本發(fā)明屬于飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于動(dòng)物飼料的富鐵酵母產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

鐵是動(dòng)物機(jī)體所必需的微量元素，它參與多種細(xì)胞酶的構(gòu)成，是合成血紅蛋白、肌紅蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)成分和氧的重要物質(zhì)，對機(jī)體的免疫機(jī)能也起到一定的促進(jìn)作用。豬機(jī)體中的鐵主要有三個(gè)生理功能：生理防御、預(yù)防機(jī)體感染疾??；參與體內(nèi)物質(zhì)代謝；參與載體的組成、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存營養(yǎng)。豬補(bǔ)鐵還可促進(jìn)仔豬長，改善仔豬皮毛光亮度。目前動(dòng)物飼養(yǎng)補(bǔ)充鐵的主要途徑是在飼料中額外添加所需的鐵，大部分以無機(jī)鐵為主。無機(jī)鐵吸收利用率較低，在飼料中添加過量的鐵，不僅增加了生產(chǎn)成本而且還會(huì)增加糞便中鐵的沉積，給生態(tài)環(huán)境造成環(huán)境污染。在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，鐵等微量元素的排放已逐漸成為困擾農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的亟待解決的問題之一。

目前，國內(nèi)大多采用高劑量硫酸亞鐵、三氧化鐵等無機(jī)鐵作為鐵營養(yǎng)添加劑，但無機(jī)鐵生物效價(jià)低、添加量大、易造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染；而穩(wěn)定性好、生物學(xué)效價(jià)較高的有機(jī)鐵(如氨基酸螯合鐵、蘇氨酸螯合鐵等)由于其生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格較高限制其應(yīng)用。而富鐵酵母不僅可以滿足動(dòng)物機(jī)體對于鐵的需要，而且酵母中有很豐富的營養(yǎng)成分，可以發(fā)揮協(xié)同作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種富鐵酵母產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法，為動(dòng)物提供安全、高效的補(bǔ)鐵劑。

為達(dá)到上述目的，發(fā)明人必需解決兩個(gè)關(guān)鍵性的問題，一是制備耐高鐵的酵母菌種；二是高鐵含量富鐵酵母的生產(chǎn)工藝。

本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品的生產(chǎn)方法包括如下步驟：

1)制備耐高鐵的酵母菌種

1.1)啤酒酵母菌種接種到含鐵的麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出抗鐵能力強(qiáng)的菌種，作為誘變菌種；

1.2)將抗鐵能力強(qiáng)的酵母菌種接種到誘變培養(yǎng)基上進(jìn)行誘變培養(yǎng)20～45h；

1.3)將誘變后的菌株進(jìn)行分離篩選，接種到含鐵的麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出抗鐵能力強(qiáng)的菌種，即為耐高鐵富鐵酵母菌種；

2)高鐵含量富鐵酵母的生產(chǎn)工藝

2.1)斜面菌種培養(yǎng)：耐高鐵富鐵酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鐵量30～1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h，得到斜面酵母菌種；

2.2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種稀釋至菌株數(shù)496萬/ml，取2ml稀釋液接種于裝有250ml糖含量5～20％，含鐵量30～1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h，得到一級液體種子培養(yǎng)液；

2.3)二級液體種子培養(yǎng)：將100ml一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鐵量30～1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h，得到二級液體種子培養(yǎng)液；

2.4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1000ml二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鐵量30～1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h，得到富鐵酵母培養(yǎng)液；

2.5)分離干燥：分離機(jī)分離，60～90℃烘干；

2.6)粉碎：粉碎機(jī)粉碎后既得到富鐵酵母產(chǎn)品，鐵含量為每千克酵母1000～6000毫克。

所述的步驟1.1)和步驟1.3)中的含鐵的麥芽糖培養(yǎng)基的總糖含量5～20％，含鐵量30～1000μg/ml，ph值4.0～7.0，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

所述的步驟1.3)中的含鐵的麥芽糖培養(yǎng)基的含鐵量高于步驟1.1)中的含鐵的麥芽糖培養(yǎng)基。

所述的步驟1.2)中的誘變培養(yǎng)基中的誘變劑為n-甲基-n-硝基-n-亞硝基胍，濃度1.8～3.2mg/ml，總糖含量5～20％，ph值4.0～7.0。

所述含鐵的麥芽糖培養(yǎng)基所含鐵為無機(jī)鐵，所述的無機(jī)鐵包括氧化鐵、硫酸亞鐵；所述麥芽糖培養(yǎng)基和誘變培養(yǎng)基的氮源為尿素、硝酸銨、硫酸銨和磷酸氫氨中的一種或幾種；所述麥芽糖培養(yǎng)基和誘變培養(yǎng)基的磷源為植酸鈣、磷酸氫氨、磷酸氫二氨、磷酸氫二鉀中的一種或幾種。

所述的篩選出抗鐵能力強(qiáng)的菌種的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)手段，可以采用如下方法：分別配置不同鐵濃度的的麥芽糖培養(yǎng)基，將啤酒酵母菌種或誘變后的菌種分別接種到不同鐵濃度的的麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)后選定菌種部分存活的含鐵溶度最高的麥芽糖培養(yǎng)基；該麥芽糖培養(yǎng)基中存活菌種作為抗鐵能力強(qiáng)的酵母菌種，作為誘變菌種。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1)依據(jù)不同生化特性的酵母菌種接種到不同鐵濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出抗鐵能力強(qiáng)的酵母菌種，作為誘變菌種。

2)將抗鐵能力強(qiáng)的酵母菌種接種到不同劑量的亞硝基的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘變；

3)將誘變的菌株進(jìn)行分離篩選，接種到不同鐵濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出生物量較高和抗鐵能力強(qiáng)的菌種，即為耐高鐵富鐵酵母菌種；

4)篩選培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

麥芽糖培養(yǎng)基，總糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量30～1000μg/ml，ph值4.0～7.0，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

實(shí)施例2

富鐵酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鐵酵母產(chǎn)品。

1)斜面菌種培養(yǎng)：富鐵酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量30μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個(gè)裝有250ml糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量30μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量30μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量30μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鐵分批次加入，培養(yǎng)25～50h。

5)分離干燥：分離機(jī)分離，60～90℃烘干。

6)粉碎：粉碎機(jī)粉碎后既得到高鐵含量富鐵酵母，鐵含量為每千克酵母1350毫克。

實(shí)施例3

富鐵酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鐵酵母產(chǎn)品。

1)斜面菌種培養(yǎng)：富鐵酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個(gè)裝有250ml糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鐵分批次加入，培養(yǎng)20～45h。

5)分離干燥：分離機(jī)分離，60～90℃烘干。

6)粉碎：粉碎機(jī)粉碎后既得到高鐵含量富鐵酵母，鐵含量為每千克酵母3000毫克。

實(shí)施例4

富鐵酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鐵酵母產(chǎn)品。

1)斜面菌種培養(yǎng)：富鐵酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量100μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個(gè)裝有250ml糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量100μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量100μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量100μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鐵分批次加入，培養(yǎng)25～50h。

5)分離干燥：分離機(jī)分離，60～90℃烘干。

6)粉碎：粉碎機(jī)粉碎后既得到高鐵含量富鐵酵母，鐵含量為每千克酵母2000毫克。

實(shí)施例5

富鐵酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鐵酵母產(chǎn)品。

1)斜面菌種培養(yǎng)：富鐵酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個(gè)裝有250ml糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)25～50h。

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鐵(無機(jī)鐵)量1000μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鐵分批次加入，培養(yǎng)25～50h。

5)分離干燥：分離機(jī)分離，60～90℃烘干。

6)粉碎：粉碎機(jī)粉碎后既得到高鐵含量富鐵酵母，鐵含量為每千克酵母5000毫克。

實(shí)施例6

1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物：選取體重約20kg的“杜×長×大”三元雜交豬120頭，按照遺傳背景相同、體重相近、窩別相同的原則隨機(jī)分為3組，每組4重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭。

2試驗(yàn)材料

2.1富鐵酵母產(chǎn)品

由實(shí)施例5方法制備富鐵酵母產(chǎn)品，鐵含量為5000mg/kg。

2.2試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)組日糧按照本發(fā)明配方進(jìn)行配制，其飼料配方具體為：玉米51.40％；大麥6％；小麥6％；膨化大豆6.75％；脫皮豆粕19.10％；次粉5％；棉粕5％；豆油0.50％；食鹽0.25％；所述的預(yù)混料中還包含維生素類和微量元素，其中每千克日糧中鐵元素的添加劑量分別為：100mg/kg。試驗(yàn)組日糧中鐵元素的添加形式為酵母鐵，而對照組日糧中鐵元素的添加形式為硫酸亞鐵。

3試驗(yàn)方法

3.1動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)

選取體重約20kg的“杜×長×大”三元雜交豬120頭，隨機(jī)分為2組，每組4重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭。對照組飼喂常規(guī)日糧，試驗(yàn)組按本配方配制日糧飼喂。試驗(yàn)按照豬的生長階段分為前期(20～35kg)、中期(35～70kg)和后期(70～110kg)3個(gè)階段。

在實(shí)驗(yàn)開始、第26天(20～35kg)、第72天(35～70kg)及實(shí)驗(yàn)結(jié)束(70～110kg)前1天20:00斷料供水，次日08:00以重復(fù)為單位對所有試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱體重，結(jié)算相應(yīng)試驗(yàn)期的耗料情況，計(jì)算平均日增重(adg)、日采食量(adfi)和飼料利用率(f/g)。

試驗(yàn)期內(nèi)提供適宜的溫度濕度，地面飼養(yǎng)，通風(fēng)，自由采食，飲水。免疫消毒程序按照豬場常規(guī)方法進(jìn)行。

3.2屠宰試驗(yàn)

3.2.1組織中鐵元素含量

屠宰后，取左肝內(nèi)葉、左腎皮質(zhì)、左心室心肌、左側(cè)脾臟及背最長肌同一位置各約60g分裝于樣品袋中，-80℃保存。測定時(shí)準(zhǔn)確稱取0.5g左右組織樣品，置于聚四氟乙烯消化罐中，加入5ml硝酸和2mlh202，于微波消解儀中消解，消解結(jié)束后趕酸冷卻，用超純水定容至50ml，同時(shí)做試劑空白測定。

3.2.2鐵元素利用率

從試驗(yàn)開始，每隔10天，以重復(fù)為單位，均勻收集糞便，將其烘干(65℃)、回潮、制成風(fēng)干樣。同時(shí)對飼料進(jìn)行取樣，所采集的飼料和糞便都需粉碎、過孔徑40目篩(0.45mm)，密封保存。用agilienticp-ms7500a電感耦合等離子體光譜儀測定礦物元素含量。

3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析onewayanova進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用duncan氏法經(jīng)行多重比較，以p<0.05作為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

4結(jié)果與分析

4.1本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能的影響

本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能的影響如表1和2所示，對照組與試驗(yàn)組動(dòng)物的體重、料重比等指標(biāo)均無顯著差異(p>0.05)，但日采食量提高了5.44％，日增重提高了6.94％，差異顯著(p<0.05)。說明本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品可以提高育肥豬日采食量，降低日增重，從而提高生長育肥豬生長性能。

表1本發(fā)明富鐵酵母對生長肥育豬體重的影響(n＝4)(kg)

表2本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能的影響(n＝4)

4.2本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬組織鐵元素沉積的影響

本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬血清、組織中鐵元素含量的影響如表3所示，血清及組織中鐵元素含量基本趨于一致，其中試驗(yàn)組組織中鐵元素含量略高于對照組，但兩者無顯著差異(p>0.05)。

表3本發(fā)明配方對生長肥育豬血清、組織鐵元素含量的影響(n＝3)

4.3本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬糞便中鐵元素排泄的影響

本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬鐵元素排泄的影響如表4所示。各階段鐵元素排泄量組間差異顯著(p<0.05)，試驗(yàn)組鐵元素排泄量顯著低于對照組。以20～35kg階段鐵的排泄量為例，試驗(yàn)組和對照組組組間差異顯著(p<0.05)，試驗(yàn)組比對照組分別降低了34.63％。這說明本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品可顯著降低了生長肥育豬的糞便中鐵元素的排泄量。

表4本發(fā)明富鐵酵母對生長肥育豬鐵元素排泄的影響(n＝4)

5.結(jié)論

本發(fā)明富鐵酵母產(chǎn)品對生長肥育豬組織中鐵元素沉積沒有影響，且可以提高生長肥育豬生長性能并顯著降低其糞便中鐵元素排泄量，從而證明富鐵酵母產(chǎn)品對于豬只健康生長及保護(hù)環(huán)境的有效性。