍(lán)色化合物。顏色越深說明含量越高，于波長(zhǎng)697nm處測(cè)量吸光值可以進(jìn)行定量分析。

圖1為本發(fā)明微生態(tài)制劑在不同時(shí)間下對(duì)養(yǎng)殖水體的氨氮清除率變化曲線。從圖1中可見，所得微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮的清除率最高可達(dá)65%。

測(cè)試2：微生態(tài)制劑去除亞硝酸鹽試驗(yàn)

亞硝酸鹽氮的測(cè)定：亞硝酸鹽是氮循環(huán)的中間產(chǎn)物，不穩(wěn)定。根據(jù)水環(huán)境條件，可被氧化成亞硝酸鹽，也可被還原成氨。在磷酸介質(zhì)中，ph值為1.8±0.3時(shí)，亞硝酸鹽與對(duì)-氨基苯磺酰胺反應(yīng)生成重氮鹽，再與n-（1-萘基）-乙二胺偶聯(lián)生成紅色染料。在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

圖2為本發(fā)明微生態(tài)制劑在不同時(shí)間下對(duì)養(yǎng)殖水體的亞硝酸鹽清除率變化曲線。從圖2中可見，所得微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的清除率最高達(dá)75%。

測(cè)試3：微生態(tài)制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)

將實(shí)施例1所得微生態(tài)制劑在常溫下避光條件下保存0個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月后，分別取樣檢測(cè)制劑中的芽孢桿菌及低溫乳桿菌的含量，結(jié)果見表1。

表1穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表1可見，本發(fā)明微生態(tài)制劑在常溫環(huán)境中具有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性。

測(cè)試4：對(duì)半滑舌鰨幼苗存活率的影響

將半滑舌鰨幼苗分為兩組，每組100尾，試驗(yàn)組添加本發(fā)明實(shí)施例1制得的微生態(tài)制劑進(jìn)行喂養(yǎng)，對(duì)照組僅采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其結(jié)果見表2。

表2微生態(tài)制劑對(duì)幼苗存活率的試驗(yàn)

由表2可見，本發(fā)明微生態(tài)制劑可有效地提高半滑舌鰨幼苗的存活率。

測(cè)試5：對(duì)半滑舌鰨生長(zhǎng)增重的影響

將半滑舌鰨分為兩組，每組40尾，試驗(yàn)組a添加本發(fā)明實(shí)施例1制得的微生態(tài)制劑，添加量為飼料量的1wt%，對(duì)照組b僅采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)；每組做3個(gè)平行，分別記為1、2、3，共6組，240尾。飼養(yǎng)8周后，空腹24h進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算半滑舌鰨的增重率，其計(jì)算方法如下：

，

其中w1、w2分別為半滑舌鰨初重和末重。所得結(jié)果如表3所示。

表3微生態(tài)制劑對(duì)半滑舌鰨增重率的影響試驗(yàn)

由表3可見，試驗(yàn)組a的平均增重率為67.62%，明顯高于對(duì)照組b的平均增重率（55.19%）。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，與常規(guī)飼料喂養(yǎng)相比，采用本發(fā)明微生態(tài)制劑對(duì)半滑舌鰨的養(yǎng)殖顯示出較好的效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。