本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年6月21日和發(fā)明名稱為“用于抑制載脂蛋白c-iii(apoc3)基因表達(dá)的組合物與方法”的201280030796.4號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2011年6月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/499,620的權(quán)益，將其通過(guò)引用以其全文特此結(jié)合。

序列表的引用

本申請(qǐng)包括一個(gè)序列表，其大小為x00,000字節(jié)，在201x年某月xx日創(chuàng)建，以文件名“11111us_序列表.txt”電子提交。該序列表通過(guò)引用結(jié)合。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶向apoc3基因的雙鏈核糖核酸(dsrna)、以及使用該dsrna抑制apoc3表達(dá)的方法。

發(fā)明背景

在美國(guó)，30％的成人具有升高的>150mg/dl的甘油三酯(tg)。具有嚴(yán)重的高甘油三酯血癥(tg>500mg/dl)的成人的患病率是1.7％。目前的治療包括生活方式改變(飲食、鍛煉以及戒煙)、處方級(jí)別的魚油、貝特以及煙酸。

apoc3是一種分泌型肝蛋白，顯示可以抑制將tg水解為游離脂肪酸的脂蛋白脂酶；抑制apoe介導(dǎo)的通過(guò)ldlr和lrp以及受體不依賴性內(nèi)吞作用對(duì)富含tg脂蛋白的肝攝?。徊⑶掖龠M(jìn)肝vldl分泌。人類apoc3基因中的至少一個(gè)突變已經(jīng)與有利的脂類譜相關(guān)聯(lián)。(pollinti(珀林ti)等人，2008)人類apoc3中的無(wú)效突變賦予一個(gè)有利的血漿脂類譜以及明顯的心臟保護(hù)，science(《科學(xué)》)322(5908):1702-5)。

雙鏈rna分子(dsrna)已經(jīng)顯示出以一種高度保守的調(diào)節(jié)機(jī)制(稱為rna干擾(rnai))來(lái)阻斷基因表達(dá)。wo99/32619(fire(菲爾)等人)披露了至少25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的dsrna抑制秀麗線蟲(c.elegans)中的基因表達(dá)的用途。dsrna還顯示出在其他有機(jī)體中降解靶標(biāo)rna，包括植物(參見(jiàn)，例如wo99/53050，waterhouse(沃特豪斯)等人；以及wo99/61631，heifetz(黑菲茲)等人)、果蠅(參見(jiàn)，例如yang,d.(楊d)等人，curr.biol.(《生物學(xué)近況》)(2000)10:1191-1200)以及哺乳動(dòng)物(參見(jiàn)，例如wo00/44895，limmer(李默)；以及de10100586.5，kreutzer(克熱特則)等人)。

發(fā)明概述

在此披露了一種用于抑制apoc3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsrna)，其中該dsrna包括一個(gè)正義鏈與一個(gè)反義鏈，該正義鏈與反義鏈每一者在長(zhǎng)度上為30個(gè)或更少的核苷酸，其中該反義鏈包括在表1、2、6、7或10中的一個(gè)反義序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該dsrna包括一個(gè)由核苷酸序列seqidno:70組成的正義鏈以及一個(gè)由核苷酸序列seqidno:151(ad-45149.1um)組成的反義鏈。在另一個(gè)實(shí)施例中，該正義鏈序列選自表1、2、6、7或10，并且該反義鏈選自表1、2、6、7或10。

在一些實(shí)施例中，該dsrna的至少一個(gè)核苷酸是一種經(jīng)修飾的核苷酸，例如，至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：2'-o-甲基修飾的核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸、以及連接至膽甾醇基衍生物或正十二烷酸雙癸酰胺基團(tuán)的末端核苷酸、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷酸、2'-脫氧修飾的核苷酸、鎖定的核苷酸、脫堿基核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包括非天然堿基的核苷酸。

在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)鏈包括具有至少1個(gè)核苷酸的3’突出或每一鏈包括具有至少2個(gè)核苷酸的3’突出。

本發(fā)明的任何dsrna可以進(jìn)一步包括一種配體，例如一種軛合至該dsrna的正義鏈的3’末端的配體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的dsrna進(jìn)一步包括至少一個(gè)n-乙酰基-半乳糖胺。

另外，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明的任何dsrna的細(xì)胞；一種編碼本發(fā)明的任何dsrna的至少一個(gè)鏈的載體以及一種包括該載體的細(xì)胞。

本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的任何dsrna的、用于抑制apoc3基因的表達(dá)的藥物組合物。該藥物組合物可以包括一種脂類制劑，例如，一種包括mc3的脂類制劑。

本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種用于抑制細(xì)胞中apoc3表達(dá)的方法，該方法包括：(a)使該細(xì)胞與本發(fā)明的apoc3dsrna進(jìn)行接觸并且(b)維持步驟(a)中產(chǎn)生的細(xì)胞一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得apoc3基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的降解，由此抑制該細(xì)胞中的該apoc3基因的表達(dá)。在一些實(shí)施例中，apoc3表達(dá)被抑制至少30％。

本發(fā)明的一個(gè)另外的方面是一種治療由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的apoc3dsrna或本發(fā)明的藥物組合物給予需要這種治療的人類。該病癥可以是例如升高的甘油三酯水平，例如，甘油三酯水平>150mg/dl或>500mg/dl。在一些實(shí)施例中，給藥引起脂蛋白脂酶和/或肝脂酶活性的增加。將該dsrna或該藥物組合物以大約0.01mg/kg至大約10mg/kg或大約0.5mg/kg至大約50mg/kg的劑量給予。

附圖說(shuō)明

圖1是一個(gè)顯示在用靶向apoc3的sirna(“sirna#1”以及“sirna#2”)進(jìn)行治療之后對(duì)小鼠中的靶標(biāo)mrna、甘油三酯(tg)以及總膽固醇水平的影響的圖。

圖2顯示了galnac的結(jié)構(gòu)。

圖3顯示了在3’末端經(jīng)由磷酸酯鍵軛合至chol-p-(galnac)3的sirna的結(jié)構(gòu)。

圖4顯示了軛合至lco(galnac)3的sirna的結(jié)構(gòu)(一種(galnac)3-3’-石膽酸-油?；鵶irna軛合物)。

發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明

本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)在以下說(shuō)明中闡述。本發(fā)明的其他特征、目的以及優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)以下說(shuō)明、附圖以及權(quán)利要求書而清楚。

本發(fā)明提供了dsrna、以及使用這些dsrna來(lái)抑制其中該dsrna靶向apoc3基因的細(xì)胞中或哺乳動(dòng)物中的apoc3基因的表達(dá)的方法。本發(fā)明還提供了用于治療哺乳動(dòng)物中由apoc3基因表達(dá)引起的病理學(xué)病狀以及疾病的組合物以及方法。apoc3dsrna引導(dǎo)apoc3mrna的序列特異性降解。

定義

為方便起見(jiàn)，在本說(shuō)明書、實(shí)例以及所附權(quán)利要求書中使用的某些術(shù)語(yǔ)與短語(yǔ)的意義提供于下。如果在本說(shuō)明書中的其他部分中的術(shù)語(yǔ)使用與在本部分提供的該術(shù)語(yǔ)的定義有明顯偏差，應(yīng)該以在本部分中的定義為準(zhǔn)。

“g”、“c”、“a”以及“u”每一者通常分別代表包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶作為堿基的核苷酸?！皌”以及“dt”在此可互換地使用并且指其中核堿基是胸腺嘧啶的脫氧核糖核苷酸，例如脫氧核糖胸腺嘧啶。然而，應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脫氧核糖核苷酸”還可以指一種經(jīng)修飾的核苷酸(如以下進(jìn)一步詳述)或一種替代性的置換部分。技術(shù)人員應(yīng)很好地意識(shí)到，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置換而基本上不改變一種寡核苷酸(包括一種具有這種置換部分的核苷酸)的堿基配對(duì)特性。例如，非限制性地，包括肌苷作為其堿基的核苷酸可以與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)。因此，包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本發(fā)明的核苷酸序列中被一種包含例如肌苷的核苷酸所置換。包含此類置換部分的序列是本發(fā)明的實(shí)施例。

“apoc3”指載脂蛋白c-iii基因。根據(jù)ncbinlm網(wǎng)站，載脂蛋白c-iii是一種極低密度脂蛋白(vldl)。apoc3抑制脂蛋白脂酶以及肝脂酶；認(rèn)為它可以延遲富含甘油三酯的顆粒的分解代謝。在大鼠以及人類基因組中，apoa1、apoc3以及apoa4基因緊密相連。a-i與a-iv基因轉(zhuǎn)錄自相同鏈，而a-1與c-iii基因是趨同轉(zhuǎn)錄的。apoc-iii水平的增加引起高甘油三酯血癥的發(fā)展。人類apoc3mrna序列是genbank登錄號(hào)nm_000040.1，在此包括為seqidno:1。食蟹猴(cynomolgusmonkey)(食蟹獼猴(macacafascicularis))angptl3mrna序列是genbank登錄號(hào)x68359.1。

如在此所使用的，“靶標(biāo)序列”指的是在apoc3基因的轉(zhuǎn)錄期間形成的mrna分子的核苷酸序列的連續(xù)部分，包括為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的rna加工產(chǎn)物的mrna。

如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“含有序列的鏈”指的是含有由相當(dāng)于使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法描述的序列的核苷酸鏈的寡核苷酸。

如在此所使用的，除非另有陳述，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”當(dāng)用于相對(duì)于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時(shí)，指的是含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。

例如，當(dāng)在嚴(yán)格雜交條件下一個(gè)第一核苷酸序列與一個(gè)第二核苷酸序列雜交(例如退火)時(shí)，可以描述為這兩序列互補(bǔ)。雜交條件包括用于退火和/或洗滌步驟的溫度、離子強(qiáng)度、ph以及有機(jī)溶劑濃度。術(shù)語(yǔ)嚴(yán)格雜交條件指以下的條件：在此條件下，一個(gè)第一核苷酸序列將優(yōu)先與其靶標(biāo)序列(例如一個(gè)第二核苷酸序列)雜交，并且以較低程度與其他序列雜交或根本不與其雜交。嚴(yán)格雜交條件是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。通常，嚴(yán)格雜交條件在一個(gè)定義的離子強(qiáng)度和ph下被選擇為低于該核苷酸序列的熱熔點(diǎn)(tm)大約5℃，。tm是這些第一核苷酸序列的50％雜交至一種完全匹配的靶標(biāo)序列的溫度(在一個(gè)定義的離子強(qiáng)度和ph下)。對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)于例如tijssen(提基森)(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology--hybridizationwithnucleicacidprobesparti,chap.2(生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)——核酸探針雜交第i部分，第2章)，“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays(雜交原則和核酸探針?lè)治霾呗跃C述)”，elsevier,n.y.(愛(ài)思唯爾出版公司，紐約)(“tijssen(提基森)”)。

可以應(yīng)用其他條件，比如可以在有機(jī)體中遇到的生理學(xué)相關(guān)條件。技術(shù)人員將能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用來(lái)確定兩序列互補(bǔ)測(cè)試的最適條件集。

這包括：包括該第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包括該第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在該第一以及第二核苷酸序列全長(zhǎng)上的堿基配對(duì)。此類序列在此可以稱作相對(duì)于彼此“完全互補(bǔ)”。然而，在此在一個(gè)第一序列被稱作相對(duì)于一個(gè)第二序列“基本上互補(bǔ)”的情況下，這兩序列可以是完全互補(bǔ)的，或者它們可以在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)，但是總體上不多于4個(gè)、3個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配堿基配對(duì)，同時(shí)保留了在與它們的最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下雜交的能力。然而，在兩寡核苷酸被設(shè)計(jì)為在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)單鏈突出的情況下，此類突出不應(yīng)該被認(rèn)為是關(guān)于互補(bǔ)性確定的錯(cuò)配。例如，出于在此描述的目的，以下這樣一種dsrna也可以稱作“完全互補(bǔ)”：該dsrna包括一個(gè)長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的寡核苷酸以及一個(gè)長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中該更長(zhǎng)的寡核苷酸包括一個(gè)與該更短的寡核苷酸完全互補(bǔ)的21核苷酸序列。

如在此使用的，就滿足以上相對(duì)于它們雜交的能力而言的要求來(lái)說(shuō)，“互補(bǔ)”序列還可以包括或完全形成自非沃森-克里克堿基對(duì)和/或從非天然的以及經(jīng)修飾的核苷酸形成的堿基對(duì)。此類非沃森-克里克堿基對(duì)包括但不限于g:u搖擺堿基配對(duì)或hoogstein堿基配對(duì)。

本文的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”、“完全互補(bǔ)”和“基本上互補(bǔ)”可相對(duì)于在dsrna的正義鏈與反義鏈之間，或dsrna的反義鏈與靶標(biāo)序列之間的堿基配對(duì)使用，如將從其使用的上下文理解。

如在此使用的，與信使rna(mrna)的“至少部分基本上互補(bǔ)”的多核苷酸指與感興趣的mrna(例如，編碼apoc3的mrna)的一個(gè)連續(xù)部分(包括5’utr，開(kāi)放閱讀框(orf)或者3’utr)基本互補(bǔ)的多核苷酸。例如，如果一個(gè)多核苷酸與編碼apoc3的mrna的一個(gè)非間斷部分基本上互補(bǔ)，那么該序列則與apoc3mrna的至少一部分互補(bǔ)。

在一個(gè)實(shí)施例中，該dsrna的反義鏈與一個(gè)靶標(biāo)mrna足夠地互補(bǔ)以引起該靶標(biāo)mrna的切割。

如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“雙鏈rna”或“dsrna”指的是核糖核酸分子的復(fù)合體，其具有雙鏈結(jié)構(gòu)，包括兩條反向平行的、基本上互補(bǔ)的、如以上所定義的核酸鏈?？傮w上，每一鏈的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此詳述的，兩條鏈的每一者或兩者還可以包括至少一個(gè)非核糖核苷酸，例如，一種脫氧核糖核苷酸和/或一種經(jīng)修飾的核苷酸。另外，如在本說(shuō)明書中所使用的，“dsrna”可以包括對(duì)核糖核苷酸的化學(xué)修飾，這包括在多個(gè)核苷酸處的大量修飾并且包括在此披露的或本領(lǐng)域內(nèi)已知的所有類型的修飾。如在sirna類型的分子中所使用的任何此類修飾被“dsrna”所囊括用于本說(shuō)明書以及權(quán)利要求書的目的。

形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是一個(gè)更大rna分子的不同部分，或者它們可以是單獨(dú)的rna分子。在這兩條鏈?zhǔn)且粋€(gè)更大分子的部分并且因此通過(guò)一條鏈的3’-末端與形成該雙鏈結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)另一條鏈的5’-末端之間的非間斷核苷酸鏈而連接的情況下，該連接的rna鏈稱作“發(fā)夾環(huán)”。在這兩條鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)除了一條鏈的3’-末端與形成該雙鏈結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)另一條鏈的5’-末端之間的非間斷核苷酸鏈以外的方式而共價(jià)連接的情況下，該連接結(jié)構(gòu)稱作“連接物(linker)”。這些rna鏈可以具有相同或不同數(shù)目的核苷酸。堿基對(duì)的最大數(shù)目是該dsrna的最短鏈中的核苷酸數(shù)目減去存在于該雙鏈體中的任何突出。除了雙鏈結(jié)構(gòu)，一個(gè)dsrna可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸突出。術(shù)語(yǔ)“sirna”還可以在此用作指代以上所述的dsrna。

如在此使用的，“核苷酸突出”指：當(dāng)dsrna的一條鏈的3'-末端延伸超過(guò)另一條鏈的5'-末端(或反之亦然)時(shí)，從該dsrna的雙鏈結(jié)構(gòu)突出的未配對(duì)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸?！捌蕉恕被颉捌侥┒恕币馑际窃谠揹srna的那個(gè)末端沒(méi)有非配對(duì)的核苷酸，即，沒(méi)有核苷酸突出。一個(gè)“平端的”dsrna是一個(gè)在其全長(zhǎng)上雙鏈化的dsrna，即，在該分子的任何一端都沒(méi)有核苷酸突出。

術(shù)語(yǔ)“反義鏈”指的是dsrna的鏈，該鏈包括基本上與一個(gè)靶標(biāo)序列互補(bǔ)的區(qū)域。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)性區(qū)域”指的是該反義鏈上基本上與一個(gè)序列互補(bǔ)的區(qū)域，例如如在此定義的一個(gè)靶標(biāo)序列。在該互補(bǔ)性區(qū)域不與該靶標(biāo)序列完全互補(bǔ)的情況下，錯(cuò)配在末端區(qū)域是最為可容忍的，并且如果出現(xiàn)錯(cuò)配，它們通常在末端的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，例如5’和/或3’末端的6、5、4、3、或2個(gè)核苷酸之內(nèi)。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“正義鏈”指的是含有與反義鏈區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域的dsrna鏈。

如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸脂類顆粒”包括術(shù)語(yǔ)“snalp”并且指包覆少量水性內(nèi)部的脂類囊泡，該水性內(nèi)部包括一種核酸，比如dsrna或dsrna從其轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒。核酸脂類顆粒(例如snalp)描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20060240093、20070135372以及2008年4月15日提交的ussn61/045,228中。這些申請(qǐng)通過(guò)引用特此結(jié)合。

當(dāng)提及dsrna時(shí)，“引入細(xì)胞內(nèi)”意思是促進(jìn)攝取或吸收進(jìn)入該細(xì)胞，如本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員所理解的。dsrna的吸收或攝取可以通過(guò)非輔助的擴(kuò)散或積極的細(xì)胞過(guò)程，或通過(guò)輔助劑或儀器而發(fā)生。本術(shù)語(yǔ)的意義不限于體外細(xì)胞；dsrna還可以被“引入細(xì)胞內(nèi)”，其中該細(xì)胞是活有機(jī)體的部分。在這樣的例子中，引入該細(xì)胞內(nèi)將包括遞送至該有機(jī)體。例如，對(duì)于體內(nèi)遞送而言，dsrna可以被注射進(jìn)入一個(gè)組織部位或全身性地給予。體外引入細(xì)胞內(nèi)包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，比如電穿孔以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。另外的方法描述于此或在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。

當(dāng)其涉及apoc3基因時(shí)，術(shù)語(yǔ)“沉默”、“抑制表達(dá)”、“下調(diào)表達(dá)”、“壓制表達(dá)”等等在此是指至少部分地壓制apoc3基因的表達(dá)，表示為：可從apoc3基因在其中轉(zhuǎn)錄的一個(gè)第一細(xì)胞或一組第一細(xì)胞(已經(jīng)經(jīng)過(guò)處理由此apoc3基因的表達(dá)被抑制)中分離的mrna的量減少，這是與一個(gè)第二細(xì)胞或一組第二細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)相比，其與該一個(gè)第一細(xì)胞或一組第一細(xì)胞基本上相同，除了未經(jīng)受如此的處理。抑制程度通常如以下表示

可替代地，抑制程度能以與apoc3基因表達(dá)功能性相聯(lián)系的一個(gè)參數(shù)的減少而給出，例如apoc3基因編碼的由細(xì)胞分泌的蛋白的量，或展示某種表型(例如凋亡)的細(xì)胞的數(shù)目。原則上，apoc3基因沉默可以在(組成型地或通過(guò)基因組工程化)表達(dá)該靶標(biāo)的任何細(xì)胞中通過(guò)任何合適的測(cè)定來(lái)確定。然而，當(dāng)需要一個(gè)參考來(lái)確定一個(gè)給定的dsrna是否在一定程度上抑制apoc3基因的表達(dá)并且因此被本發(fā)明所囊括時(shí)，在以下實(shí)例中提供的這些測(cè)定應(yīng)該作為此參考。

例如，在一些例子中，通過(guò)在本發(fā)明中表征的雙鏈寡核苷酸的給予，apoc3基因的表達(dá)被抑制至少大約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些實(shí)例中，通過(guò)在本發(fā)明中表征的雙鏈寡核苷酸的給予，apoc3基因的表達(dá)被抑制至少大約60％、70％或80％。在一些實(shí)例中，通過(guò)在本發(fā)明中表征的雙鏈寡核苷酸的給予，apoc3基因的表達(dá)被抑制至少大約85％、90％或95％。

如在apoc3表達(dá)的背景下在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療(treat)”、“治療(treatment)”以及類似術(shù)語(yǔ)指緩解或減輕由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程。在本發(fā)明的上下文中，在涉及以下在此所引用的任何其他病狀的范圍內(nèi)(除了由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程)，術(shù)語(yǔ)“治療(treat)”、“治療(treatment)”以及等等意思是緩解或減輕至少一個(gè)與此病狀相關(guān)聯(lián)的癥狀，或意思是減緩或逆轉(zhuǎn)這種病狀的進(jìn)程。

如在此所使用的，短語(yǔ)“有效量”指這樣一個(gè)量，該量在治療、預(yù)防或管理由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程或由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程的明顯癥狀中提供一個(gè)治療上的益處。有效的具體量可以容易地由普通醫(yī)療從業(yè)者來(lái)確定，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的因素而變化，比如，例如由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程的類型、患者病史以及年齡、由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程的階段、以及對(duì)抗由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程的試劑的給予。

如在此所使用的，“藥物組合物”包括藥理學(xué)有效量的dsrna以及藥學(xué)上可接受的載體。如在此所使用的，“藥理學(xué)有效量”、“治療有效量”或簡(jiǎn)言之的“有效量”指有效產(chǎn)生預(yù)期的藥理學(xué)、治療或預(yù)防結(jié)果的rna的量。例如，如果當(dāng)一個(gè)與一種疾病或病癥相關(guān)聯(lián)的可測(cè)量的參數(shù)減少至少25％時(shí)，一個(gè)給定的臨床治療才被認(rèn)為是有效的，那么一種用于該疾病或病癥的治療的藥物的治療的有效量是實(shí)現(xiàn)該參數(shù)至少減少25％所需要的一個(gè)量。例如，治療有效量的靶向apoc3的dsrna可以使apoc3血清水平降低至少25％。

術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于一種治療劑的給予的載體。此類載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其組合。該術(shù)語(yǔ)特別地排除細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于口服給予的藥物，藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于藥學(xué)上可接受的賦形劑，比如惰性稀釋劑、崩解劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑以及防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉以及碳酸鈣、磷酸鈉以及磷酸鈣，以及乳糖，而玉米淀粉以及褐藻酸是合適的崩解劑。結(jié)合劑可以包括淀粉以及明膠，而潤(rùn)滑劑(如果存在的話)將通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果希望的話，可以將片劑用一種材料進(jìn)行包衣，比如單硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯，以延遲在胃腸道中的吸收。

如在此所使用的，“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是己引入可表達(dá)dsrna分子的載體的細(xì)胞。

雙鏈核糖核酸(dsrna)

如在此更詳細(xì)地描述，本發(fā)明提供了用于在細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中抑制apoc3基因的表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsrna)分子，其中該dsrna包括一個(gè)具有互補(bǔ)性區(qū)域(該區(qū)域與在apoc3基因表達(dá)中形成的mrna的至少一部分互補(bǔ))的反義鏈，并且其中該互補(bǔ)性區(qū)域的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，通常長(zhǎng)度是19-24個(gè)核苷酸，并且其中所述dsrna在與表達(dá)所述apoc3基因的細(xì)胞相接觸時(shí)抑制所述apoc3基因的表達(dá)至少30％，如通過(guò)例如pcr或基于分支dna(bdna)的方法、或通過(guò)基于蛋白的方法(例如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡(westernblot))所測(cè)定的。當(dāng)通過(guò)如在以下實(shí)例中所描述的測(cè)定進(jìn)行測(cè)量時(shí)，apoc3基因的表達(dá)可以減少至少30％。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)物中(比如在hep3b細(xì)胞中)的apoc3基因的表達(dá)可以通過(guò)測(cè)量apoc3mrna的水平(例如通過(guò)bdna或taqman測(cè)定)、或通過(guò)測(cè)量蛋白水平(比如通過(guò)elisa測(cè)定)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的dsrna可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)單鏈的核苷酸突出。

該dsrna可以通過(guò)如進(jìn)一步在以下所討論的、本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行合成，例如，通過(guò)使用自動(dòng)化的dna合成儀，比如從例如biosearch、appliedbiosystems公司可商購(gòu)的合成儀。該dsrna包括兩個(gè)rna鏈，它們足夠地互補(bǔ)以雜交形成一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)。該dsrna的一條鏈(反義鏈)包括一個(gè)互補(bǔ)性區(qū)域，該區(qū)域與一個(gè)靶標(biāo)序列(衍生自在apoc3基因表達(dá)期間形成的mrna的序列)基本上互補(bǔ)并且通常是完全互補(bǔ)，另一條鏈(正義鏈)包括一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域與該反義鏈互補(bǔ)，這樣使得這兩條鏈當(dāng)在合適的條件下進(jìn)行組合時(shí)雜交并且形成一種雙鏈結(jié)構(gòu)。通常，該雙鏈結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度為在15與30之間或25與30之間，或18與25之間，或19與24之間，或19與21之間，或19、20或21個(gè)堿基對(duì)。在一個(gè)實(shí)施例中，該雙鏈長(zhǎng)度是19個(gè)堿基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施例中，該雙鏈長(zhǎng)度是21個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)兩個(gè)不同的sirna組合使用時(shí)，它們的雙鏈長(zhǎng)度可以是相同的或不同的。

本發(fā)明的dsrna的每一鏈的長(zhǎng)度通常為在15與30之間，或18與25之間，或18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施例中，每一鏈的長(zhǎng)度是25-30個(gè)核苷酸。該雙鏈的每一鏈可以是相同長(zhǎng)度或不同長(zhǎng)度。當(dāng)兩個(gè)不同的sirna組合使用時(shí)，每一sirna的每一鏈的長(zhǎng)度可以是相同的或不同的。

本發(fā)明的dsrna包括長(zhǎng)于21-23個(gè)核苷酸的dsrna，例如，足夠長(zhǎng)以被rnaseiii酶dicer加工成為21-23堿基對(duì)sirna的dsrna，這樣的sirna然后被結(jié)合進(jìn)入risc。因此，本發(fā)明的dsrna的長(zhǎng)度可以是至少25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90個(gè)堿基對(duì)，或至少100個(gè)堿基對(duì)。

本發(fā)明的dsrna可以包括具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的一個(gè)或多個(gè)單鏈突出。在一個(gè)實(shí)施例中，該dsrna的至少一個(gè)末端具有1至4個(gè)核苷酸、通常是1或2個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸突出。在另一個(gè)實(shí)施例中，該dsrna的反義鏈在3’末端以及5’末端都具有超出正義鏈的1-10個(gè)核苷酸的突出。在另一個(gè)實(shí)施例中，該dsrna的正義鏈在3’末端以及5’末端都具有超出反義鏈的1-10個(gè)核苷酸的突出。

具有至少一個(gè)核苷酸的突出的dsrna可以具有出乎預(yù)期的超出平末端相似物的優(yōu)異抑制特性。在一些實(shí)施例中，具有僅一個(gè)核苷酸的突出的存在增強(qiáng)了該dsrna的干擾活性，而不影響其整體穩(wěn)定性。具有僅一個(gè)突出的dsrna在體內(nèi)以及在多種細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基、血液以及血清中尤其顯示出穩(wěn)定性與有效性。通常，單鏈的突出位于反義鏈的3'-終末端，或者可替代地，位于正義鏈的3‘-終末端。該dsrna還可以具有平末端，通常位于反義鏈的5’-末端。此類dsrna可以具有改進(jìn)的穩(wěn)定性以及抑制活性，由此允許以低劑量，即每天低于5mg/kg受體體重來(lái)給予。通常，該dsrna的反義鏈在3’末端具有核苷酸突出，并且5’末端是平端。在另一個(gè)實(shí)施例中，突出中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。

在一個(gè)實(shí)施例中，apoc3基因是人類apoc3基因。在具體實(shí)施例中，該dsrna的正義鏈?zhǔn)蔷哂衼?lái)自表1、2、6、7、11或12的正義序列的一者，并且該反義鏈?zhǔn)蔷哂斜?、2、6、7、11或12的反義序列的一者。在表1、2、6、7、11或12中提供的靶標(biāo)序列中靶向其他地方的可替代的反義試劑可以使用該靶標(biāo)序列以及側(cè)翼apoc3序列來(lái)容易地進(jìn)行確定。

熟練的技術(shù)人員將很好的意識(shí)到，具有20與23之間個(gè)堿基對(duì)(但是特別是21個(gè)堿基對(duì))的雙鏈結(jié)構(gòu)的dsrna被奉為是尤其有效地誘導(dǎo)rna干擾(elbashir(厄爾巴瑟)等人，embo2001,20:6877-6888)。然而，其他人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)更短或更長(zhǎng)的dsrna也可以有效。在以上描述的實(shí)施例中，由于在表1、2、6、7、11或12中提供的寡核苷酸序列的性質(zhì)，在本發(fā)明中表征的dsrna可以包括至少一條具有在此描述的長(zhǎng)度的鏈?？梢院侠淼仡A(yù)期，具有表1、2、6、7、11或12中的序列之一的、在一個(gè)末端或兩個(gè)末端減去僅僅數(shù)個(gè)核苷酸的更短的dsrna與以上描述的dsrna相比可以類似地有效。因此，本發(fā)明考慮了以下這樣的dsrna：它們具有來(lái)自表1、2、6、7、11或12中的序列之一的至少15、16、17、18、19、20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的部分序列，并且與包括完全序列的一個(gè)dsrna相比，它們?cè)谟诖巳缦旅枋龅臏y(cè)定中抑制apoc3基因表達(dá)的能力方面不同，抑制不超過(guò)5％、10％、15％、20％、25％、或30％。此外，在一個(gè)希望的apoc3靶標(biāo)序列之內(nèi)進(jìn)行切割的dsrna可以使用相應(yīng)的apoc3反義序列以及一個(gè)互補(bǔ)正義序列來(lái)容易地進(jìn)行制備。

另外，在表1、2、6、7、11或12中提供的dsrna識(shí)別apoc3中一個(gè)易于經(jīng)受基于rnai切割的位點(diǎn)。按照這樣，本發(fā)明進(jìn)一步表征了在被本發(fā)明的試劑之一所靶向的序列之內(nèi)進(jìn)行靶向的dsrna。如在此所使用的，如果一個(gè)第二dsrna切割與一個(gè)第一dsrna的反義鏈互補(bǔ)的mrna之內(nèi)的任何地方的信息，那么該第二dsrna被描述為在該第一dsrna的序列之內(nèi)進(jìn)行靶向。這樣一個(gè)第二dsrna將通常由以下組成：來(lái)自表1、2、6、7、11或12中提供的序列之一的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸連同來(lái)自與apoc3基因中所選序列相連續(xù)的區(qū)域的另外的核苷酸序列。

可以常規(guī)地通過(guò)凝膠電泳并且如果必要的話聯(lián)合本領(lǐng)域內(nèi)已知的核酸雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)該rna靶標(biāo)的切割。一個(gè)dsrna的靶標(biāo)mrna上的切割位點(diǎn)可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員普遍已知的方法來(lái)確定，例如描述于soutschek(索特克)等人，nature(《自然》)；2004,432卷,173-178頁(yè)中的5’-race方法(出于所有目的通過(guò)引用將其結(jié)合在此)。

本發(fā)明所表征的dsrna可以包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)于靶標(biāo)序列的錯(cuò)配。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所表征的dsrna包含的錯(cuò)配不多于3個(gè)。如果該dsrna的反義鏈包含對(duì)于一個(gè)靶標(biāo)序列的錯(cuò)配，則優(yōu)選地是錯(cuò)配的區(qū)域不位于互補(bǔ)性區(qū)域的中心。如果該dsrna的反義鏈包含對(duì)于該靶標(biāo)序列的錯(cuò)配，則優(yōu)選地是該錯(cuò)配被限于從任一末端起的5個(gè)核苷酸，例如距離互補(bǔ)性區(qū)域的5’或3’末端5、4、3、2或1個(gè)核苷酸處。例如，對(duì)于一個(gè)具有23個(gè)核苷酸的、與一個(gè)apoc3基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的dsrna鏈而言，該dsrna通常在中心13個(gè)核苷酸之內(nèi)不包含任何錯(cuò)配。在本發(fā)明中描述的方法可以用于確定一個(gè)包含對(duì)于靶標(biāo)序列的錯(cuò)配的dsrna是否在抑制apoc3基因的表達(dá)中有效?？紤]具有錯(cuò)配的dsrna在抑制apoc3基因表達(dá)方面的效率是重要的，尤其是如果apoc3基因中的互補(bǔ)性具體區(qū)域已知在群體內(nèi)具有多態(tài)性序列變異。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明是一種單鏈的反義寡核苷酸rnai。反義寡核苷酸是一種單鏈的寡核苷酸，與靶標(biāo)mrna之內(nèi)的一個(gè)序列互補(bǔ)。反義寡核苷酸能以化學(xué)計(jì)量的方式通過(guò)與該mrna堿基配對(duì)并且物理性地阻礙翻譯機(jī)器來(lái)抑制翻譯，參見(jiàn)dias,n.(蒂爾斯,n.)等人，(2002)mol.cancerther.(《分子癌癥治療學(xué)》)1:347-355。反義寡核苷酸還可以通過(guò)結(jié)合至該mrna靶標(biāo)并且促進(jìn)mrna靶標(biāo)經(jīng)由rnase-h的破壞來(lái)抑制靶標(biāo)蛋白表達(dá)。單鏈的反義rna分子可以是大約13至大約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)并且具有與一個(gè)靶標(biāo)序列互補(bǔ)的序列。例如，該單鏈的反義rna分子可以包括以下這樣一個(gè)序列：該序列是來(lái)自表1、2、6、7或10的反義序列之一的至少大約13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。

修飾

在再另一個(gè)實(shí)施例中，該dsrna是經(jīng)化學(xué)修飾的以增強(qiáng)穩(wěn)定性。本發(fā)明所表征的核酸可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)良好建立的方法來(lái)進(jìn)行合成和/或修飾，比如描述于“currentprotocolsinnucleicacidchemistry(當(dāng)前核酸化學(xué)方案)”，beaucage,s.l.(比尤克居,s.l.)(編),johnwiley&sons,inc.(約翰威利父子公司)，紐約，紐約州，美國(guó)中的那些，特此通過(guò)引用將其結(jié)合于此。在本發(fā)明中有用的dsrna化合物的具體實(shí)例包括包含經(jīng)修飾的骨架或非天然核苷間鍵的dsrna。如在本說(shuō)明書中所定義的，具有經(jīng)修飾的骨架的dsrna包括在該骨架中保留了磷原子的那些以及在該骨架中不具有磷原子的那些。出于本說(shuō)明書的目的，并且如有時(shí)在本領(lǐng)域內(nèi)所引用的，在其核苷間骨架中不具有磷原子的經(jīng)修飾的dsrna也可以被認(rèn)為是寡核苷。

經(jīng)修飾的dsrna骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3'-亞烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯，以及具有正常3'-5'鍵、這些鍵的2'-5'連接類似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相鄰對(duì)的核苷單位以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'來(lái)連接的反向極性的那些硼烷磷酸酯。還可以包括不同鹽、混合鹽以及游離酸形式。

傳授以上的含磷鍵的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050，其每一者通過(guò)引用結(jié)合于此

其中不包括磷原子的經(jīng)修飾的dsrna骨架具有通過(guò)短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子以及烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵的那些(部分地從一個(gè)核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亞砜和砜骨架；甲乙?；?formacetyl)和硫代甲乙?；?thioformacetyl)骨架；亞甲基甲乙酰基(methyleneformacetyl)和硫代甲乙?；羌?；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的n、o、s和ch2組成部分的骨架。

傳授以上的寡核苷的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，其每一者通過(guò)引用結(jié)合于此。

在另一個(gè)合適的dsrna模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵(即骨架)被新基團(tuán)替代。保持堿基單元以與適當(dāng)?shù)暮怂岚袠?biāo)化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，即已經(jīng)顯示具有優(yōu)異的雜交特性的dsrna模擬物，稱作肽核酸(pna)。在pna化合物中，dsrna的糖骨架被含酰胺的骨架，尤其氨乙基甘氨酸骨架替代。這些核堿基得以保持并且直接或間接地結(jié)合至該骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。傳授pna化合物的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，其每一者通過(guò)引用結(jié)合于此。pna化合物的另外的傳授可以發(fā)現(xiàn)于nielsen(尼爾森)等人，science(《科學(xué)》)，1991,254,1497-1500中。

本發(fā)明的其他實(shí)施例是以上參考的美國(guó)專利號(hào)5,489,677的具有硫代磷酸酯骨架的dsrna和具有雜原子骨架的寡核苷，并且具體是--ch2--nh--ch2--、--ch2--n(ch3)--o--ch2--[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或mmi骨架]、--ch2--o--n(ch3)--ch2--、--ch2--n(ch3)--n(ch3)--ch2--以及--n(ch3)--ch2--ch2--[其中天然的磷酸二酯骨架由--o--p--o--ch2--代表]，以及以上參考的美國(guó)專利號(hào)5,602,240的酰胺骨架。還優(yōu)選上述參考的美國(guó)專利號(hào)5,034,506的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的dsrna。

經(jīng)修飾的dsrna還可以含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)取代的糖部分。優(yōu)選的dsrna在2’位置包括下述之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中該烷基、烯基和炔基可以是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。尤其優(yōu)選的是o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2、以及o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n與m是從1至大約10。其他優(yōu)選的dsrna在2’位置包括下述之一：c1至c10低級(jí)烷基、經(jīng)取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、經(jīng)取代的甲硅烷基、rna切割基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、用于提高dsrna藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)或用于提高dsrna藥效學(xué)特性的基團(tuán)、以及其他具有類似特性的取代基。一個(gè)優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-o--ch2ch2och3，也稱作2'-o-(2-甲氧基乙基)或2'-moe)(martin(馬丁)等人，helv.chim.acta(《瑞士化學(xué)學(xué)報(bào)》)，1995,78,486-504)，即，一個(gè)烷氧基-烷氧基基團(tuán)。另一個(gè)優(yōu)選的修飾包括如以下示例中闡述的2’-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基團(tuán)，如在以下實(shí)例中所描述的也稱作2'-dmaoe，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域中也稱作2’-o-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-dmaeoe)，即2'-o--ch2--o--ch2--n(ch2)2，也如在以下實(shí)例中所描述的。

其他優(yōu)選修飾包括2’-甲氧基(2’-och3)、2’-氨基丙氧基(2'-och2ch2ch2nh2)和2’-氟(2’-f)。類似的修飾也可以在dsrna的其他位置完成，尤其是3’末端核苷酸上或在2’-5’連接的dsrna中的糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。dsrna還可以具有糖模擬物如替代呋喃戊糖的環(huán)丁基部分。傳授此類經(jīng)修飾糖結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于：美國(guó)專利號(hào)4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920，其中某些是與本申請(qǐng)共同擁有的，并且其每一者通過(guò)引用以其全文結(jié)合于此。

dsrna還可以包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾物或取代物。如在此所使用的，“非修飾”或“天然”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。經(jīng)修飾核堿基包括但不局限于其他合成以及天然核堿基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵基，8-氨基，8-氫硫基，8-硫烷基，8-羥基以及其他8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。另外的核堿基包括在美國(guó)專利號(hào)3,687,808中披露的那些、在theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering(《聚合物科學(xué)與工程簡(jiǎn)明百科全書》)，第858-859頁(yè)，kroschwitz(克洛舍維奇)，j.l編著,johnwiley&sons(約翰威利出版公司)，1990年中披露的那些、在englisch(恩利施)等人，angewandtechemie(《應(yīng)用化學(xué)》)，國(guó)際版，1991，30，613中披露的那些、以及在sanghvi(賽格維)，y.s.，第15章，dsrnaresearchandapplications(《dsrna研究與應(yīng)用》)，第289-302頁(yè)，crooke(克魯克)，s.t.和lebleu(拉布列)，b.編著，crc出版社，1993中披露的那些。這些核堿基中的某些對(duì)提高本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力是特別有用的。這些堿基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及n-2、n-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸雙鏈體的穩(wěn)定性0.6℃-1.2℃(sanghvi,y.s.(桑格威,y.s.)，crooke,s.t.(克魯克,s.t.)以及l(fā)ebleu,b.(勒布魯,b.)，eds.,dsrnaresearchandapplications(《dsrna研究與應(yīng)用》)，crcpress(crc出版社)，bocaraton(波卡拉頓)，1993,第276-278頁(yè))，并是示例性的堿基取代基，甚至更加特別地為當(dāng)與2’-o-甲氧基乙基糖修飾物組合時(shí)。

傳授以上所提到的某些經(jīng)修飾的核堿基和其他經(jīng)修飾的核堿基的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于以上提到的美國(guó)專利號(hào)3,687,808，以及美國(guó)專利號(hào)4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；以及5,681,941，其每一者通過(guò)引用結(jié)合于此，以及美國(guó)專利號(hào)5,750,692，也通過(guò)引用結(jié)合于此。

軛合物

本發(fā)明的dsrna的另一種修飾涉及將增強(qiáng)該dsrna的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞吸收的一個(gè)或多個(gè)部分或軛合物化學(xué)連接至該dsrna。此類部分包括但不限于脂類部分如膽固醇部分(letsinger(樂(lè)欣格)等人，proc.natl.acid.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)，1989,86:6553-6556)，膽酸(manoharan(馬諾汗)等人，biorg.med.chem.let.(《生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)》)，1994,4:1053-1060)，硫醚如beryl-s-三苯甲基硫醇(manoharan(馬諾汗)等人，ann.n.y.acad.sci.(《紐約科學(xué)院年報(bào)》)，1992,660:306-309；manoharan(馬諾汗)等人，biorg.med.chem.let.(《生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)》)，1993,3:2765-2770)，硫代膽固醇(oberhauser(奧博汗瑟)等人，nucl.acidsres.(《核酸研究》)，1992,20:533-538)，脂肪鏈如十二烷基二醇或十一烷基殘基(saison-behmoaras(賽森-博和馬拉)等人，emboj,1991,10:1111-1118；kabanov(卡波諾)等人，febslett.,1990,259:327-330；svinarchuk(斯伍那區(qū)克)等人，biochimie(《生物化學(xué)》)，1993,75:49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1,2-二-o-十六燒基-外消旋-甘油-3-h磷酸酯(manoharan(馬諾汗)等人，tetrahedronlett.(《四面體通訊》)，1995,36:3651-3654；shea(舍阿)等人，nucl.acidsres.(《核酸研究》)，1990,18:3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇鏈(manoharan(馬諾汗)等人，nucleosides&nucleotides(《核苷&核苷酸》)，1995,14:969-973)或金剛烷乙酸(manoharan(馬諾汗)等人，tetrahedronlett.(《四面體通訊》)，1995,36:3651-3654)，十六燒基部分(mishra(米莎)等人，biochim.biophys.acta(《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》)，1995,1264:229-237)，或十八胺或己胺-羰基羥膽固醇部分(crooke(克魯克)等人，j.pharmacol.exp.ther.(《藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志》)，1996,277:923-937)。

不需要給定化合物中的所有位置被均勻地修飾，并且事實(shí)上多于一種的上述修飾可并入單一化合物中或甚至一個(gè)dsrna內(nèi)的單一核苷處。本發(fā)明還包括作為嵌合體化合物的dsrna化合物。雜本發(fā)明的上下文中，“嵌合體的”dsrna化合物或“嵌合體”是以下這樣的dsrna化合物，尤其是dsrna，它們包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同的區(qū)域，每者由至少一個(gè)單體單位構(gòu)成，即，在dsrna化合物的情況下的一種核苷酸。這些dsrna典型地包含至少一個(gè)區(qū)域，其中該dsrna經(jīng)修飾以賦予該dsrna增加的對(duì)核酸酶降解的抗性、增加的細(xì)胞攝取和/或增加的對(duì)于靶標(biāo)核酸而言的結(jié)合親和力。該dsrna的一個(gè)另外的區(qū)域可以作為能夠切割rna:dna或rna:rna雜交體的酶的底物。舉例而言，rnaseh是一種切割rna:dna雙鏈體的rna鏈的細(xì)胞內(nèi)核酸酶。因此，rnaseh的激活致使rna靶標(biāo)的切割，由此大大增強(qiáng)基因dsrna對(duì)基因表達(dá)的抑制的效率。結(jié)果，當(dāng)使用嵌合體dsrna時(shí)，與硫代磷酸酯脫氧dsrna雜交至相同靶標(biāo)區(qū)域相比，使用較短的dsrna通?？梢垣@得可比較的結(jié)果。

在某些實(shí)例中，該dsrna可以通過(guò)非配體基團(tuán)來(lái)進(jìn)行修飾。一些非配體分子已經(jīng)被軛合至dsrna以增強(qiáng)該dsrna的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取，并且用于進(jìn)行此類軛合的程序在科學(xué)文獻(xiàn)中是可得的。這種非配體部分已經(jīng)包括脂部分如膽固醇(letsinger(樂(lè)欣格)等人，proc.natl.acid.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)，1989,86:6553)，膽酸(manoharan(馬諾汗)等人，biorg.med.chem.let.(《生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)》)，1994,4:1053)，硫醚如己基-s-三苯甲基硫醇(manoharan(馬諾汗)等人，ann.n.y.acad.sci.(《紐約科學(xué)院年報(bào)》)，1992,660:306；manoharan(馬諾汗)等人，biorg.med.chem.let.(《生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)快報(bào)》)，1993,3:2765)，硫代膽固醇(oberhauser(奧博汗瑟)等人，nucl.acidsres.(《核酸研究》)，1992,20:533)，脂肪鏈如十二烷基二醇或十一烷基殘基(saison-behmoaras(賽森-博和馬拉)等人，emboj,1991,10:111；kabanov(卡波諾)等人，febslett.,1990,259:327；svinarchuk(斯伍那區(qū)克)等人，biochimie(《生物化學(xué)》)，1993,75:49)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙銨1,2-二-o-十六燒基-外消旋-甘油-3-h-磷酸酯(manoharan(馬諾汗)等人，tetrahedronlett.(《四面體通訊》)，1995,36:3651；shea(舍阿)等人，nucl.acidsres.(《核酸研究》)，1990,18:3777)，聚胺或聚乙烯乙二醇鏈(manoharan(馬諾汗)等人，nucleosides&nucleotides(《核苷&核苷酸》)，1995,14:969)或金剛烷乙酸(manoharan(馬諾汗)等人，tetrahedronlett.(《四面體通訊》)，1995,36:3651)，十六燒基部分(mishra(米莎)等人，biochim.biophys.acta(《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》)，1995,1264:229)，或十八胺或己胺-羰基-羥膽固醇部分(crooke(克魯克)等人，j.pharmacol.exp.ther.(《藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志》)，1996,277:923)。傳授此類dsrna軛合物的制備的代表性美國(guó)專利已經(jīng)列于以上。典型的軛合方案涉及在序列的一個(gè)或多個(gè)位置具有氨基連接物的dsrna的合成。然后使用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑或活化劑使該氨基基團(tuán)與被軛合的分子進(jìn)行反應(yīng)。該軛合反應(yīng)可以使用仍舊結(jié)合至固體支撐體的dsrna進(jìn)行或者可以接下來(lái)切割溶液相中的dsrna。通過(guò)hplc純化該dsrna軛合物典型地給出純軛合物。

將一種配體軛合至一個(gè)dsrna可以增強(qiáng)其細(xì)胞吸收以及至特定組織的靶向或者被具體類型的細(xì)胞(比如肝細(xì)胞)的攝取。在某些實(shí)例中，將一種疏水配體軛合至dsrna以促進(jìn)細(xì)胞膜的直接滲透和/或肝細(xì)胞的攝取?？商娲兀椇现羋srna的配體是用于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的底物。這些方法已經(jīng)用于促進(jìn)反義寡核苷酸以及dsrna劑的細(xì)胞滲透。例如，已經(jīng)將膽固醇軛合至不同反義寡核苷酸，產(chǎn)生相比于其非軛合的類似物而言實(shí)質(zhì)上更具活性的化合物。參見(jiàn)m.manoharan(m.馬諾汗)antisense&nucleicaciddrugdevelopment(《反義&核酸藥物研發(fā)》)2002,12,103。已經(jīng)被軛合至寡核苷酸的其他親脂化合物包括1-芘丁酸、1,3-雙-o-(十六烷基)甘油、以及薄荷醇。用于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體的一個(gè)實(shí)例是葉酸。葉酸通過(guò)葉酸酯受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。具有葉酸的dsrna化合物通過(guò)葉酸酯受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用會(huì)被有效地運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞。li(李)與同事報(bào)道：將葉酸附接至寡核苷酸的3’-末端導(dǎo)致該寡核苷酸的細(xì)胞攝取增加8倍。li,s.(李,s.)；deshmukh,h.m.(德赫馬克,h.m.)；huang,l.(黃,l.)pharm.res.(《藥物研究》)1998,15,1540。已經(jīng)被軛合至寡核苷酸的其他配體包括聚乙二醇、碳水化合物簇、交聯(lián)劑、卟啉軛合物、遞送肽以及脂類比如膽固醇以及膽甾醇基胺。碳水化合物簇的實(shí)例包括chol-p-(galnac)3(n-乙酰半乳糖胺膽固醇)以及l(fā)co(galnac)3(n-乙酰半乳糖胺-3’-石膽酸-油?；?。

碳水化合物軛合物

在本發(fā)明的組合物與方法的一些實(shí)施例中，dsrna寡核苷酸進(jìn)一步包括一種碳水化合物。軛合碳水化合物的dsrna對(duì)于核酸的體內(nèi)遞送以及適合于體內(nèi)治療用途的組合物而言是有利的，如在此所描述。如在此所使用的，“碳水化合物”指以下這樣一種化合物，它是一種本身由具有至少6個(gè)碳原子的一個(gè)或多個(gè)單糖單位構(gòu)成的碳水化合物(其可以是線性的、支鏈的或環(huán)狀的)，其中氧、氮或硫原子結(jié)合至每一碳原子；或者它是一種具有以下這樣的一個(gè)碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物由具有至少六個(gè)碳原子的一個(gè)或多個(gè)單糖單位構(gòu)成(其可以是線性的、支鏈的或環(huán)狀的)，其中氧、氮或硫原子結(jié)合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(單糖、二糖、三糖以及包含從大約4、5、6、7、8或9個(gè)單糖單位的低聚糖)，以及多糖比如淀粉、糖原、纖維素以及多糖膠。具體的單糖包括c5以及以上的(例如，c5、c6、c7或c8)糖；二糖以及三糖包括具有兩個(gè)或三個(gè)單糖單位的糖(例如，c5、c6、c7或c8)。

在一個(gè)實(shí)施例中，用于在本發(fā)明的組合物以及方法中使用的碳水化合物軛合物是一種單糖。在一個(gè)實(shí)施例中，該單糖是一種n-乙酰半乳糖胺，比如

在另一個(gè)實(shí)施例中，用于在本發(fā)明的組合物以及方法中使用的碳水化合物軛合物是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

用于在于此描述的實(shí)施例中使用的另一個(gè)代表性碳水化合物軛合物包括但不限于

當(dāng)x或y其中一者是寡核苷酸時(shí)，另一者是氫。

在一些實(shí)施例中，該碳水化合物軛合物進(jìn)一步包括以上描述的一個(gè)或多個(gè)另外的配體，比如但不限于一種pk調(diào)制子和/或一種細(xì)胞滲透肽。

連接物

在一些實(shí)施例中，可以利用可切割的或不可切割的不同連接物將在此描述的軛合物或配體附接至本發(fā)明的dsrna。

術(shù)語(yǔ)“連接物”或“連接基團(tuán)”意為一種有機(jī)部分，它連接一個(gè)化合物的兩個(gè)部分，例如，共價(jià)地附接一個(gè)化合物的兩個(gè)部分。連接物典型地包括一種直接的鍵或一種原子比如氧或硫，一種單位比如nr8、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh或者一種原子鏈，比如但不限于經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烯基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、雜環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環(huán)烷基、烷基雜環(huán)烯基、烷基雜環(huán)炔基、烯基雜環(huán)烷基、烯基雜環(huán)烯基、烯基雜環(huán)炔基、炔基雜環(huán)烷基、炔基雜環(huán)烯基、炔基雜環(huán)炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一個(gè)或多個(gè)亞甲基可以被以下中斷或封端：o、s、s(o)、so2、n(r8)、c(o)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜芳基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜環(huán)基；其中r8是氫、?；⒅咀宓幕蚪?jīng)取代的脂肪族的。在一個(gè)實(shí)施例中，該連接物是在大約1-24個(gè)原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18個(gè)原子，7-17、8-17、6-16、7-17或8-16個(gè)原子之間。

一種可切割的連接基團(tuán)在細(xì)胞外是足夠穩(wěn)定的，但它在進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞時(shí)被切割以釋放該連接物結(jié)合在一起的兩個(gè)部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該可切割的連接基團(tuán)在靶標(biāo)細(xì)胞中或在一個(gè)第一參照條件(其可以例如被選擇為模擬或代表細(xì)胞內(nèi)條件)下的切割比在受試者的血液中或在一個(gè)第二參考條件下(其可以例如被選擇為模擬或代表在該血液或血清中發(fā)現(xiàn)的條件)快至少大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少大約100倍。

可切割的連接基團(tuán)易于受到切割因子(例如ph、氧化還原電位或降解分子的存在)的影響。一般地，切割因子在細(xì)胞內(nèi)比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此類降解因子的實(shí)例包括：氧化還原因子，它們被選擇用于具體底物或者無(wú)底物特異性，包括例如氧化或還原酶或者在細(xì)胞中出現(xiàn)的還原因子比如硫醇(它可以通過(guò)還原作用降解一種可氧化還原切割的連接基團(tuán))；酯酶；內(nèi)涵體或可以創(chuàng)造酸性環(huán)境的因子，比如可以導(dǎo)致ph為5或更低的那些；可以通過(guò)作為一種廣義酸起作用而水解或降解一種酸可切割的連接基團(tuán)的酶，肽酶(它可以是底物特異性的)，以及磷酸酶。

一種可切割的連鎖群，比如二硫鍵可以對(duì)ph敏感。人血清的ph是7.4，而平均的細(xì)胞內(nèi)ph稍低，范圍為大約7.1-7.3。內(nèi)涵體具有一個(gè)更酸的ph，范圍在5.5-6.0，并且溶酶體具有一個(gè)甚至更酸的ph，在5.0左右。一些連接物將具有可切割的連接基團(tuán)，這些基團(tuán)在一個(gè)優(yōu)選的ph處被切割，由此將陽(yáng)離子脂類從配體釋放在細(xì)胞內(nèi)，或釋放進(jìn)入所希望的細(xì)胞區(qū)室。

連接物可以包括一種可被特定酶切割的可切割連接基團(tuán)。并入連接物的可切割連接基團(tuán)的類型可以取決于有待被靶向的細(xì)胞。例如，肝靶向的配體可以通過(guò)一種包括酯基團(tuán)的連接物而被連接至一種陽(yáng)離子脂類。肝細(xì)胞富含酯酶，并且因此與不富含酯酶的細(xì)胞相比，該連接物將在肝細(xì)胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他細(xì)胞類型包括肺、腎皮質(zhì)以及睪丸的細(xì)胞。

當(dāng)靶向富含肽酶的細(xì)胞類型(比如肝細(xì)胞與滑膜細(xì)胞)時(shí)，可以使用包含肽鍵的連接物。

總體上，一種候選的可切割連接基團(tuán)的適合性可以通過(guò)測(cè)試降解因子(或條件)切割該候選的連接基團(tuán)的能力來(lái)進(jìn)行評(píng)估。還希望的是也測(cè)試該候選的可切割連接基團(tuán)在血液中或當(dāng)與其他非靶標(biāo)組織接觸時(shí)抵抗切割的能力。因此，可以確定在一個(gè)第一條件與一個(gè)第二條件之間進(jìn)行切割的相對(duì)敏感性，其中該第一條件被選擇為指示在一個(gè)靶標(biāo)細(xì)胞中的切割并且該第二條件被選擇為指示在其他組織或生物流體(例如，血液或血清)中的切割。這些評(píng)估可以在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中、在細(xì)胞中、在細(xì)胞培養(yǎng)物中、在器官或組織培養(yǎng)物中或在整個(gè)動(dòng)物中進(jìn)行。有用的是在無(wú)細(xì)胞或培養(yǎng)條件下進(jìn)行初始評(píng)估并且通過(guò)在整個(gè)動(dòng)物中的進(jìn)一步評(píng)估來(lái)進(jìn)行確證。在優(yōu)選的實(shí)施例中，有用的候選化合物在細(xì)胞中(或在選擇為模擬細(xì)胞內(nèi)條件的體外條件下)的切割比在血液或血清(或在被選擇為模擬細(xì)胞外條件的體外條件下)中的切割快至少大約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大約100倍。

在一個(gè)實(shí)施例中，可切割的連接基團(tuán)是一種氧化還原可切割的連接基團(tuán)，其在還原或氧化時(shí)被切割。還原地可切割的連接基團(tuán)的實(shí)例是二硫化物連接基團(tuán)(-s-s-)。為了確定一個(gè)候選的可切割連接基團(tuán)是否是一種適合的“還原地可切割的連接基團(tuán)”，或者例如是否適合于與一種特定的dsrna部分以及特定的靶向劑一起使用，可以參考在此描述的方法。例如，可以通過(guò)與二硫蘇糖醇(dtt)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的使用還原劑的試劑進(jìn)行孵育來(lái)對(duì)一個(gè)候選者進(jìn)行評(píng)估，這模擬了會(huì)在細(xì)胞(例如靶標(biāo)細(xì)胞)內(nèi)觀察到的切割速率。還可以在被選擇為模擬血液或血清條件的條件下對(duì)這些候選者進(jìn)行評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施例中，候選化合物在血液中被切割最多大約10％。在其他實(shí)施例中，有用的候選化合物在細(xì)胞中(或在被選擇為模擬細(xì)胞內(nèi)條件的體外條件下)的降解比在血液(或在選擇以模擬細(xì)胞外條件的體外條件下)中的降解快至少大約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大約100倍。可以在被選擇為模擬細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)的條件下，使用標(biāo)準(zhǔn)的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定來(lái)確定候選化合物的切割速率，并且將其與被選擇為模擬細(xì)胞外介質(zhì)的條件下的速率相比較。

在另一個(gè)實(shí)施例中，可切割連接物包括一種基于磷酸酯的可切割的連接基團(tuán)?；诹姿狨サ目汕懈畹倪B接基團(tuán)通過(guò)降解或水解該磷酸酯基團(tuán)的因子而被切割。一種在細(xì)胞中切割磷酸酯基團(tuán)的因子的實(shí)例是酶，比如細(xì)胞中的磷酸酶?；诹姿狨サ倪B接基團(tuán)的實(shí)例是-o-p(o)(ork)-o-、-o-p(s)(ork)-o-、-o-p(s)(srk)-o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-s-p(s)(ork)-o-、-o-p(o)(rk)-o-、-o-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-o-、-s-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-s-、-o-p(s)(rk)-s-。優(yōu)選的實(shí)施例是-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o-、-s-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-s-、-o-p(s)(h)-s-。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是-o-p(o)(oh)-o-?？梢允褂妙愃朴谝陨厦枋龅哪切┑姆椒▉?lái)評(píng)估這些候選者。

在另一個(gè)實(shí)施例中，可切割連接物包括一種酸可切割的連接基團(tuán)。酸可切割的連接基團(tuán)是在酸性條件下被切割的一種連接基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，酸可切割的連接基團(tuán)在一個(gè)具有大約6.5或更低(例如，大約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的ph的酸性環(huán)境中被切割，或者被多種因子(比如可以作為一種廣義酸起作用的酶)被切割。在細(xì)胞中，具體的低ph細(xì)胞器(比如內(nèi)涵體或溶酶體)可以提供一個(gè)針對(duì)酸可切割的連接基團(tuán)的切割環(huán)境。酸可切割的連接基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基團(tuán)可以具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是當(dāng)附接至酯(烷氧基基團(tuán))的氧的碳是芳基基團(tuán)、經(jīng)取代的烷基基團(tuán)或叔烷基基團(tuán)(比如二甲基戊基或叔丁基)時(shí)?？梢允褂妙愃朴谝陨厦枋龅哪切┑姆椒▉?lái)評(píng)估這些候選者。

在另一個(gè)實(shí)施例中，可切割連接物包括一種基于酯的可切割的連接基團(tuán)?；邗サ目汕懈畹倪B接基團(tuán)通過(guò)酶(比如細(xì)胞中的酯酶與酰胺酶)而被切割。基于酯的可切割的連接基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于亞烷基、亞烯基以及亞炔基的酯。酸可切割的連接基團(tuán)具有通式-c(o)o-、或-oc(o)-?？梢允褂妙愃朴谝陨厦枋龅哪切┑姆椒▉?lái)評(píng)估這些候選者。

在又另一個(gè)實(shí)施例中，可切割連接物包括一種基于肽的可切割的連接基團(tuán)?；陔牡目汕懈畹倪B接基團(tuán)通過(guò)酶(比如細(xì)胞中的肽酶與蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割的連接基團(tuán)是在氨基酸之間形成以產(chǎn)生寡肽(例如，二肽、三肽，等等)以及多肽的肽鍵?；陔牡目汕懈畹幕鶊F(tuán)不包括酰胺基團(tuán)(-c(o)nh-)。該酰胺基團(tuán)可以在任何亞烷基、亞烯基或亞炔基之間形成。肽鍵是在氨基酸之間形成以產(chǎn)生肽以及蛋白質(zhì)的特定類型的酰胺鍵。該基于肽的切割基團(tuán)總體上限于在在氨基酸之間形成以產(chǎn)生肽以及蛋白質(zhì)的肽鍵(即，酰胺鍵)，并且不包括整個(gè)酰胺官能團(tuán)?；陔牡目汕懈畹倪B接基團(tuán)具有通式-nhchrac(o)nhchrbc(o)-(seqidno:13)，其中ra與rb是這兩個(gè)鄰接氨基酸的r基團(tuán)?？梢允褂妙愃朴谝陨厦枋龅哪切┑姆椒▉?lái)評(píng)估這些候選者。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的dsrna通過(guò)一種連接物被軛合至一種碳水化合物。本發(fā)明的組合物與方法的具有連接物的dsrna碳水化合物軛合物的非限制性實(shí)例包括但不限于，

當(dāng)x或y其中一者是寡核苷酸時(shí)，另一者是氫。

在本發(fā)明的組合物與方法的某些實(shí)施例中，配體是通過(guò)二價(jià)或三價(jià)分支連接物而附接的一個(gè)或多個(gè)galnac(n-乙酰半乳糖胺)衍生物。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的dsrna被軛合至一種二價(jià)或三價(jià)分支連接物，其選自在化學(xué)式(xxxi)-(xxxiv)的任一個(gè)中顯示的結(jié)構(gòu)的組：

其中：各次出現(xiàn)的q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b以及q5c獨(dú)立地代表0-20，并且其中該重復(fù)單位可以是相同或不同的；

各次出現(xiàn)的p^2a、p^2b、p^3a、p^3b、p^4a、p^4b、p^5a、p^5b、p^5c、t^2a、t^2b、t^3a、t^3b、t^4a、t^4b、t^4a、t^5b、t^5c各自獨(dú)立地是：不存在、co、nh、o、s、oc(o)、nhc(o)、ch2、ch2nh或ch2o；

各次出現(xiàn)的q^2a、q^2b、q^3a、q^3b、q^4a、q^4b、q^5a、q^5b、q^5c獨(dú)立地是：不存在、亞烷基、經(jīng)取代的亞烷基其中一個(gè)或多個(gè)亞甲基可以被以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)所中斷或封端：o、s、s(o)、so2、n(rⁿ)、c(r’)＝c(r”)、c≡c或c(o)；

各次出現(xiàn)的r^2a、r^2b、r^3a、r^3b、r^4a、r^4b、r^5a、r^5b、r^5c各自獨(dú)立地是：不存在、nh、o、s、ch2、c(o)o、c(o)nh、nhch(r^a)c(o)、-c(o)-ch(r^a)-nh-、co、ch＝n-o、或雜環(huán)基；

各次出現(xiàn)的l^2a、l^2b、l^3a、l^3b、l^4a、l^4b、l^5a、l^5b以及l(fā)^5c代表配體，即，各自獨(dú)立地代表：?jiǎn)翁?比如galnac)、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖；并且r^a是h或氨基酸側(cè)鏈。三價(jià)軛合的galnac衍生物對(duì)于與rnai劑一起使用以抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)是特別有用的，比如具有化學(xué)式(xxxv)的那些：

其中l(wèi)^5a、l^5b與l^5c代表單糖，比如galnac衍生物。

合適的二價(jià)與三價(jià)分支連接物基團(tuán)軛合的galnac衍生物的實(shí)例包括但不限于在以上引用為化學(xué)式ii_vii、xi、x以及xiii的結(jié)構(gòu)。

傳授rna軛合物的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，每一者的全部?jī)?nèi)容特此通過(guò)引用結(jié)合于此。

編碼dsrna的載體

在另一個(gè)方面，apoc3dsrna分子是從插入rna或rna載體的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)(參見(jiàn)，例如，couture,a(卡秋爾,a)等人，tig.(1996),12:5-10；skillern,a.(思科勒爾,a)等人，國(guó)際pct公開(kāi)號(hào)wo00/22113，conrad(卡雷德)，國(guó)際pct公開(kāi)號(hào)wo00/22114，以及conrad(卡雷德)，美國(guó)專利號(hào)6,054,299)。這些轉(zhuǎn)基因可以作為線性構(gòu)建體、環(huán)形質(zhì)?；虿《据d體而被引入，進(jìn)而可以作為整合入宿主基因組的轉(zhuǎn)基因而得以并入并遺傳。該轉(zhuǎn)基因還可以被構(gòu)建以允許其作為染色體外的質(zhì)粒進(jìn)行遺傳(gassmann(噶斯曼)等人，proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)(1995)92:1292)。

dsrna的單個(gè)鏈可以通過(guò)在兩個(gè)單獨(dú)表達(dá)載體上的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且共轉(zhuǎn)染進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞?？商娲?，該dsrna的每一單個(gè)鏈可以通過(guò)兩者都位于相同表達(dá)質(zhì)粒上的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施例中，dsrna表達(dá)為被一種連接物多核苷酸序列連接的反向重復(fù)，由此該dsrna具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

重組dsrna表達(dá)載體通常是dna質(zhì)粒或病毒載體。表達(dá)dsrna的病毒載體可以基于但不限于以下項(xiàng)進(jìn)行構(gòu)建：腺相關(guān)病毒(綜述，參見(jiàn)muzyczka(穆齊茲卡)等人，curr.topicsmicro.immunol.(《微生物免疫學(xué)當(dāng)前話題》)(1992)158:97-129))；腺病毒(參加，例如，berkner(貝克那)等人，biotechniques(《生物技術(shù)》)(1998)6:616，rosenfeld(羅森菲爾德)等人(1991,science(《科學(xué)》)252:431-434)，以及rosenfeld(羅森菲爾德)等人(1992),cell(《細(xì)胞》)68:143-155))；或者本領(lǐng)域內(nèi)其他已知的甲病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)用于將多種基因引入許多不同的細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞，體外和/或體內(nèi)地(參見(jiàn)，例如eglitis，(俄格李提思)等人，science(《科學(xué)》)(1985)230:1395-1398；danos(達(dá)諾斯)與mulligan(穆麗干)，proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)(1998)85:6460-6464；wilson(威爾森)等人，1988,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)85:3014-3018；armentano(阿門塔諾)等人，1990,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)87:61416145；huber(胡伯爾)等人，1991,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)88:8039-8043；ferry(費(fèi)銳)等人，1991,proc.nati.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)88:8377-8381；chowdhury(周博瑞)等人，1991,science254:1802-1805；vanbeusechem，(萬(wàn)碧右瑟科姆)等人，1992,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)89:7640-19；kay(凱)等人，1992,humangenetherapy(《人類基因治療》)3:641-647；dai(戴)等人，1992,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)89:10892-10895；hwu(胡)等人，1993,j.immunol.(《免疫學(xué)雜志》)150:4104-4115；美國(guó)專利號(hào)4,868,116；美國(guó)專利號(hào)4,980,286；pct申請(qǐng)wo89/07136；pct申請(qǐng)wo89/02468；pct申請(qǐng)wo89/05345；和pct申請(qǐng)wo92/07573)。能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)并且表達(dá)插入細(xì)胞基因組的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過(guò)將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組轉(zhuǎn)染進(jìn)入合適的包裝細(xì)胞系(比如pa317以及psi-crip)來(lái)產(chǎn)生(comette(克米特)等人，1991,humangenetherapy(《人類基因治療》)2:5-10；cone(科恩)等人，1984,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)81:6349)。重組腺病毒載體可用于感染易感宿主(例如大鼠、倉(cāng)鼠、狗和黑猩猩)中的多種細(xì)胞和組織(hsu(赫蘇)等人，1992，j.infectiousdisease(《感染疾病雜志》)，166：769)，并且還具有不需要有絲分裂活性細(xì)胞進(jìn)行感染的優(yōu)點(diǎn)。

可以使用能夠接受對(duì)有待表達(dá)的該(這些)dsrna分子進(jìn)行編碼的序列的任何病毒載體，例如衍生自以下各項(xiàng)的載體：腺病毒(av)；腺相關(guān)病毒(aav)；逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(lv)、彈狀病毒、鼠白血病病毒)；皰疹病毒，等等。病毒載體的向性可以通過(guò)用包膜蛋白或來(lái)自其他病毒的其他表面抗原來(lái)對(duì)這些載體假型化而進(jìn)行修飾，或者適當(dāng)時(shí)通過(guò)取代不同的病毒衣殼蛋白而進(jìn)行修飾。

例如，在本發(fā)明中表征的慢病毒載體可以用來(lái)自水泡性口炎病毒(vsv)、狂犬病病毒、埃博拉病毒(ebola)、莫科拉病毒(mokola)等等的表面蛋白進(jìn)行假型化。在本發(fā)明中表征的aav載體可以被制備為靶向不同細(xì)胞，這是通過(guò)對(duì)這些載體進(jìn)行工程化以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來(lái)達(dá)到。例如，在血清型2基因組上表達(dá)血清型2衣殼的aav載體稱為aav2/2。在aav2/2載體中的這種血清型2衣殼基因可以由血清型5衣殼基因替代以產(chǎn)生aav2/5載體。用于構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的aav載體的技術(shù)是在本領(lǐng)域的技藝之內(nèi)；參見(jiàn)例如，rabinowitzje(羅賓諾威茲je)等人(2002)，jvirol(《病毒學(xué)雜志》)76:791-801，將其全部披露通過(guò)引用結(jié)合于此。

適合于在本發(fā)明中使用的重組病毒載體的選擇、用于將表達(dá)dsrna的核酸序列插入載體的方法以及遞送病毒載體至感興趣細(xì)胞的方法都在本領(lǐng)域的技藝之內(nèi)。參見(jiàn)，例如，dornburgr(多恩伯格r)(1995),genetherap.(《基因治療》)2:301-310；eglitisma(俄格李提思)(1988),biotechniques(《生物技術(shù)》)6:608-614；millerad(米勒ad)(1990),humgenetherap.(《人類基因治療》)1:5-14；andersonwf(安德森af)(1998),nature(《自然》)392:25-30；以及rubinsonda(羅賓遜da)等人，nat.genet.(《自然遺傳學(xué)》)33:401-406，將其全部披露通過(guò)引用結(jié)合于此。

病毒載體可以衍生自av以及aav。在一個(gè)實(shí)施例中，在本發(fā)明中表征的dsrna從重組aav載體表達(dá)為兩個(gè)單獨(dú)的互補(bǔ)的單鏈rna分子，該重組aav載體具有例如u6或h1rna啟動(dòng)子或者巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子。

用于表達(dá)在本發(fā)明中表征的dsrna的合適的av載體、用于構(gòu)建該重組av載體的方法以及用于遞送該載體進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞的方法描述于xiah(夏h)等人(2002),nat.biotech.(《自然生物技術(shù)》)20:1006-1010中。

用于表達(dá)在本發(fā)明中表征的dsrna的合適的aav載體、用于構(gòu)建該重組av載體的方法以及用于遞送該載體進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞的方法描述于以下各項(xiàng)中：samulskir(薩穆?tīng)査够鵵)等人(1987),j.virol.(《病毒學(xué)雜志》)61:3096-3101；fisherkj(費(fèi)歇爾kj)等人(1996),j.virol(《病毒學(xué)雜志》)，70:520-532；samulskir(薩穆?tīng)査够鵵)等人(1989),j.virol.(《病毒學(xué)雜志》)63:3822-3826；美國(guó)專利號(hào)5,252,479；美國(guó)專利號(hào)5,139,941；國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杦o94/13788；以及國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杦o93/24641，將其全部披露通過(guò)引用結(jié)合于此。

驅(qū)動(dòng)dsrna在本發(fā)明中表征的dna質(zhì)?；虿《据d體中表達(dá)的啟動(dòng)子可以是真核生物rna聚合酶i(例如，核糖體rna啟動(dòng)子)，rna聚合酶ii(例如，cmv早期啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或u1snrna啟動(dòng)子)或通用rna聚合酶iii啟動(dòng)子(例如，u6snrna或7skrna啟動(dòng)子)或原核生物啟動(dòng)子，例如t7啟動(dòng)子，其條件是該表達(dá)質(zhì)粒還編碼對(duì)于從t7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄所需要的t7rna聚合酶。該啟動(dòng)子還可以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)至胰腺(參見(jiàn)，例如，theinsulinregulatorysequenceforpancreas(針對(duì)胰腺的胰島素調(diào)節(jié)序列)(bucchini(卜馳倪)等人，1986,proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)83:2511-2515))。

另外，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以被精確地調(diào)節(jié)，例如，通過(guò)使用一種可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列以及表達(dá)系統(tǒng)，比如一種對(duì)某些生理學(xué)上的調(diào)節(jié)因子敏感的調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)因子例如循環(huán)葡萄糖水平或激素(docherty(多赫替)等人，1994,fasebj.8:20-24)。適合于在細(xì)胞中或哺乳動(dòng)物中控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的此類可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)包括由以下項(xiàng)進(jìn)行的調(diào)節(jié)：蛻皮激素、雌激素、黃體酮、四環(huán)素、二聚作用的化學(xué)誘導(dǎo)物、以及異丙基-β-d1-硫代半乳糖苷(eptg)。本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠基于dsrna轉(zhuǎn)基因的預(yù)期用途來(lái)選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)/啟動(dòng)子序列。

通常，能夠表達(dá)dsrna分子的重組載體如以下所描述地被遞送，并且存留在靶細(xì)胞內(nèi)?？商娲?，可以使用提供dsrna分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。必要時(shí)此類載體可以重復(fù)給予。一旦表達(dá)，這些dsrna結(jié)合至靶標(biāo)rna并且調(diào)節(jié)其功能或表達(dá)。dsrna表達(dá)載體的遞送可以是系統(tǒng)性的，比如通過(guò)靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給予，通過(guò)給予至外移植自患者的靶標(biāo)細(xì)胞、接著再引入該患者，或者通過(guò)允許引入所希望的靶標(biāo)細(xì)胞的任何其他手段。

dsrna表達(dá)dna質(zhì)粒典型地作為一種與陽(yáng)離子脂類載體(例如，oligofectamine)或基于非陽(yáng)離子脂類的載體(例如，transit-tko^tm)的復(fù)合體而轉(zhuǎn)染進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞。本發(fā)明還考慮了用于在一周或更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)靶向一個(gè)單一apoc3基因的不同區(qū)域或多個(gè)apoc3基因的dsrna介導(dǎo)的敲低的多脂類轉(zhuǎn)染。成功地將載體引入宿主細(xì)胞可以使用多種已知的方法來(lái)監(jiān)測(cè)。例如，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以使用一種報(bào)告物來(lái)進(jìn)行信號(hào)化，比如熒光標(biāo)記，比如綠色熒光蛋白(gfp)。穩(wěn)定的對(duì)離體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以使用以下這樣的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行確保：這些標(biāo)記為被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提供了對(duì)特定環(huán)境因子(比如抗生素或藥物)的抗性，比如潮霉素b抗性。

apoc3特異性dsrna分子還可以插入載體并且用作人類患者的基因治療載體?；蛑委熭d體可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)注射、局部給予(參見(jiàn)美國(guó)專利5,328,470)或通過(guò)定向性注射(參見(jiàn)例如chen(陳)等人(1994)proc.natl.acad.sci.usa(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)91:3054-3057)被遞送至一個(gè)受試者。該基因治療載體的藥物制品可以包括在一種可接受的稀釋劑中的該基因治療載體，或者可以包括一種緩釋基質(zhì)，該基因遞送媒介物被嵌入其中?？商娲兀?dāng)該完全的基因遞送載體可以從重組細(xì)胞(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)完整地產(chǎn)出的情況下，該藥物制品可以包括產(chǎn)出該基因遞送系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。

包含dsrna的藥物組合物

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含如在此所描述的dsrna以及一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。包含該dsrna的藥物組合物對(duì)于治療與apoc3基因表達(dá)或活性相關(guān)聯(lián)的疾病或病癥(比如由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程)而言是有用的。此類藥物組合物基于遞送模式而進(jìn)行配制。

在此表征的藥物組合物以足以抑制apoc3基因表達(dá)的劑量給予。

通常，dsrna的適當(dāng)劑量為每天每公斤接受者體重0.01到200.0mg，通常在每天每公斤體重1到50mg范圍內(nèi)。

可以將以下治療量的dsrna給予受試者：比如大約0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kgdsrna、2.6mg/kgdsrna、2.7mg/kgdsrna、2.8mg/kgdsrna、2.9mg/kgdsrna、3.0mg/kgdsrna、3.1mg/kgdsrna、3.2mg/kgdsrna、3.3mg/kgdsrna、3.4mg/kgdsrna、3.5mg/kgdsrna、3.6mg/kgdsrna、3.7mg/kgdsrna、3.8mg/kgdsrna、3.9mg/kgdsrna、4.0mg/kgdsrna、4.1mg/kgdsrna、4.2mg/kgdsrna、4.3mg/kgdsrna、4.4mg/kgdsrna、4.5mg/kgdsrna、4.6mg/kgdsrna、4.7mg/kgdsrna、4.8mg/kgdsrna、4.9mg/kgdsrna、5.0mg/kgdsrna、5.1mg/kgdsrna、5.2mg/kgdsrna、5.3mg/kgdsrna、5.4mg/kgdsrna、5.5mg/kgdsrna、5.6mg/kgdsrna、5.7mg/kgdsrna、5.8mg/kgdsrna、5.9mg/kgdsrna、6.0mg/kgdsrna、6.1mg/kgdsrna、6.2mg/kgdsrna、6.3mg/kgdsrna、6.4mg/kgdsrna、6.5mg/kgdsrna、6.6mg/kgdsrna、6.7mg/kgdsrna、6.8mg/kgdsrna、6.9mg/kgdsrna、7.0mg/kgdsrna、7.1mg/kgdsrna、7.2mg/kgdsrna、7.3mg/kgdsrna、7.4mg/kgdsrna、7.5mg/kgdsrna、7.6mg/kgdsrna、7.7mg/kgdsrna、7.8mg/kgdsrna、7.9mg/kgdsrna、8.0mg/kgdsrna、8.1mg/kgdsrna、8.2mg/kgdsrna、8.3mg/kgdsrna、8.4mg/kgdsrna、8.5mg/kgdsrna、8.6mg/kgdsrna、8.7mg/kgdsrna、8.8mg/kgdsrna、8.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、9.1mg/kgdsrna、9.2mg/kgdsrna、9.3mg/kgdsrna、9.4mg/kgdsrna、9.5mg/kgdsrna、9.6mg/kgdsrna、9.7mg/kgdsrna、9.8mg/kgdsrna、9.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、10mg/kgdsrna、15mg/kgdsrna、20mg/kgdsrna、25mg/kgdsrna、30mg/kgdsrna、35mg/kgdsrna、40mg/kgdsrna、45mg/kgdsrna、或者大約50mg/kgdsrna。對(duì)于這些引用的值而言的中間值與范圍也意在成為本發(fā)明的部分。

可以將該藥物組合物一日給予一次，或者可以將該dsrna在一天內(nèi)以適當(dāng)?shù)拈g隔給予兩次、三次或更多次亞劑量，或者甚至可以通過(guò)控釋制劑使用連續(xù)輸注或遞送而給予。在那種情況下，包含在每一亞劑量中的dsrna必須相應(yīng)地較小以達(dá)到每日總劑量。該劑量單位還可以被配成用于數(shù)天的遞送，例如使用常規(guī)的緩釋制劑，它們?cè)谝粋€(gè)數(shù)天的時(shí)期內(nèi)提供該dsrna的持續(xù)釋放。緩釋制劑在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的并且對(duì)于在特定部位遞送試劑是特別有用的，由此可以與本發(fā)明的試劑使用。在這一實(shí)施例中，該劑量單位包含相應(yīng)的多個(gè)每日劑量。

單劑量對(duì)apoc3水平的影響是長(zhǎng)期的，這樣以不超過(guò)3、4或5天的間隔，或以不超過(guò)1、2、3或4周的間隔，或以不超過(guò)5、6、7、8、9或10周的間隔施用后續(xù)劑量。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，某些因素可以影響有效治療一個(gè)受試者所需的劑量和時(shí)間安排，這些因素包括(但不局限于)疾病或病癥的嚴(yán)重性、之前的治療、該受試者的總體健康和/或年齡、以及其他存在的疾病。此外，用治療有效劑量的組合物治療一個(gè)受試者可以包括單一治療或者一系列治療。本發(fā)明所囊括的單個(gè)dsrna的有效劑量的評(píng)估以及體內(nèi)半衰期的評(píng)估可以使用常規(guī)的方法論來(lái)進(jìn)行，或者基于使用適當(dāng)動(dòng)物模型的體內(nèi)測(cè)試來(lái)進(jìn)行，如在此的其他地方所描述的。

在小鼠遺傳學(xué)方面的進(jìn)展已經(jīng)產(chǎn)生了許多用于研究人類不同疾病的小鼠模型，比如由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程。此類模型被用于dsrna的體內(nèi)測(cè)試，以及用于確定治療上的有效劑量。合適的小鼠模型是例如包含表達(dá)人類apoc3的質(zhì)粒的小鼠。另外的合適的小鼠模型是攜帶一種表達(dá)人類apoc3的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。

獲得自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定與動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可以在配制一系列的用于在人類中使用的劑量方面使用。在本發(fā)明中表征的組合物的劑量總體上處在一個(gè)循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該范圍包括具有很小或沒(méi)有毒性的ed50。該劑量可以取決于所采用的劑型以及利用的給藥途徑而在此范圍內(nèi)變化。對(duì)于任何在本發(fā)明表征的方法中使用的化合物，該治療上有效的劑量可以從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定來(lái)進(jìn)行初始估計(jì)。在動(dòng)物模型中可以將一個(gè)劑量配制為達(dá)到該化合物的循環(huán)血漿濃度范圍，或者當(dāng)適當(dāng)時(shí)，一個(gè)靶標(biāo)序列的多肽產(chǎn)物的循環(huán)血漿濃度范圍(例如，達(dá)到該多肽的一個(gè)降低的濃度)，該范圍包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的ic50(即，測(cè)試化合物實(shí)現(xiàn)癥狀的半最大抑制時(shí)的濃度)。這種信息可以用于更準(zhǔn)確地確定人類中有用的劑量?？梢詼y(cè)量血漿中的水平，例如，通過(guò)高效液相色譜。

在本發(fā)明中表征的dsrna可以與在治療由靶標(biāo)基因表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程方面有效的其他已知試劑聯(lián)合給予。在任何事件中，給藥醫(yī)師可以基于使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的或在此描述的標(biāo)準(zhǔn)的療效測(cè)量而觀察到的結(jié)果來(lái)調(diào)整dsrna給予的量和時(shí)間安排。

給予

本發(fā)明還包括藥物組合物和制劑，它們包括本發(fā)明表征的dsrna化合物。取決于希望局部還是系統(tǒng)性治療以及取決于有待治療的區(qū)域，可以將本發(fā)明的藥物組合物按許多方式給予。給予可以是局部的(包括口腔與舌下)；肺的；例如通過(guò)粉末或氣溶劑的吸入或吹入，包括通過(guò)噴霧器；氣管內(nèi)的；鼻內(nèi)的；表皮的以及經(jīng)皮的、經(jīng)口的或腸胃外的。腸胃外給予包括靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的或肌內(nèi)的注射或輸注；或顱內(nèi)的，例如實(shí)質(zhì)內(nèi)的、鞘內(nèi)的或心室內(nèi)的給予。

該dsrna能以靶向一個(gè)特定組織的方式進(jìn)行遞送。

用于局部給予的藥物組合物以及制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體以及粉末。常規(guī)的藥物載體、水、粉末或油基、增稠劑等等可以是必要的或希望的。包衣的避孕套、手套等等也可以是有用的。合適的局部制劑包括其中本發(fā)明表征的dsrna是與一種局部遞送試劑相混合的那些，該局部遞送試劑比如脂類、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑以及表面活性劑。合適的脂類與脂質(zhì)體包括中性的(例如，二油酰基磷脂?；鵧ope乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿dmpc、二硬脂酰磷酯酰膽堿)、陰離子的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)以及陽(yáng)離子的(例如，二油酰基四甲基氨基丙基dotap以及二油?；字Ｒ掖及穌otma)。本發(fā)明表征的dsrna可以包囊化在脂質(zhì)體中或可以形成與脂質(zhì)體尤其是陽(yáng)離子脂質(zhì)體的復(fù)合物?？商娲?，dsrna可以復(fù)合至脂類，尤其是陽(yáng)離子脂類。合適的脂肪酸與酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蠟酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、酰基肉毒堿、酰基膽堿、或c1-10烷基酯(例如，異丙基肉豆蔻酸酯ipm)、甘油一酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽。局部制劑詳細(xì)描述于美國(guó)專利號(hào)6,747,014中，將其通過(guò)引用結(jié)合于此。

脂質(zhì)體制劑

除了已經(jīng)被研究過(guò)并且用于藥物的配制的微乳劑之外，還存在許多有組織的表面活性劑結(jié)構(gòu)。這些包括單分子層、微粒、雙分子層以及囊泡。囊泡(比如脂質(zhì)體)由于其特異性以及它們從藥物遞送方面所提供的作用持續(xù)時(shí)間而引起人們很大興趣。如在本發(fā)明中所使用的，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”意為一種由以球形雙分子層或雙分子層排列的兩親性分子脂類構(gòu)成的囊泡。

脂質(zhì)體是單層的或多層的囊泡，其具有一個(gè)形成自親脂材料的膜以及一個(gè)水性內(nèi)部。該水性部分包含有待遞送的組合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有能夠融合至細(xì)胞壁的優(yōu)勢(shì)。非陽(yáng)離子脂質(zhì)體盡管不能夠一樣有效地與細(xì)胞壁融合，但是可以被體內(nèi)巨噬細(xì)胞攝取。

為了跨過(guò)完整的哺乳動(dòng)物皮膚，脂類囊泡必須在合適的經(jīng)皮梯度的影響下穿過(guò)一系列的細(xì)孔，每一孔具有小于50nm的直徑。因此，希望的是使用高度可變形并且能夠穿過(guò)這些細(xì)孔的脂質(zhì)體。

脂質(zhì)體的另外的優(yōu)勢(shì)包括：獲得自天然磷脂類的脂質(zhì)體是生物相容性的以及生物可降解的；脂質(zhì)體可以合并廣泛范圍的水以及脂類可溶性藥物；脂質(zhì)體可以保護(hù)包囊化的藥物在其內(nèi)部區(qū)室內(nèi)免于受到代謝與降解(羅索夫,inpharmaceuticaldosageforms(rosoff，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1,245頁(yè))。在制備脂質(zhì)體制劑方面的重要的考慮是脂類表面電荷、囊泡大小以及這些脂質(zhì)體的水性體積。

脂質(zhì)體對(duì)于將活性成分轉(zhuǎn)移以及遞送至作用部位是有用的。因?yàn)橹|(zhì)體膜在結(jié)構(gòu)上類似于生物膜，所以當(dāng)脂質(zhì)體被應(yīng)用至一個(gè)組織時(shí)，這些脂質(zhì)體開(kāi)始與這些細(xì)胞膜合并，并且隨著脂質(zhì)體的合并和細(xì)胞進(jìn)程，這些脂質(zhì)體的內(nèi)容物被排空進(jìn)入該細(xì)胞，在這里活性劑可以起作用。

脂質(zhì)體制劑已經(jīng)作為許多藥品的遞送的模型成為廣泛研究的焦點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，對(duì)于局部給予而言，脂質(zhì)體呈現(xiàn)超出其他制劑的一些優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)包括：減少的與所給予藥物的高系統(tǒng)性吸收相關(guān)的副作用、在希望的靶標(biāo)處所給予藥物的增加的積累、以及將廣泛種類的藥物(親水的與疏水的兩者)給予進(jìn)入皮膚的能力。

一些報(bào)告已經(jīng)詳述了脂質(zhì)體遞送試劑(包括高分子量的dna)進(jìn)入皮膚的能力。已經(jīng)將包括鎮(zhèn)痛藥、抗體、激素以及高分子量dna的化合物給予至皮膚。大多數(shù)的應(yīng)用導(dǎo)致靶向上表皮

脂質(zhì)體有兩個(gè)廣泛的類別。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其與帶負(fù)電荷的dna分子相互作用而形成一種穩(wěn)定的復(fù)合體。該帶正電荷的dna/脂質(zhì)體復(fù)合物結(jié)合至帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面并且內(nèi)化在內(nèi)涵體中。由于該內(nèi)涵體中的酸性ph，這些脂質(zhì)體破裂，釋放其內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(wang(王)等人，biochem.biophys.res.commun.(《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》)，1987,147,980-985)。

ph敏感的或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體捕獲dna而不是與其形成復(fù)合體。由于該dna與該脂類是帶類似的電荷，所以形成排斥而不是復(fù)合。雖然如此，一些dna被捕獲在這些脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中。ph敏感的脂質(zhì)體已經(jīng)用于將編碼胸苷激酶基因的dna遞送至培養(yǎng)中的細(xì)胞單層。在靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到外源基因的表達(dá)(zhou(周)等人，journalofcontrolledrelease(《控釋雜志》)，1992,19,269-274)。

脂質(zhì)體組合物的一個(gè)主要類型包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰膽堿。例如中性脂質(zhì)體組合物可以形成自二肉豆蔻酰磷酸卵磷酯(dmpc)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)。陰離子脂質(zhì)體組合物通?？梢孕纬勺远舛罐ⅤＡ字８视?，而陰離子融合脂質(zhì)體主要形成自二油?；字Ｒ掖及?dope)。另一類型的脂質(zhì)體組合物形成自磷酸卵磷酯(pc)，比如像大豆pc，蛋pc。另一個(gè)類型形成自磷脂和/或磷酸卵磷酯和/或膽固醇的混合物。

一些研究已經(jīng)評(píng)價(jià)了脂質(zhì)體藥物制劑至皮膚的局部遞送。將包含干擾素的脂質(zhì)體應(yīng)用至天竺鼠皮膚導(dǎo)致皮膚皰疹潰瘍的減少，而通過(guò)其他手段的干擾素遞送(例如，作為溶液或作為乳劑)是無(wú)效的(weiner(維納)等人，journalofdrugtargeting(《藥物靶向雜志》)，1992,2,405-410)。此外，另外的研究測(cè)試了作為脂質(zhì)體制劑的一部分而給予的干擾素與使用水性系統(tǒng)而給予的干擾素的療效，并且總結(jié)出該脂質(zhì)體制劑優(yōu)于水性給予(duplessis(杜普利斯)等人，antiviralresearch(《抗病毒研究》)，1992,18,259-265)。

非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)也已經(jīng)得以檢驗(yàn)并確定了它們?cè)谶f送藥物至皮膚方面的實(shí)用性，特別是包括非離子型表面活性劑以及膽固醇的系統(tǒng)。包括novasome^tmi(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及novasome^tmii(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非離子型脂質(zhì)體制劑用于將環(huán)孢霉素a遞送入小鼠皮膚的真皮。結(jié)果表明此類非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)在促進(jìn)環(huán)孢霉素a沉積進(jìn)入皮膚的不同層之內(nèi)方面是有效的(hu(胡)等人，s.t.p.pharma.sci.(《s.t.p.藥物科學(xué)》)，1994,4,6,466)。

脂質(zhì)體還包括“立體化學(xué)穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，這個(gè)術(shù)語(yǔ)如在此使用的指包括一種或多種專門化脂類的脂質(zhì)體，當(dāng)并入脂質(zhì)體中時(shí)這些脂類導(dǎo)致相對(duì)于缺少此類專門化脂類的脂質(zhì)體而言的增加的循環(huán)壽命。立體化學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例是以下那些：在其中該脂質(zhì)體的形成囊泡的脂類部分中的一部分(a)包括一種或多種糖脂，比如單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯gm1，或者(b)是用一種或多種親水聚合物衍生，比如聚乙二醇(peg)部分。雖然不希望受任何具體理論束縛，但是本領(lǐng)域認(rèn)為，至少對(duì)于包含神經(jīng)節(jié)苷酯、鞘磷脂或peg-衍生脂類的立體化學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體而言，這些立體化學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體的增加的循環(huán)半壽期是由于進(jìn)入網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res)細(xì)胞的減少的攝取(allen(阿勒)等人，febsletters,1987,223,42；wu(吳)等人，cancerresearch(《癌癥研究》)，1993,53,3765)。

包括一種或多種糖脂的不同脂質(zhì)體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。papahadjopoulos(帕帕哈都久珀羅斯)等人(ann.n.y.acad.sci.(《紐約科學(xué)院年報(bào)》)，1987,507,64)報(bào)道了單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯gm1、硫酸半乳糖腦苷脂以及磷脂酰肌醇改進(jìn)脂質(zhì)體的血液半衰期的能力。這些發(fā)現(xiàn)由gabizon(噶碧佐)等人(proc.natl.acad.sci.u.s.a.(《美國(guó)科學(xué)院院刊》)，1988,85,6949)詳細(xì)描述。美國(guó)專利號(hào)4,837,028以及wo88/04924(都?xì)w于allen(阿勒)等人)披露了包括以下項(xiàng)的脂質(zhì)體：(1)鞘磷脂以及(2)神經(jīng)節(jié)苷脂gm1或半乳糖腦苷脂硫酸酯。美國(guó)專利號(hào)5,543,152(webb(韋伯)等人)披露了包括鞘磷脂的脂質(zhì)體。包括1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體披露于wo97/13499(lim(利姆)等人)中。

含有由一種或多種親水性聚合物衍生化的脂質(zhì)的許多脂質(zhì)體及其制備方法是本領(lǐng)域已知的。sunamoto(熊本)等人(bull.chem.soc.jpn.(《日本化學(xué)學(xué)會(huì)公報(bào)》)，1980,53,2778)披露了包括非離子型去污劑2c1215g(其包含peg部分)的脂質(zhì)體。illum(艾魯姆)等人(febslett.,1984,167,79)提到，用聚合二醇對(duì)聚苯乙烯顆粒進(jìn)行親水包衣導(dǎo)致血液半衰期的顯著增加。通過(guò)附接聚烯烴基二醇(例如，peg)的羧基基團(tuán)而修飾的合成磷脂由sears(斯?fàn)査?(美國(guó)專利號(hào)4,426,330以及4,534,899)描述。klibanov(克里巴農(nóng)伍)等人(febslett.,1990,268,235)描述了這樣的實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了包括用peg或peg硬脂酸酯衍生化的磷脂酰乙醇胺(pe)的脂質(zhì)體具有顯著增加的血液循環(huán)半衰期。blume(布魯姆)等人(biochimicaetbiophysicaacta(《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》)，1990,1029,91)將這樣的觀察延伸到了其他的peg-衍生的磷脂，例如dspe-peg，形成自二硬脂?；字Ｒ掖及?dspe)以及peg的組合。在其外表面具有共價(jià)鍵合的peg部分的脂質(zhì)體描述于fisher(費(fèi)歇爾)的歐洲專利號(hào)ep0445131b1以及wo90/04384中。含有1-20摩爾百分?jǐn)?shù)的peg衍生化的pe的脂質(zhì)體組合物以及其使用方法描述于woodle(吳德?tīng)?等人(美國(guó)專利號(hào)5,013,556與5,356,633)與martin(馬丁)等人(美國(guó)專利號(hào)5,213,804與歐洲專利號(hào)ep0496813b1)中。包括一些其他的脂類-聚合物軛合物的脂質(zhì)體披露于wo91/05545與美國(guó)專利號(hào)5,225,212(都?xì)w于martin(馬丁)等人)與wo94/20073(zalipsky(扎利平斯基)等人)中。包括peg修飾的神經(jīng)酰胺脂類的脂質(zhì)體描述于wo96/10391(choi(佐伊)等人)中。美國(guó)專利號(hào)5,540,935(miyazaki(宮崎)等人)以及美國(guó)專利號(hào)5,556,948(tagawa(田川)等人)描述了包含peg的脂質(zhì)體，它們可以進(jìn)一步被官能部分在其表面進(jìn)行衍生化。

一些包括核酸的脂質(zhì)體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。thierry(切瑞)等人的wo96/40062披露了用于將高分子量核酸包囊在脂質(zhì)體中的方法。tagawa(田川)等人的美國(guó)專利號(hào)5,264,221披露了蛋白鍵合的脂質(zhì)體并且稱此類脂質(zhì)體的內(nèi)容物可以包括dsrna。rahman(拉哈曼)等人的美國(guó)專利號(hào)5,665,710描述了將寡聚脫氧核苷酸包囊在脂質(zhì)體中的某些方法。love(拉烏)等人的wo97/04787披露了包括靶向raf基因的dsrna的脂質(zhì)體。

傳遞體是又另一種類型的脂質(zhì)體，并且是高度可變形的脂類聚集物，它們是用于藥物遞送媒介物的引人注目的候選者。傳遞體可以描述為脂滴，其是高度可變形從而它們能夠容易地穿過(guò)比該脂滴更小的孔。傳遞體能適應(yīng)在其中使用它們的環(huán)境，例如它們是自優(yōu)化性的(能適應(yīng)皮膚中孔的形狀)、自我修復(fù)性的、頻繁地到達(dá)它們的靶標(biāo)而不片段化，并且通常是自我負(fù)載性的。為了制備傳遞體，可能的是將表面邊緣激活劑(通常是表面活性劑)添加至一種標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體組合物。傳遞體已經(jīng)被用于遞送血清白蛋白至皮膚。傳遞體介導(dǎo)的血清白蛋白的遞送已經(jīng)顯示與包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同樣有效。

表面活性劑在制劑(比如乳劑(包括微乳劑)以及脂質(zhì)體)中有廣泛應(yīng)用。對(duì)許多不同類型的表面活性劑(天然的與合成的)的特性進(jìn)行分類與評(píng)級(jí)的最普通的方法是通過(guò)親水/親油平衡值(hlb)的使用。親水基團(tuán)(也稱作“頭”)的性質(zhì)提供了用于對(duì)在制劑中使用的不同表面活性劑進(jìn)行分類的最有用的手段(rieger,inpharmaceuticaldosageforms(列赫爾，《藥物劑型》)，marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州,1988,285頁(yè))。

如果該表面活性劑分子沒(méi)有離子化，它被分類為一種非離子型表面活性劑。非離子型表面活性劑在藥物與化妝品產(chǎn)品方面有方法應(yīng)用并且能夠在廣泛的ph范圍使用?？傮w上，取決于它們的結(jié)構(gòu)它們的hlb值范圍為從2至大約18。非離子型表面活性劑包括非離子型酯，比如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非離子型烷醇酰胺以及醚(比如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在這一類別中。聚氧乙烯表面活性劑是該非離子型表面活性劑類別中最常用的成員。

如果該表面活性劑分子在其溶解或分散在水中時(shí)攜帶負(fù)電荷，則該表面活性劑被分類為陰離子型。陰離子型表面活性劑包括羧化物(比如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(比如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(比如烷基苯磺酸酯、酰基羥乙基磺酸酯、酰基?；撬狨ヒ约盎腔晁狨?、以及磷酸酯。該陰離子型表面活性劑類別中最重要的成員是烷基硫酸酯以及皂類。

如果該表面活性劑分子在其溶解或分散在水中時(shí)攜帶正電荷，則該表面活性劑被分類為陽(yáng)離子型。陽(yáng)離子型表面活性劑包括季銨鹽以及乙氧基化胺。這些季銨鹽是這一類別的最常用的成員。

如果該表面活性劑分子具有攜帶正電荷或負(fù)電荷的能力，該表面活性劑被分類為兩性型。兩性型表面活性劑包括丙烯酸衍生物、經(jīng)取代的烷基胺、n-烷基甜菜堿以及磷脂。

藥物產(chǎn)品、制劑以及乳劑中表面活性劑的使用已有綜述(rieger,inpharmaceuticaldosageforms(列赫爾，《藥物劑型》)，marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，1988，285頁(yè))。

核酸脂類顆粒

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明表征的apoc3dsrna被完全包囊在脂類制劑中，從而例如形成一種splp、psplp、snalp或其他核酸-脂類顆粒。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“snalp”指一種穩(wěn)定的核酸-脂類顆粒，包括splp。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“splp”指一種核酸-脂類顆粒，其包括包囊在脂類囊泡中的質(zhì)粒dna。snalp與splp典型地包含一種陽(yáng)離子脂類、一種非陽(yáng)離子脂類以及一種阻止該顆粒聚集的脂類(例如，一種peg-脂類軛合物)。snalp與splp對(duì)于合成應(yīng)用是極其有用的，因?yàn)樗鼈冋故境鲈陟o脈內(nèi)(i.v.)注射之后延長(zhǎng)的循環(huán)壽命并且在遠(yuǎn)端部位積累(例如身體在與給予部位分開(kāi)的部位)。splp包括“psplp”，psplp包括一種包囊化的縮合劑-核酸復(fù)合體，如在pct公開(kāi)號(hào)wo00/03683中所提出的。本發(fā)明的顆粒典型地具有大約50nm至大約150nm，更典型地是大約60nm至大約130nm，更典型地是大約70nm至大約110nm，最典型地是大約70nm至大約90nm的平均直徑，并且基本上是無(wú)毒的。另外，當(dāng)出現(xiàn)在本發(fā)明的核酸-脂類顆粒中時(shí)，這些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂類顆粒以及它們的制備方法披露于例如美國(guó)專利號(hào)5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；以及pct公開(kāi)號(hào)wo96/40964中。

在一個(gè)實(shí)施例中，脂類與藥物的比率(質(zhì)量/質(zhì)量比率)(例如，脂類與dsrna的比率)將處于從大約1:1至大約50:1，從大約1:1至大約25:1，從大約3:1至大約15:1，從大約4:1至大約10:1，從大約5:1至大約9:1，或大約6:1至大約9:1的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，脂類與dsrna的比率可以是大約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、或11:1。

總體上，脂類-核酸顆粒被懸浮在一種緩沖液(例如，pbs)中以用于給予。在一個(gè)實(shí)施例中，脂類配制的sirna的ph是在6.8與7.8之間，例如7.3或7.4。重量摩爾滲透壓濃度可以是例如在250mosm/kg與350mosm/kg之間，例如大約300，例如，298、299、300、301、302、303、304、或305。

陽(yáng)離子脂類可以是例如，n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化銨(dodac)、n,n-二硬脂酰-n,n-二甲基溴化銨(ddab)、n-(i-(2,3-二油?；趸?丙基)-n,n,n-三甲基氯化銨(dotap)、n-(i-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)、n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(dodma)、1,2-二亞油基氧基(dilinoleyloxy)-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、l,2-二亞麻基氧基(dilinolenyloxy)-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二亞油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1,2-二亞油基氧基-3-嗎啉代丙烷(dlin-ma)、1,2-二亞油基?；?3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1,2-二亞油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亞油基?；?2-亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1,2-二亞油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化鹽(dlin-tma.cl)、1,2-二亞油基酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化鹽(dlin-tap.cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(n-甲基哌嗪)丙烷(dlin-mpz)、或3-(n,n-二亞油基氨基)-1,2-丙二醇(dlinap)、3-(n,n-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(doap)、1,2-二亞油基氧代-3-(2-n,n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)、l,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-dma)或其類似物、(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八-9,12-二烯)四氫-3ah-環(huán)戊[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-胺(aln100)、(6z,9z,28z,31z)-三十七-6,9,28,31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(mc3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基月桂基)氨基)乙基)(2-羥基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(c12-200或techg1)，或其混合物。該陽(yáng)離子脂類可以占該顆粒中存在的總脂類的從大約20mol％至大約50mol％或大約40mol％。

非陽(yáng)離子脂類可以是一種陰離子脂類或一種中性脂類，包括但不限于：二硬脂酰磷酸卵磷酯(dspc)、二油?；姿崧蚜柞?dopc)、二棕櫚酰磷酸卵磷酯(dppc)、二油?；字８视?dopg)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(dope)、棕櫚酰油酰基磷酸卵磷酯(popc)、棕櫚酰油?；字Ｒ掖及?pope)、二油?；?磷脂酰乙醇胺4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-l-羧酸酯(dope-mal)、二棕櫚酰磷脂?；掖及?dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、16-o-一甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰-2-油?；?磷脂酰乙醇胺(sope)、膽固醇，或其混合物。非陽(yáng)離子脂類(如果包括膽固醇的話)可以占該顆粒中存在的總脂類的從大約5mol％至大約90mol％，大約10mol％，或大約58mol％。

抑制顆粒聚集的軛合脂類可以是例如一種聚乙二醇(peg)-脂類，其包括但不限于peg-peg-(dag)、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神經(jīng)酰胺(cer)，或其混合物。peg-daa軛合物可以是例如peg-二月桂基氧基丙基(ci2)、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(ci4)、peg-二棕櫚基氧基丙基(c16)、或peg-二硬脂酰氧基丙基(c18)。peg軛合物的其他實(shí)例包括peg-cdma(n-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、mpeg2000-dmg(mpeg-二肉豆蔻基甘油(具有平均分子量2,000)以及peg-c-domg(r-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨甲?；?]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)。阻止顆粒聚集的軛合脂類可以占該顆粒中存在的總脂類的從0mol％至大約20mol％，或者大約1.0mol％、1.1mol％、1.2mol％、.13mol％、1.4mol％、1.5mol％、1.6mol％、1.7mol％、1.8mol％、1.9mol％、或2mol％。

在一些實(shí)施例中，核酸-脂類顆粒進(jìn)一步包括膽固醇，該膽固醇例如占該顆粒中存在的總脂類的大約10mol％到大約60mol％或大約48mol％。

在一個(gè)實(shí)施例中，化合物2,2-二亞油基(dilinoleyl)-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊環(huán)可以用于制備脂類-sirna納米顆粒。2,2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊環(huán)的合成描述于2008年10月23日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/107,998中，將其通過(guò)引用結(jié)合于此。

例如，該脂類-sirna顆?？梢园?0％2,2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊環(huán):10％dspc:40％膽固醇:10％peg-c-domg(摩爾百分?jǐn)?shù))，顆粒大小在63.0±20nm，并且具有0.027sirna/脂類比率。

在仍另一個(gè)實(shí)施例中，1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基月桂基)氨基)乙基)(2-羥基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(techg1)可以用于制備脂類-sirna顆粒。例如，該dsrna可以被配制在一種脂類制劑中，該脂類制劑包括tech-g1、二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、膽固醇以及mpeg2000-dmg，摩爾比率是50:10:38.5:1.5，總脂類與sirna的比率是7:1(wt:wt)。

在一個(gè)實(shí)施例中，脂類樣物質(zhì)(lipidoid)nd98·4hcl(mw1487)、膽固醇(sigma-aldrich公司)、以及peg-神經(jīng)酰胺c16(avantipolarlipids公司)可以用于制備脂類-sirna納米顆粒(即，lnp01顆粒)。lnp01制劑描述于國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)wo2008/042973中，將其通過(guò)引用特此結(jié)合。

另外的示例性制劑描述于表a中。

表a

包含snalp(l,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma))的制劑描述于2009年4與15日提交的國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo2009/127060中，通過(guò)引用將其結(jié)合于此。

包括xtc的制劑描述于例如以下各項(xiàng)中：2009年1月29日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/148,366；2009年3月2日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/156,851；2009年6月10日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)；2009年7月24日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/228,373；2009年9月3日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/239,686，以及2010年1月29日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2010/022614，將其通過(guò)引用特此結(jié)合。

包括mc3的制劑描述于例如以下各項(xiàng)中：2009年9月22日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/244,834，2009年6月10日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/185,800，以及2010年6月10日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us10/28224，將其通過(guò)引用特此結(jié)合。

包括alny-100的制劑描述于例如以下中：2009年11月10日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)杙ct/us09/63933，將其通過(guò)引用特此結(jié)合。

包括c12-200的制劑描述于例如以下各項(xiàng)中：2009年5月5日提交的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)61/175,770以及2010年5月5日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us10/33777，將其通過(guò)引用特此結(jié)合。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)或非擠出方法制備的制劑可以按類似的方式來(lái)表征。例如，制劑典型地通過(guò)視覺(jué)檢查來(lái)進(jìn)行表征。它們應(yīng)該是發(fā)白的半透明溶液，無(wú)聚集物或沉淀。脂類納米顆粒的顆粒大小與顆粒大小分布可以使用例如malvernzetasizernanozs(malvern公司，usa)通過(guò)光散射來(lái)進(jìn)行測(cè)量。顆粒應(yīng)該是大約20-300nm，比如40-100nm大小。顆粒大小分布應(yīng)該是單峰。制劑中的總sirna濃度以及捕獲的片段是使用染料排除測(cè)定來(lái)評(píng)估?？梢詫⑴渲频膕irna的樣品在一種制劑擾亂性表面活性劑(例如，0.5％triton-x100)的存在或不存在下與rna結(jié)合染料(比如ribogreen(molecularprobes公司))一起孵育。該配制品中的總sirna可以通過(guò)來(lái)自包含該表面活性劑的樣品的信號(hào)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定。該捕獲的片段是通過(guò)將“游離”sirna內(nèi)含物(如通過(guò)在表面活性劑不存在下的信號(hào)所測(cè)量的)從該總sirna內(nèi)含物中減去來(lái)確定。捕獲的sirna的百分?jǐn)?shù)典型地是>85％。對(duì)于snalp制劑而言，顆粒大小是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。合適的范圍典型地是大約至少50nm至大約至少110nm、大約至少60nm至大約至少100nm、或大約至少80nm至大約至少90nm。

用于口服給予的組合物與制劑包括粉末或顆粒劑、微粒劑、納米顆粒劑、在水或非水性介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或迷你片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或結(jié)合劑可以是希望的。在一些實(shí)施例中，口服制劑是以下那些：在其中本發(fā)明所表征的dsrna與一種或多種穿透促進(jìn)劑表面活性劑以及螯合劑結(jié)合地給予。合適的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。合適的膽汁酸/鹽包括鵝脫氧膽酸(cdca)以及烏索脫氧膽酸(udca)、膽酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、葡糖膽酸、甘油膽酸、甘油脫氧膽酸、?；悄懰帷⑴；敲撗跄懰?、牛磺-24,25-二氫-梭鏈孢酸鈉以及甘油二氫梭鏈孢酸鈉。合適的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蠟酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、一種酰基肉毒堿、一種?；憠A、或一種甘油一酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽(例如鈉鹽)。在一些實(shí)施例中，穿透促進(jìn)劑的組合(例如脂肪酸/鹽)是與膽汁酸/鹽組合使用。一個(gè)示例性的組合是月桂酸、羊蠟酸以及udca的鈉鹽。另外的穿透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發(fā)明表征的dsrna可以口服遞送，以包括噴霧干燥顆粒的顆粒劑的形式遞送，或者復(fù)合成微顆?；蚣{米顆粒。dsrna復(fù)合劑包括聚-氨基酸；聚亞胺；聚丙烯酸脂；聚烷基丙烯酸酯、聚氧雜環(huán)丁烷(polyoxethanes)、聚烷基氰基丙烯酸脂；陽(yáng)離子化的明膠劑、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(peg)與淀粉；聚烷基氰基丙烯酸脂；deae-衍生的聚亞胺、支鏈淀粉、纖維素與淀粉。合適的復(fù)合劑包括殼聚糖、n-三甲基殼聚糖、聚-l-賴氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯p(tdae)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、deae-異丁烯酸酯、deae-己基丙烯酸酯、deae-丙烯酰胺、deae-白蛋白與deae-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(d,l-乳酸)、聚(dl-乳酸-共-乙醇酸(plga)、藻朊酸鹽、以及聚乙二醇(peg)。dsrna的口服制劑以及它們的制備詳述于美國(guó)專利6,887,906、美國(guó)公開(kāi)號(hào)20030027780以及美國(guó)專利號(hào)6,747,014中，將其各自通過(guò)引用結(jié)合于此。

用于腸胃外、實(shí)質(zhì)內(nèi)(進(jìn)入腦)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)或肝內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括無(wú)菌水溶液，其也可以包含緩沖液、稀釋劑及其他適當(dāng)?shù)奶砑觿?，例如但不限于：穿透促進(jìn)劑、載體化合物及其他藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑以及含脂質(zhì)體制劑。這些組合物可以產(chǎn)生自多種組分，這些組分包括但不限于預(yù)成形的液體、自乳化固體以及自乳化半固體。特別優(yōu)選的是當(dāng)治療肝臟病癥(比如肝癌)時(shí)靶向肝臟的制劑。

本發(fā)明的藥物制劑(可以方便地以單位劑型存在)可以根據(jù)醫(yī)藥工業(yè)內(nèi)熟知的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。此類技術(shù)包括以下這樣的步驟：將這些活性成分與該(這些)藥物載體或賦形劑進(jìn)行聯(lián)合?？傮w而言，這些制劑是通過(guò)以下步驟來(lái)制備：使這些活性成分與液體載體或精細(xì)分散的固體載體或它們兩者均勻地且精細(xì)地聯(lián)合，并且如果需要，進(jìn)而將產(chǎn)品成形。

本發(fā)明的組合物可以被配制為許多可能的劑型中的任一者，這些劑型比如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟膠囊、栓劑以及灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以被配制為在水性或非水性介質(zhì)或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可以進(jìn)一步包含增加該懸浮液的粘度的物質(zhì)，這樣的物質(zhì)包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。該懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。

乳劑

本發(fā)明的組合物可以被制備或配制為乳劑。乳劑典型地是一種液體以液滴形式(通常直徑超過(guò)0.1μm)分散在另一種中的非均勻系統(tǒng)(idson,inpharmaceuticaldosageforms(idson，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，199頁(yè)；rosoff,inpharmaceuticaldosageforms(rosoff，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，245頁(yè)；blockinpharmaceuticaldosageforms(block《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷2，335頁(yè)；higuchi(希古契)等人，inremington'spharmaceuticalsciences(在《雷明頓氏藥物科學(xué)》中)，mackpublishingco.(麥克出版公司)，easton(伊斯頓)，pa.,1985,301頁(yè))。乳劑通常是雙相的系統(tǒng)，其包含互不混溶的兩個(gè)彼此緊密混合并分散的液相。通常，乳劑可以為油包水(w/o)或水包油(o/w)兩種。當(dāng)水相作為微小液滴細(xì)碎并分散到本體油相中時(shí)，所產(chǎn)生的組合物被稱為油包水(w/o)乳劑。可替代地，當(dāng)油相作為微小液滴細(xì)碎并分散到本體水相中時(shí)，所產(chǎn)生的組合物被稱為水包油(o/w)乳劑。除了分散相和活性藥物外，乳劑還可以含其他組分，活性藥物可以作為在水相、油相中的溶液，或者其自身作為獨(dú)立相。如果需要，也可以存在藥物賦形劑如乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑。藥物乳劑還可以為包括多于兩種相的多重乳劑，比如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情況。此類復(fù)合制劑通常提供某些簡(jiǎn)單的二元乳劑所不具有的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)多重乳劑中的o/w乳劑的各油滴還包有小水滴時(shí)，該多重乳劑形成w/o/w乳劑。同樣地，在油連續(xù)相中穩(wěn)定化的水滴中包封油滴的系統(tǒng)，構(gòu)成o/w/o乳劑。

乳劑具有較小或沒(méi)有熱力學(xué)穩(wěn)定性的特征。通常，乳劑的分散相或不連續(xù)相很好地分散在外相或連續(xù)相中并通過(guò)乳化劑或制劑的粘性保持這種形式。在乳劑狀軟膏基料或膏劑的情況下，乳劑的每個(gè)相都可以為半固體或固體。其他穩(wěn)定乳劑的方式需要使用乳化劑，這些乳化劑可以合并進(jìn)入到乳劑的任意相中。乳化劑可以寬泛地分成四種類型：合成的表面活性劑、天然存在的乳化劑、吸收基料和細(xì)分散的固體(idson,inpharmaceuticaldosageforms(idson，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，199頁(yè))。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)合成的表面活性劑，也即表面活性試劑，在乳劑配制中有廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了綜述(rieger,inpharmaceuticaldosageforms(列赫爾，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，285頁(yè))；idson,inpharmaceuticaldosageforms(idson，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，1988，卷1，199頁(yè))。表面活性劑典型地是兩親性分子，并且包括親水部分和疏水部分。表面活性劑的親水和疏水性的比值定義為親水/親油平衡值(hlb)，它是制劑制備中分類和選擇表面活性劑的有價(jià)值的工具。表面活性劑可以根據(jù)親水基團(tuán)的性質(zhì)被分成不同的類型：非離子型、陰離子型、陽(yáng)離子型和兩性型(rieger,inpharmaceuticaldosageforms(列赫爾，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，285頁(yè))。

乳劑制劑中使用的自然存在的乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂和阿拉伯樹膠。吸收基料具有親水特性，所以它們能夠吸收水以形成w/o乳劑并仍然保持它們的半固體稠度，如無(wú)水羊毛脂和親水凡士林。精細(xì)分散的固體也已經(jīng)被用做優(yōu)良的乳化劑，尤其是與表面活性劑組合和在粘性制品中使用。它們包括極性無(wú)機(jī)固體(如重金屬氫氧化物)，不溶脹的粘土(如膨潤(rùn)土、綠坡縷石、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠狀硅酸鋁和膠狀硅酸鎂鋁)，色素和非極性固體(如碳或三硬脂酸甘油酯)。

在乳劑制劑中還包括多種非乳化材料，它們對(duì)乳劑的特性有幫助。這些包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、濕潤(rùn)劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(block,inpharmaceuticaldosageforms(block，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，335頁(yè)；idson,inpharmaceuticaldosageforms(idson，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，199頁(yè))。

親水膠體或水狀膠體包括天然存在的樹膠和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯樹膠、瓊脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳膠、刺梧桐樹膠和皇蓍膠)，纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)和合成的聚合物(如卡波姆膠、纖維素醚和羰基乙烯基聚合物)。這些物質(zhì)在水中分散或膨脹形成膠狀溶液，這些膠狀溶液通過(guò)在分散相小滴的周圍形成強(qiáng)的界面膜并通過(guò)增強(qiáng)外相的粘度來(lái)穩(wěn)定乳劑。

由于乳劑通常包含一些可以容易地支持微生物生長(zhǎng)的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以這些制劑通常含有防腐劑。乳劑制劑中通常使用的防腐劑包括甲基對(duì)羥基苯甲酸酯、丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、季銨鹽、苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸酯和硼酸。通常也將抗氧劑加入到乳劑制劑中，以預(yù)防制劑的變質(zhì)。所使用的抗氧化劑可以為自由基清除劑如生育酚、五倍子酸烷基酯、丁基化的羥基茴香醚，丁基化的羥基甲苯，或還原劑如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉，以及抗氧化劑協(xié)同劑如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂。

乳劑制劑通過(guò)皮膚的、經(jīng)口的和腸胃外途徑的應(yīng)用和它們的生產(chǎn)方法已經(jīng)在文獻(xiàn)(idson,inpharmaceuticaldosageforms(idson，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，199頁(yè))中綜述。因?yàn)榕渲坪?jiǎn)單并且在吸收和生物利用率方面的功效，口服遞送的乳劑制劑已經(jīng)被廣泛使用(rosoff,inpharmaceuticaldosageforms(rosoff，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，245頁(yè)；idson,inpharmaceuticaldosageforms(idson，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，199頁(yè))。基于礦物油的緩瀉藥、油溶性的維生素和高脂肪營(yíng)養(yǎng)制品屬于經(jīng)常作為o/w乳劑口服給予的物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，dsrna與核酸的組合物是配制成微乳劑。微乳劑可以定義為水、油和兩親物的系統(tǒng)，它是單一的光學(xué)各向同性的和熱力學(xué)穩(wěn)定的液體溶液(rosoff,inpharmaceuticaldosageforms(rosoff，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，245頁(yè))。典型地，微乳劑是通過(guò)如下方法制備的系統(tǒng)：首先將油分散到表面活性劑水溶液中，然后加入足量的通常為中等鏈長(zhǎng)度的醇的第四組分而形成透明系統(tǒng)。因此，微乳劑也被描述成由表面活性分子的界面膜穩(wěn)定化的兩種不能混合的液體的熱力學(xué)穩(wěn)定的各向同性的澄清分散系(leung(朗)與shah(紗)，在：controlledreleaseofdrugs:polymersandaggregatesystems(藥物的受控釋放:聚合物和聚集體系統(tǒng))，rosoff,m.(羅索夫,m.)，ed.,1989,vchpublishers(vch出版公司)，紐約，第185-215頁(yè))。通常微乳劑通過(guò)包括油、水、表面活性劑、助表面活性劑和電解液的三至五種組分的組合來(lái)制備。微乳劑是為油包水(w/o)還是水包油(o/w)類型取決于所使用的油和表面活性劑的特性以及表面活性劑分子的極性頭部和羥基尾的結(jié)構(gòu)和幾何包裝(schott(斯科特)，inremington'spharmaceuticalsciences(在《雷明頓氏藥物科學(xué)》中)，mackpublishingco.(麥克出版公司)，easton(伊斯頓)，pa.,1985,p.271)。

利用相圖的現(xiàn)象學(xué)方法已經(jīng)廣泛地得以研究，并且已經(jīng)產(chǎn)生關(guān)于本領(lǐng)域技術(shù)人員如何制備微乳劑的全面知識(shí)(rosoff,inpharmaceuticaldosageforms(rosoff，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，245頁(yè)；block,inpharmaceuticaldosageforms(block，《藥物劑型》)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫爾)與banker(斑克)(編著),1988,marceldekker,inc.(馬塞爾·德克公司)，紐約，紐約州，卷1，335頁(yè))。與常規(guī)乳劑相比，微乳劑提供的優(yōu)點(diǎn)是能將非水溶性藥物溶解到自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的液滴的制劑中。

在微乳劑的制備中使用的表面活性劑包括但不限于單獨(dú)的或與助表面活性劑組合使用的離子表面活性劑、非離子表面活性劑、brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、單月桂酸四甘油酯(ml310)、單油酸四甘油酯(mo310)、單油酸六甘油酯(po310)、五油酸六甘油酯(po500)、單癸酸十甘油酯(mca750)、單油酸十甘油酯(mo750)、一又二分之一油酸十甘油酯(so750)(decaglycerolsequioleate)、十油酸十甘油酯(dao750)。該助表面活性劑通常是短鏈醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通過(guò)滲透到表面活性劑膜中并由此在表面活性劑分子間產(chǎn)生空余空間來(lái)產(chǎn)生無(wú)序膜從而提高界面流動(dòng)性。然而，微乳劑可以不用助表面活性劑進(jìn)行制備，并且無(wú)醇的自乳化微乳劑系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、藥物的水溶液、甘油、peg300、peg400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多種材料，比如captex300、captex355、capmulmcm、脂肪酸酯，中等鏈(c8-c12)的單、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolizedglyceride)，飽和的聚乙二醇化的c8-c10甘油酯、植物油和硅油。

從藥物溶解和增強(qiáng)的藥物吸收方面看，微乳劑是特別令人感興趣的。已經(jīng)提議使用基于脂類的微乳劑(o/w和w/o兩者)以增強(qiáng)包含肽的藥物的口服生物利用度(constantinides等人，pharmaceuticalresearch(《藥物研究》)，1994,11,1385-1390；ritschel,meth.find.exp.clin.pharmacol.(《實(shí)驗(yàn)與臨床藥理學(xué)的方法與發(fā)現(xiàn)》)，1993,13,205)。微乳劑具有以下優(yōu)勢(shì)：改進(jìn)藥物溶解度，保護(hù)藥物不受酶的水解，由于表面活性劑導(dǎo)致的膜流動(dòng)性和滲透性的改變可能增強(qiáng)藥物的吸收，易于制備，容易以固體劑型口服給予，改進(jìn)臨床效能以及降低毒性(constantinides等人，pharmaceuticalresearch(《藥物研究》)，1994,11,1385；ho(侯)等人，j.pharm.sci.(《藥物科學(xué)雜志》)，1996,85,138-143)。通常，微乳劑的成份在環(huán)境溫度下混合在一起時(shí)，它們可以自然形成微乳劑。當(dāng)配制熱不穩(wěn)定的藥物、肽或dsrna時(shí)，這可能是特別有利的。在化妝品和藥物應(yīng)用領(lǐng)域，微乳劑在活性組分的經(jīng)皮遞送中也是有效的。期望的是本發(fā)明的微乳劑組合物和制劑將會(huì)有利于提高dsrna和核酸從胃腸道的全身吸收，并改進(jìn)dsrna和核酸的局部的細(xì)胞攝取。

本發(fā)明的微乳劑還可以包含其他成份和添加劑，如脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(grill3)、labrasol和穿透促進(jìn)劑，以改進(jìn)制劑的特性并增強(qiáng)本發(fā)明的dsrna和核酸的吸收。本發(fā)明的微乳劑中使用的穿透促進(jìn)劑可以分成歸于五大類中的一種：表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合的非表面活性劑(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991,p.92)。每個(gè)類型都已經(jīng)在以上進(jìn)行了討論。

穿透促進(jìn)劑

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明使用了各種穿透促進(jìn)劑以實(shí)現(xiàn)核酸特別是dsrna至動(dòng)物皮膚的有效遞送。多數(shù)藥物以離子化和非離子化的形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或親脂的藥物易于穿過(guò)細(xì)胞膜。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果用穿透促進(jìn)劑處理要穿過(guò)的膜，甚至連非親脂藥物都可以穿過(guò)細(xì)胞膜。除了幫助非親脂藥物擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜外，穿透促進(jìn)劑還增強(qiáng)親脂藥物的滲透性。

穿透促進(jìn)劑可以分成歸于5大類中的一種，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合的非表面活性劑(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991,p.92)。在下面對(duì)每類以上提及的穿透促進(jìn)劑都詳細(xì)進(jìn)行了闡述。

表面活性劑:在本發(fā)明的上下文中，表面活性劑(或“表面活性試劑”)為化學(xué)實(shí)體，當(dāng)其溶解在水溶液中時(shí)，它能降低該溶液的表面張力或者水溶液和另一種液體之間的界面張力，結(jié)果是dsrna通過(guò)粘膜的吸收得到增強(qiáng)。除了膽汁鹽和脂肪酸之外，這些穿透促進(jìn)劑還包括例如月桂醇硫酸鈉、聚氧乙烯基-9-月桂基醚和聚氧乙烯基-20-鯨蠟基醚(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991,p.92)；以及全氟化學(xué)乳劑如fc-43(takahashi(高松)等人，j.pharm.pharmacol.(《藥物藥理學(xué)雜志》)，1988,40,252)。

脂肪酸：作為穿透促進(jìn)劑的各種脂肪酸和它們的衍生物包括，例如油酸、月桂酸、羊蠟酸(正癸酸)、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸酯(1-單油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、羊脂酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、?；舛緣A、酰基膽堿，它們的c1-10烷基酯(如甲基、異丙基和叔丁基)，和它們的甘油單酯和甘油二酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等)(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991,p.92；muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1990,7,1-33；elhariri等人，j.pharm.pharmacol.(《藥物藥理學(xué)》)，1992,44,651-654)。

膽汁鹽：膽汁的生理作用包括促進(jìn)脂類和脂可溶性維生素的分散和吸收(brunton(布魯頓)，chapter38in:goodman&gilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics(古德曼&吉爾曼的《治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)》第38章)，第9版,hardman(哈德曼)等人編著.，mcgraw-hill(麥格勞希爾)，紐約，1996,934-935頁(yè))。各種天然膽汁鹽和它們的合成衍生物作為穿透促進(jìn)劑起作用。因此術(shù)語(yǔ)“膽汁鹽”包括膽汁中天然存在的任意成分和它們的任意合成衍生物。合適的膽汁鹽包括例如膽酸(或其藥學(xué)上可接受的鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、葡糖膽酸(葡糖膽酸鈉)、甘油膽酸(甘油膽酸鈉)、甘油脫氧膽酸(甘油脫氧膽酸鈉)、?；悄懰??；悄懰徕c)、?；敲撗跄懰??；敲撗跄懰徕c)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、烏索脫氧膽酸(udca)、牛磺-24,25-二氫-梭鏈孢酸鈉(stdhf)、甘油二氫梭鏈孢酸鈉和聚氧乙烯-9-月桂基醚(poe)(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991,92頁(yè)；swinyard(斯文亞德)，chapter39in:remington'spharmaceuticalsciences(《雷明頓氏藥物科學(xué)》第19章)，第18版,gennaro,編著,mackpublishingco.(麥克出版公司)，easton(伊斯頓)，pa.,1990，第782-783頁(yè)；muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1990,7,1-33；yamamoto(山本)等人，j.pharm.exp.ther.(《實(shí)驗(yàn)與臨床藥物雜志》)，1992,263,25；yamashita(山本)等人，j.pharm.sci.(《藥物科學(xué)雜志》)，1990,79,579-583)。

螯合劑：所使用的與本發(fā)明有關(guān)的螯合劑可以定義為通過(guò)金屬離子與其形成復(fù)合物將金屬離子從溶液中除去的化合物，結(jié)果是通過(guò)粘膜的dsrna的吸收得到加強(qiáng)。關(guān)于它們?cè)诒景l(fā)明中作為穿透促進(jìn)劑的應(yīng)用，因?yàn)槎鄶?shù)特征化的dna核酸酶需要二價(jià)金屬離子用于催化并且因此可以被螯合劑抑制，螯合劑還具有充當(dāng)dnase抑制劑的附加優(yōu)勢(shì)(jarrett(加熱特)，j.chromatogr.(《色譜學(xué)雜志》)，1993,618,315-339)。合適的螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(edta)、檸檬酸、水楊酸鹽(酯)(如水楊酸鈉、5-甲氧水楊酸酯和高香草酸酯)、膠原質(zhì)的n-?；苌铩⒃鹿鸫季勖?9和β-二酮的n-氨基?；苌?烯胺)(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991,p.92；muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1990,7,1-33；buur(布爾)等人，j.controlrel.,1990,14,43-51)。

非螯合的非表面活性劑：如在此所使用的，非螯合的非表面活性劑穿透促進(jìn)化合物可以定義為這樣的化合物，它們顯示具有不顯著的螯合劑或表面活性劑的活性，但是仍可促進(jìn)dsrna穿過(guò)消化道粘膜的吸收(muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1990,7,1-33)。這類的穿透促進(jìn)劑包括例如不飽和環(huán)脲、1-烷基烷酮衍生物和1-烯基氮雜環(huán)烷酮衍生物(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(《治療性藥物載體系統(tǒng)銳評(píng)》)，1991，第92頁(yè))；以非甾體抗炎劑如雙氯芬酸鈉、引哚美辛和苯丁唑啉(yamashit(山下)等人，j.pharm.pharmacol.(《藥物藥理學(xué)》)，1987,39,621-626)。

載體

本發(fā)明的某些組合物還向制劑中引入了載體化合物。如在此所使用的，“載體化合物”或“載體”可以指核酸或其類似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但卻在體內(nèi)過(guò)程中被認(rèn)為是核酸，能例如通過(guò)降解生物活性的核酸或促進(jìn)其從循環(huán)中的除去而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和載體化合物的共同給予(典型的是后一種物質(zhì)過(guò)量)可以引起肝、腎或其他循環(huán)外臟器中回收的核酸的量大幅度減少，推測(cè)原因是載體化合物和核酸之間競(jìng)爭(zhēng)共有受體。例如，當(dāng)與聚次黃嘌呤核苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞嘧啶核苷酸或4-乙酰胺基-4’異氰硫基-芪-2,2'-二磺酸共同給予時(shí)，部分地硫代磷酸酯的dsrna在肝組織中的回收可以減少(miyao(宮尾)等人，dsrnares.dev.(《dsrna研究與研發(fā)》)，1995,5,115-121；takakura(高倉(cāng))等人，dsrna&nucl.aciddrugdev.(《dsrna&核酸藥物研發(fā)》)，1996,6,177-183)。

賦形劑

與載體化合物相比，“藥物載體”或“賦形劑”是用于向動(dòng)物遞送一種或多種核酸的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或其他任意藥學(xué)上惰性的媒介物。該賦形劑可以是液體或固體，當(dāng)與核酸和特定藥物組合物的其他組分組合時(shí)，參考意欲的給予方式，對(duì)賦形劑進(jìn)行選擇以提供希望的容積、稠度等。典型的藥物載體包括但不限于結(jié)合劑(如預(yù)膠凝的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥基丙基甲基纖維素等)；填料(如乳糖和其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂、滑石、二氧化硅、膠狀二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、還原的植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(如淀粉、淀粉乙醇酸鈉等)；和濕潤(rùn)劑(如月桂基硫酸鈉等)。

適合于非腸胃外給予的、不與核酸發(fā)生有毒反應(yīng)的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)賦形劑也可以用來(lái)配制本發(fā)明的組合物。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受載體包括但不限于：水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。

用于局部給予核酸的制劑可以包括在普通溶劑如醇中的無(wú)菌或非無(wú)菌的水溶液、非水溶液，或在液體或固體油基質(zhì)中的核酸溶液。這些溶液還可以包含緩沖液、稀釋液和其他合適的添加劑?？梢允褂眠m合于非腸胃外給予的、且不與核酸發(fā)生有毒反應(yīng)的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)賦形劑。

適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受賦形劑包括但不限于：水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。

其他組分

本發(fā)明的組合物另外可以包含其他本領(lǐng)域熟知用量的在藥物組合物中常用的輔助組分。因此，例如這些組合物可以包含另外的、可相容的藥學(xué)上有活性的物質(zhì)如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以包含對(duì)本發(fā)明的組合物的各種劑型的物理配制有用的其他物質(zhì)，如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，當(dāng)加入此類物質(zhì)時(shí)，它們不應(yīng)當(dāng)過(guò)度干擾本發(fā)明的組合物的成份的生物活性?？梢詫⑦@些制劑進(jìn)行滅菌并且如果希望的話與助劑如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、鹽混合，用于影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色物質(zhì)、芳香物質(zhì)和/或芬芳物質(zhì)等進(jìn)行混合，這些助劑不與該制劑中的一種或多種核酸發(fā)生有害的相互作用。

水性懸浮液可以包含增加該懸浮液的粘度的物質(zhì)，這樣的物質(zhì)包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。該懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所表征的藥物組合物包括(a)一種或多種dsrna化合物和(b)一種或多種通過(guò)一種非rnai機(jī)制起作用的抗細(xì)胞因子生物制劑。此類生物制劑的實(shí)例包括靶向il1β(例如，阿那白滯素)、il6(塔西單抗)、或tnf(依那西普、英利昔單抗、阿達(dá)木單抗(adlimumab)、或賽妥珠單抗)的生物制劑。

此類化合物的毒性與治療效果可以通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序來(lái)確定，例如以確定ld50(50％群體的致死劑量)以及ed50(在50％群體中治療有效的劑量)。毒性與療效之間的劑量比為治療指數(shù)，并且它可以被表示為比率ld50/ed50。優(yōu)選那些表現(xiàn)出高的治療指數(shù)的化合物。

獲得自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定與動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可以在配制一系列的用于在人類中使用的劑量方面使用。在本發(fā)明中表征的組合物的劑量總體上處在一個(gè)循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該范圍包括具有很小或沒(méi)有毒性的ed50。該劑量可以取決于所采用的劑型以及利用的給予途徑而在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于任何在本發(fā)明表征的方法中使用的化合物，該治療上有效的劑量可以從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定來(lái)進(jìn)行初始估計(jì)。在動(dòng)物模型中可以將一個(gè)劑量配制為達(dá)到該化合物的循環(huán)血漿濃度范圍，或者當(dāng)適當(dāng)時(shí)，一個(gè)靶標(biāo)序列的多肽產(chǎn)物的循環(huán)血漿濃度范圍(例如，達(dá)到該多肽的一個(gè)降低的濃度)，該范圍包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的ic50(即，測(cè)試化合物實(shí)現(xiàn)癥狀的半最大抑制時(shí)的濃度)。這種信息可以用于更準(zhǔn)確地確定人類中有用的劑量?？梢詼y(cè)量血漿中的水平，例如，通過(guò)高效液相色譜。

除了給予它們之外，如在此所討論的，還可以將在本發(fā)明中表征的dsrna與在治療由apoc3表達(dá)介導(dǎo)的病理學(xué)過(guò)程方面有效的其他已知試劑聯(lián)合給予。在任何事件中，給藥醫(yī)師可以基于使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的或在此描述的標(biāo)準(zhǔn)的療效測(cè)量而觀察到的結(jié)果來(lái)調(diào)整dsrna給予的量和時(shí)間安排。

抑制apoc3基因表達(dá)的方法

本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的dsrna和/或包含本發(fā)明的irna的組合物來(lái)減少和/或抑制細(xì)胞中的apoc3表達(dá)的方法。這些方法包括：將該細(xì)胞與本發(fā)明的dsrna進(jìn)行接觸并且維持該細(xì)胞一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得apoc3基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的降解，由此抑制該細(xì)胞中的該apoc3基因的表達(dá)。基因表達(dá)的減少可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估。例如，apoc3的表達(dá)的減少可以通過(guò)如下進(jìn)行確定：使用對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言常規(guī)的方法(rna印跡法、qrt-pcr)來(lái)確定apoc3的mrna表達(dá)水平，使用對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言常規(guī)的方法(蛋白質(zhì)印跡法、免疫技術(shù))來(lái)確定apoc3的蛋白水平，和/或確定apoc3的生物活性，比如對(duì)與甘油三酯水平相關(guān)聯(lián)的一種或多種分子(例如，脂蛋白脂酶(lpl)和/或肝酯酶)的影響、或者在體內(nèi)的背景下甘油三酯其自身水平。

在本發(fā)明的方法中，該細(xì)胞可以在體外或體內(nèi)被接觸，即，該細(xì)胞可以在一個(gè)受試者體內(nèi)。

適合于使用本發(fā)明的方法的治療的細(xì)胞可以是任何表達(dá)apoc3基因的細(xì)胞。適合于在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，靈長(zhǎng)類細(xì)胞(比如人類細(xì)胞或非人類靈長(zhǎng)類細(xì)胞，例如，猴細(xì)胞或黑猩猩細(xì)胞)、非靈長(zhǎng)類細(xì)胞(比如母牛細(xì)胞、豬細(xì)胞、駱駝細(xì)胞、美洲駝細(xì)胞、馬細(xì)胞、山羊細(xì)胞、兔細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、倉(cāng)鼠、豚鼠細(xì)胞、貓細(xì)胞、狗細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、獅子細(xì)胞、老虎細(xì)胞、熊細(xì)胞、或水牛細(xì)胞)、鳥細(xì)胞(例如，鴨細(xì)胞或鵝細(xì)胞)、或鯨細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞是人類細(xì)胞，例如，人類肝細(xì)胞。

apoc3表達(dá)在該細(xì)胞中被抑制至少大約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或大約100％。

本發(fā)明的體內(nèi)方法可以包括將包含dsrna的組合物給予受試者，其中該dsrna包括與有待治療的哺乳動(dòng)物的apoc3基因的rna轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)的一個(gè)核苷酸序列。當(dāng)有待治療的有機(jī)體是哺乳動(dòng)物(比如人類)時(shí)，該組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何手段進(jìn)行給予，這些手段包括但不限于經(jīng)口、腹膜內(nèi)、或腸胃外途徑(包括顱內(nèi)(例如，心室內(nèi)、實(shí)質(zhì)內(nèi)、鞘內(nèi))、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、氣道(氣溶劑)、經(jīng)鼻、直腸以及局部(包括口腔與舌下)給予)。在某些實(shí)施例中，這些組合物是通過(guò)靜脈輸注或注射或皮下注射進(jìn)行給予。

在一些實(shí)施例中，該給予是經(jīng)由積存注射。積存注射可以在一個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)期以連貫的方式釋放該dsrna。因此，積存注射可以減少獲得所希望的效果而需要的給藥的頻率，例如所希望的apoc3的抑制、或療效或預(yù)防效果。積存注射還可以提供更連貫的血清濃度。積存注射包括皮下注射或肌內(nèi)注射。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該積存注射是皮下注射。

在一些實(shí)施例中，該給予是經(jīng)由一個(gè)泵。該泵可以是外部泵或手術(shù)植入的泵。在某些實(shí)施例中，該泵是一個(gè)皮下植入的滲透泵。在其他實(shí)施例中，該泵是一個(gè)輸注泵。輸注泵可以用于靜脈內(nèi)、皮下、動(dòng)脈或硬膜外輸注。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該輸注泵是一個(gè)皮下輸注泵。在其他實(shí)施例中，該泵是一個(gè)手術(shù)植入泵，其遞送該dsrna至肝。

給予的模式取決于是希望局部治療還是系統(tǒng)性治療并且基于有待治療的區(qū)域來(lái)進(jìn)行選擇。給予的途徑與部位可以被選擇為增強(qiáng)靶向。

在一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了用于抑制哺乳動(dòng)物中apoc3基因表達(dá)的方法。這些方法包括將包括靶向該哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中的apoc3基因的dsrna的組合物給予該哺乳動(dòng)物并且維持該哺乳動(dòng)物一段時(shí)間，該時(shí)間足以獲得該apoc3基因的mrna轉(zhuǎn)錄物的降解，由此抑制該apoc3基因在該細(xì)胞中的表達(dá)?；虮磉_(dá)的減少可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法或通過(guò)在此描述的方法(例如qrt-pcr)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。蛋白產(chǎn)物的減少可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法或通過(guò)在此描述的方法(例如elisa)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施例中，穿刺肝臟活組織檢查樣品作為組織材料用于監(jiān)測(cè)apoc3基因和/或蛋白表達(dá)的減少。在其他實(shí)施例中，apoc3基因的表達(dá)的抑制間接地通過(guò)例如確定apoc3途徑中的基因的表達(dá)和/或活性來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，脂蛋白脂酶(lpl)或肝酯酶的活性可以被監(jiān)測(cè)以確定apoc3基因的表達(dá)的抑制。還可以測(cè)量樣品(例如血液或肝樣品)中的甘油三酯水平。apoc3基因的抑制還可以通過(guò)觀察對(duì)升高的甘油三酯水平的臨床表現(xiàn)的影響來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，例如對(duì)過(guò)早慢性心臟病(chd)、出疹性黃瘤、肝脾大以及胰腺炎的影響。合適的測(cè)定在以下實(shí)例部分進(jìn)行進(jìn)一步描述。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療有需要的受試者的方法。本發(fā)明的這些治療方法包括：將本發(fā)明的dsrna給予受試者，例如以一個(gè)治療有效量的靶向apoc3基因的dsrna或包括靶向apoc3基因的dsrna的藥物組合物給予，將會(huì)受益于apoc3表達(dá)的減少和/或抑制的受試者。

可以將本發(fā)明的dsrna以“裸”形式或作為“游離dsrna”進(jìn)行給予。裸dsrna是在藥物組合物不存在下進(jìn)行給予。該裸dsrna可以處在合適的緩沖液中。該緩沖液可以包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽，或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施例中，該緩沖液是磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)?？梢詫揹srna的緩沖液的ph與體積摩爾滲透壓濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得它適合于給予受試者。另外的緩沖液描述于上。

可替代地，可以將本發(fā)明的dsrna作為藥物組合物進(jìn)行給予，比如dsrna脂質(zhì)體制劑。另外的脂質(zhì)體制劑描述于此。

受益于apoc3基因表達(dá)的減少和/或抑制的受試者可以是具有升高的甘油三酯水平(例如，tg>150mg/dl)的那些或者具有嚴(yán)重高甘油三酯血癥(例如，tg>500mg/dl)的那些。在一個(gè)實(shí)施例中，受試者帶有具有功能獲得性突變的apoc3基因變體。在其他實(shí)施例中，該患者具有混合的htg(v型)減少的lpl活性和/或家族性htg(iv)失活的lpl突變和/或組合的增加的apob-100水平。在另一個(gè)實(shí)施例中，該受試者具有失控的伴有急性胰腺炎的高甘油三酯血癥，或者該患者是一個(gè)正在治療的hiv患者，或者該受試者具有高脂肪飲食(餐后高甘油三酯血癥)、或代謝綜合征、或化合物治療(類視黃醇治療)、或胰島素抗性。對(duì)將會(huì)受益于apoc3基因表達(dá)的減少和/或抑制的受試者的治療包括治療性與預(yù)防性治療。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于使用rna或其藥物組合物的方法，例如用于治療將會(huì)受益于apoc3表達(dá)的減少和/或抑制的受試者，該受試者例如是具有升高的甘油三酯水平的受試者，這些方法與其他藥物制劑和/或其他治療方法組合使用，例如與已知的藥物制劑和/或已知的治療方法(比如像目前采用以治療升高的甘油三酯水平的那些)組合使用。例如，在某些實(shí)施例中，將靶向apoc3的dsrna與例如在治療升高的甘油三酯水平中有用的試劑組合地給予。例如，適合于治療將會(huì)受益于apoc3表達(dá)的減少的受試者(例如一個(gè)具有升高的甘油三酯水平的受試者)的合適的另外的治療劑和治療方法包括生活方式與飲食改變、處方級(jí)別的魚油、貝特(fibrates)、鹽酸、apoc3反義、cetp抑制劑、膽汁酸多價(jià)螯合劑、煙酸、hmgcoa還原酶抑制劑、吉非貝齊(gemfibrozil)、非諾貝特(fenofibrate)、膽固醇吸收抑制劑、新霉素、ω-3脂肪酸、等等?？梢詫⒃揹srna以及另外的治療試劑和/或治療在相同時(shí)間和/或在相同組合中進(jìn)行給予，例如非腸胃地，或者可以將該另外的治療試劑作為一種單獨(dú)組合物的部分或在單獨(dú)的時(shí)間和/或通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的或在此描述的另一種方法進(jìn)行給予。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將在此表征的組合物進(jìn)行給予，這樣使得靶標(biāo)apoc3基因的表達(dá)被降低持續(xù)大約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、或24小時(shí)或28、32、或36小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施例中，靶標(biāo)apoc3基因的表達(dá)被降低持續(xù)一個(gè)延長(zhǎng)的持續(xù)期，例如至少大約兩天、三天、四天或更長(zhǎng)，例如大約一周、兩周、三周或四周或更長(zhǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的方法給予dsrna可以導(dǎo)致具有升高的甘油三酯水平的患者的此類疾病或病癥的嚴(yán)重性、體征、癥狀、和/或標(biāo)記減少。在上下文中“減少”意為此水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著減少。該減少可以是例如至少大約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或大約100％。

疾病治療或預(yù)防的效果可以通過(guò)測(cè)量以下項(xiàng)來(lái)進(jìn)行評(píng)估：疾病進(jìn)程、疾病緩和、癥狀嚴(yán)重性、生活質(zhì)量、維持治療效果所需要的藥劑的劑量、疾病標(biāo)記的水平或其他任何適合于正在治療或靶向預(yù)防的一種給定疾病的其他可測(cè)量參數(shù)。通過(guò)測(cè)量任何一個(gè)此類參數(shù)或任何參數(shù)組合來(lái)監(jiān)測(cè)治療或預(yù)防效果，這是在本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，升高的甘油三酯水平的治療的效果可以通過(guò)例如血清甘油三酯水平的周期性測(cè)量來(lái)進(jìn)行評(píng)估。稍后數(shù)據(jù)與初始數(shù)據(jù)的比較為醫(yī)師提供了該治療是否有效的指示。通過(guò)測(cè)量任何一個(gè)此類參數(shù)或任何參數(shù)組合來(lái)檢測(cè)治療或預(yù)防效果，這在本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。關(guān)于給予靶向apoc3的dsrna或其藥物組合物，“有效抵抗”升高的甘油三酯水平表明以臨床上適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行給予會(huì)對(duì)至少統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著量的病人產(chǎn)生有益效果，比如改善的癥狀、治愈、疾病減少、生命延長(zhǎng)、生活質(zhì)量改善、或被熟悉升高甘油三酯水平及相關(guān)原因的醫(yī)生大體上認(rèn)可為是積極的其他影響。

當(dāng)在疾病狀態(tài)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)方面存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改善的時(shí)候，或者通過(guò)使得不能惡化或發(fā)展否則可以被預(yù)期的癥狀，治療或預(yù)防效果是明顯的。作為一個(gè)實(shí)例，在疾病的可測(cè)量參數(shù)方面的至少10％，并且優(yōu)選是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改變，可以指示有效治療。給定的dsrna藥物或該藥物的制劑的效果還可以使用如在本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于該給定疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行判定。當(dāng)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型時(shí)，當(dāng)觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的標(biāo)記或癥狀減少時(shí)治療效果是明顯的。

可替代地，該效果可以基于臨床上接受的疾病嚴(yán)重性分級(jí)量表(比如一個(gè)實(shí)例，肝功能評(píng)分(child-pughscore)，有時(shí)稱作肝功能分級(jí)評(píng)分(child-turcotte-pughscore)),通過(guò)如診斷領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員所確定的疾病嚴(yán)重性的減少來(lái)進(jìn)行測(cè)量。產(chǎn)生例如使用合適的量表而測(cè)量的疾病嚴(yán)重性的減輕的任何積極的改變代表使用如在此描述的dsrna或dsrna制劑的足夠的治療。

可以給予受試者治療量的dsrna，比如大約0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kgdsrna、2.6mg/kgdsrna、2.7mg/kgdsrna、2.8mg/kgdsrna、2.9mg/kgdsrna、3.0mg/kgdsrna、3.1mg/kgdsrna、3.2mg/kgdsrna、3.3mg/kgdsrna、3.4mg/kgdsrna、3.5mg/kgdsrna、3.6mg/kgdsrna、3.7mg/kgdsrna、3.8mg/kgdsrna、3.9mg/kgdsrna、4.0mg/kgdsrna、4.1mg/kgdsrna、4.2mg/kgdsrna、4.3mg/kgdsrna、4.4mg/kgdsrna、4.5mg/kgdsrna、4.6mg/kgdsrna、4.7mg/kgdsrna、4.8mg/kgdsrna、4.9mg/kgdsrna、5.0mg/kgdsrna、5.1mg/kgdsrna、5.2mg/kgdsrna、5.3mg/kgdsrna、5.4mg/kgdsrna、5.5mg/kgdsrna、5.6mg/kgdsrna、5.7mg/kgdsrna、5.8mg/kgdsrna、5.9mg/kgdsrna、6.0mg/kgdsrna、6.1mg/kgdsrna、6.2mg/kgdsrna、6.3mg/kgdsrna、6.4mg/kgdsrna、6.5mg/kgdsrna、6.6mg/kgdsrna、6.7mg/kgdsrna、6.8mg/kgdsrna、6.9mg/kgdsrna、7.0mg/kgdsrna、7.1mg/kgdsrna、7.2mg/kgdsrna、7.3mg/kgdsrna、7.4mg/kgdsrna、7.5mg/kgdsrna、7.6mg/kgdsrna、7.7mg/kgdsrna、7.8mg/kgdsrna、7.9mg/kgdsrna、8.0mg/kgdsrna、8.1mg/kgdsrna、8.2mg/kgdsrna、8.3mg/kgdsrna、8.4mg/kgdsrna、8.5mg/kgdsrna、8.6mg/kgdsrna、8.7mg/kgdsrna、8.8mg/kgdsrna、8.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、9.1mg/kgdsrna、9.2mg/kgdsrna、9.3mg/kgdsrna、9.4mg/kgdsrna、9.5mg/kgdsrna、9.6mg/kgdsrna、9.7mg/kgdsrna、9.8mg/kgdsrna、9.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、10mg/kgdsrna、15mg/kgdsrna、20mg/kgdsrna、25mg/kgdsrna、30mg/kgdsrna、35mg/kgdsrna、40mg/kgdsrna、45mg/kgdsrna、或大約50mg/kgdsrna。這些引用值的中間值與范圍也意在成為本發(fā)明的部分。

在某些實(shí)施例中，例如，當(dāng)本發(fā)明的組合物包括如在此描述的dsrna以及脂類時(shí)，可以給予受試者治療量的dsrna，比如大約0.01mg/kg至大約5mg/kg、大約0.01mg/kg至大約10mg/kg、大約0.05mg/kg至大約5mg/kg、大約0.05mg/kg至大約10mg/kg、大約0.1mg/kg至大約5mg/kg、大約0.1mg/kg至大約10mg/kg、大約0.2mg/kg至大約5mg/kg、大約0.2mg/kg至大約10mg/kg、大約0.3mg/kg至大約5mg/kg、大約0.3mg/kg至大約10mg/kg、大約0.4mg/kg至大約5mg/kg、大約0.4mg/kg至大約10mg/kg、大約0.5mg/kg至大約5mg/kg、大約0.5mg/kg至大約10mg/kg、大約1mg/kg至大約5mg/kg、大約1mg/kg至大約10mg/kg、大約1.5mg/kg至大約5mg/kg、大約1.5mg/kg至大約10mg/kg、大約2mg/kg至大約2.5mg/kg、大約2mg/kg至大約10mg/kg、大約3mg/kg至大約5mg/kg、大約3mg/kg至大約10mg/kg、大約3.5mg/kg至大約5mg/kg、大約4mg/kg至大約5mg/kg、大約4.5mg/kg至大約5mg/kg、大約4mg/kg至大約10mg/kg、大約4.5mg/kg至大約10mg/kg、大約5mg/kg至大約10mg/kg、大約5.5mg/kg至大約10mg/kg、大約6mg/kg至大約10mg/kg、大約6.5mg/kg至大約10mg/kg、大約7mg/kg至大約10mg/kg、大約7.5mg/kg至大約10mg/kg、大約8mg/kg至大約10mg/kg、大約8.5mg/kg至大約10mg/kg、大約9mg/kg至大約10mg/kg、或大約9.5mg/kg至大約10mg/kg。這些引用值的中間值與范圍也意在成為本發(fā)明的部分。

例如，可以按以下劑量給予dsrna：大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大約10mg/kg。這些引用值的中間值與范圍也意在成為本發(fā)明的部分。

在其他實(shí)施例中，例如，當(dāng)本發(fā)明的組合物包括如在此描述的dsrna以及n-乙酰半乳糖胺時(shí)，可以給予受試者治療量的dsrna，比如一個(gè)以下的劑量：大約0.1至大約50mg/kg、大約0.25至大約50mg/kg、大約0.5至大約50mg/kg、大約0.75至大約50mg/kg、大約1至大約50mg/mg、大約1.5至大約50mg/kb、大約2至大約50mg/kg、大約2.5至大約50mg/kg、大約3至大約50mg/kg、大約3.5至大約50mg/kg、大約4至大約50mg/kg、大約4.5至大約50mg/kg、大約5至大約50mg/kg、大約7.5至大約50mg/kg、大約10至大約50mg/kg、大約15至大約50mg/kg、大約20至大約50mg/kg、大約20至大約50mg/kg、大約25至大約50mg/kg、大約25至大約50mg/kg、大約30至大約50mg/kg、大約35至大約50mg/kg、大約40至大約50mg/kg、大約45至大約50mg/kg、大約0.1至大約45mg/kg、大約0.25至大約45mg/kg、大約0.5至大約45mg/kg、大約0.75至大約45mg/kg、大約1至大約45mg/mg、大約1.5至大約45mg/kb、大約2至大約45mg/kg、大約2.5至大約45mg/kg、大約3至大約45mg/kg、大約3.5至大約45mg/kg、大約4至大約45mg/kg、大約4.5至大約45mg/kg、大約5至大約45mg/kg、大約7.5至大約45mg/kg、大約10至大約45mg/kg、大約15至大約45mg/kg、大約20至大約45mg/kg、大約20至大約45mg/kg、大約25至大約45mg/kg、大約25至大約45mg/kg、大約30至大約45mg/kg、大約35至大約45mg/kg、大約40至大約45mg/kg、大約0.1至大約40mg/kg、大約0.25至大約40mg/kg、大約0.5至大約40mg/kg、大約0.75至大約40mg/kg、大約1至大約40mg/mg、大約1.5至大約40mg/kb、大約2至大約40mg/kg、大約2.5至大約40mg/kg、大約3至大約40mg/kg、大約3.5至大約40mg/kg、大約4至大約40mg/kg、大約4.5至大約40mg/kg、大約5至大約40mg/kg、大約7.5至大約40mg/kg、大約10至大約40mg/kg、大約15至大約40mg/kg、大約20至大約40mg/kg、大約20至大約40mg/kg、大約25至大約40mg/kg、大約25至大約40mg/kg、大約30至大約40mg/kg、大約35至大約40mg/kg、大約0.1至大約30mg/kg、大約0.25至大約30mg/kg、大約0.5至大約30mg/kg、大約0.75至大約30mg/kg、大約1至大約30mg/mg、大約1.5至大約30mg/kb、大約2至大約30mg/kg、大約2.5至大約30mg/kg、大約3至大約30mg/kg、大約3.5至大約30mg/kg、大約4至大約30mg/kg、大約4.5至大約30mg/kg、大約5至大約30mg/kg、大約7.5至大約30mg/kg、大約10至大約30mg/kg、大約15至大約30mg/kg、大約20至大約30mg/kg、大約20至大約30mg/kg、大約25至大約30mg/kg、大約0.1至大約20mg/kg、大約0.25至大約20mg/kg、大約0.5至大約20mg/kg、大約0.75至大約20mg/kg、大約1至大約20mg/mg、大約1.5至大約20mg/kb、大約2至大約20mg/kg、大約2.5至大約20mg/kg、大約3至大約20mg/kg、大約3.5至大約20mg/kg、大約4至大約20mg/kg、大約4.5至大約20mg/kg、大約5至大約20mg/kg、大約7.5至大約20mg/kg、大約10至大約20mg/kg、或大約15至大約20mg/kg。這些引用值的中間值與范圍也意在成為本發(fā)明的部分。

例如，可以給予受試者治療量的dsrna：比如大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大約50mg/kg。這些引用值的中間值與范圍也意在成為本發(fā)明的部分。

可以通過(guò)靜脈輸注經(jīng)一個(gè)時(shí)期來(lái)給予該dsrna，比如經(jīng)5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或大約25分鐘的時(shí)期。該給予可以例如在一個(gè)常規(guī)基礎(chǔ)上(比如雙周地(即，每?jī)芍?)重復(fù)持續(xù)一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月或更長(zhǎng)。在初始治療方案之后，可以將這些治療以一個(gè)頻繁度更低的基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)行給予。例如，在雙周給予持續(xù)三個(gè)月后，給予可以按每個(gè)月重復(fù)一次，持續(xù)六個(gè)月或一年或更長(zhǎng)。該dsrna的給予可以減少患者的細(xì)胞、組織、血液、尿或其他區(qū)室的apoc3水平至少大約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、39％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少大約99％或更多。

在給予全劑量的dsrna之前，可以給予患者較小的劑量，比如5％輸注反應(yīng)，并且監(jiān)測(cè)不良影響，比如過(guò)敏反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)例中，針對(duì)不想要的免疫刺激作用(比如增加的細(xì)胞因子(例如，tnf-α或inf-α)水平)對(duì)該患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

由于對(duì)apoc3表達(dá)的抑制作用，本發(fā)明組合物或由其制備的藥物組合物可以提高生命質(zhì)量。

除非另外限定，在此所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一個(gè)普通技術(shù)人員普遍理解的具有相同的含義。雖然類似或等同于在此所述的那些的方法和材料可用于本發(fā)明表征的dsrna與方法的實(shí)踐或測(cè)試，在下文仍描述了適合的方法和材料。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利以及其他在此提及的參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用其全文結(jié)合在此。在矛盾的情況下，本發(fā)明說(shuō)明書，包括定義，將占據(jù)主導(dǎo)。此外，材料、方法和實(shí)例僅是示例性的而非旨在是限制性的。

實(shí)例

實(shí)例1.dsrna合成

試劑來(lái)源

當(dāng)本文沒(méi)有專門給出試劑來(lái)源時(shí)，這種試劑可以從分子生物學(xué)試劑的任何供應(yīng)商獲得，其質(zhì)量/純度標(biāo)準(zhǔn)符合分子生物學(xué)應(yīng)用。

sirna合成

使用expedite8909合成儀(appliedbiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，appleradeutschlandgmbh,darmstadt，德國(guó))以及可控多孔玻璃(cpg,proligobiochemiegmbh,hamburg(漢堡)，德國(guó))作為固體支撐，以1μmole的規(guī)模通過(guò)固相合成來(lái)產(chǎn)生單鏈rna。rna與包含2'-o-甲基核苷酸的rna通過(guò)固相合成來(lái)產(chǎn)生，分別采用相應(yīng)的亞磷酰胺以及2'-o-甲基亞磷酰胺(proligobiochemiegmbh,hamburg(漢堡)，德國(guó))。使用標(biāo)準(zhǔn)的核苷亞磷酰胺化學(xué)方法，在寡核苷酸鏈的序列內(nèi)的所選位點(diǎn)上并入這些構(gòu)建單元，所述化學(xué)方法利如描述于currentprotocolsinnucleicacidchemistry(《核酸化學(xué)流行方案》)，beaucage,s.l.(比尤克居,s.l.)等人(edrs.),johnwiley&sons,inc.(約翰威利出版社)，紐約，紐約州，美國(guó)。通過(guò)用beaucage試劑(chruachemltd公司，glasgow(格拉斯哥)，uk)的乙腈溶液(1％)替換碘氧化劑溶液來(lái)引入硫代磷酸酯鍵。其他輔助試劑來(lái)自mallinckrodtbaker公司(griesheim，德國(guó))。

根據(jù)已經(jīng)建立的程序，通過(guò)陰離子交換hplc進(jìn)行粗寡核糖核苷酸的去保護(hù)和純化。使用光譜光度計(jì)(du640b,beckmancoultergmbh,unterschleiβheim，德國(guó))，通過(guò)在260nm波長(zhǎng)處的各個(gè)rna溶液的uv吸收率確定得率和濃度。以如下方法產(chǎn)生雙鏈rna：在退火緩沖液(20mm磷酸鈉，ph6.8；100mm氯化鈉)中混合等摩爾的互補(bǔ)鏈溶液，在85℃-90℃水浴中加熱3分鐘并經(jīng)3-4小時(shí)冷卻到室溫。退火的rna溶液儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

以下使用標(biāo)準(zhǔn)命名，并且特別表b中的縮寫來(lái)表示核酸序列。

表b：縮寫

實(shí)例2：apoc3sirna設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)錄物

進(jìn)行sirna設(shè)計(jì)以鑒別對(duì)ncbi基因庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中注釋的所有的人類與食蟹猴(cynomolgusmonkey，macacafascicularis；此后稱為“cyno”)apoc3轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行靶向的sirna。設(shè)計(jì)使用了以下來(lái)自ncbi：人類-nm_000040.1；cyno-x68359.1的轉(zhuǎn)錄物。所有的與所列的人類和cyno轉(zhuǎn)錄物具有100％一致性的sirna雙鏈體被設(shè)計(jì)。

sirna設(shè)計(jì)、特異性以及效果預(yù)測(cè)

這些sirna是基于預(yù)測(cè)的特異性、預(yù)測(cè)的效果以及gc含量而被選擇。

從每一序列預(yù)測(cè)所有可能的19mers的預(yù)測(cè)特異性。然后對(duì)缺少長(zhǎng)于7核苷酸的重復(fù)的候選19mers進(jìn)行選擇。在針對(duì)人類轉(zhuǎn)錄組(定義為人類ncbirefseq組中的nm_與xm_記錄的組)的全面搜索中使用這171個(gè)候選sirna。

基于該sirna與任何潛在的‘脫靶’轉(zhuǎn)錄物之間的任何數(shù)目的錯(cuò)配的位置計(jì)算出一個(gè)分?jǐn)?shù)，并且將衍生自每一寡核苷酸的3個(gè)不同的、種子(該分子的5'末端的位置2-9)衍生六聚體的七聚體以及八聚體的頻率進(jìn)行比較。兩種sirna鏈被指定為根據(jù)計(jì)算分?jǐn)?shù)的特異性分類：得分高于3為高特異性的、等于3為特異性的，并且在2.2與2.8之間為中等特異性的。我們通過(guò)該反義鏈的特異性進(jìn)行分類。然后我們選擇這樣的雙鏈體：其反義寡核苷酸具有總體低于70％的gc含量，在第一個(gè)位置無(wú)gc，并且不與小鼠apoc3轉(zhuǎn)錄物nm_023114.3匹配。

sirna序列選擇

共計(jì)合成27條正義和27條反義衍生的sirna寡核苷酸并形成雙鏈體。

實(shí)例3.apoc3sirna合成

修飾的與未修飾的apoc3序列的合成

在mermade192合成儀上以1或0.2umol的規(guī)模合成apoc3平鋪序列(apoc3tiledsequence)。

利用未修飾的、2’-o-甲基或2’-氟化學(xué)修飾進(jìn)行單鏈與雙鏈體的制備?；谶@些單鏈中的化學(xué)修飾的性質(zhì)對(duì)合成條件進(jìn)行適當(dāng)修改。

合成、切割與去保護(hù)：

apoc3序列的合成(未修飾的、2’-o-甲基或2’-氟)使用了利用亞磷酰胺化學(xué)作用的固體支撐的寡核苷酸合成。

在96孔板中以1或2um的規(guī)模進(jìn)行以上序列的合成。未修飾的或修飾的(2-o-甲基或2’-氟代)亞酰胺(amidite)溶液被制備為0.1m濃度，并且乙基硫代四唑(0.6m于乙腈中)被用作激活劑。

在96孔板中進(jìn)行合成序列的切割與去保護(hù)，在第一步驟使用氨水或甲胺水溶液并且在第二步驟使用氟化物試劑。使用丙酮:乙醇(80:20)混合物對(duì)粗制序列進(jìn)行沉淀并且將沉淀物重懸浮在0.2m乙酸鈉緩沖液中以將這些粗制單鏈轉(zhuǎn)化為其鈉鹽。將來(lái)自每一序列的樣品通過(guò)lc-ms進(jìn)行分析以確證一致性、uv用于定量并且通過(guò)iex色譜確定純度。

純化與脫鹽：

沉淀apoc3平鋪序列并使用葡聚糖凝膠柱在akta純化系統(tǒng)上(aktapurifiersystem)進(jìn)行純化。該過(guò)程在環(huán)境溫度下運(yùn)行。樣品注射與收集在96孔板(孔深1.8ml)中進(jìn)行。在洗脫液中收集到對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)度序列的一個(gè)單一峰。將脫鹽的apoc3序列針對(duì)濃度(通過(guò)在a260處的uv測(cè)量)以及純度(通過(guò)離子交換hplc)進(jìn)行分析。然后將這些互補(bǔ)單鏈以1:1化學(xué)計(jì)量比率進(jìn)行組合以形成sirna雙鏈體。

表1與2提供了第一組的未修飾與修飾序列。

實(shí)例4.apoc3sirna體外篩選

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：

將hep3b細(xì)胞(atcc公司，manassas(馬納薩斯)，弗吉尼亞州)在37℃在5％co2的氣氛中在rpmi(atcc公司)(補(bǔ)充有10％fbs，鏈霉素以及谷氨酰胺)中培養(yǎng)接近融合，然后通過(guò)胰酶消化從該板釋放。轉(zhuǎn)染通過(guò)以下進(jìn)行：將14.8μl的opti-mem加每孔0.2μl的lipofectaminernaimax(invitrogen公司，carlsbadca.cat#13778-150)與每孔5μl的sirna雙鏈體添加至96孔板并且在室溫孵育15分鐘。然后將包含～2×10⁴hep3b細(xì)胞的抗生素的80μl的完全培養(yǎng)基添加至該sirna混合物。在rna純化之前將細(xì)胞孵育24小時(shí)或120小時(shí)。在10nm與0.1nm最終雙鏈體濃度進(jìn)行單一劑量實(shí)驗(yàn)，并且在10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、0.00001nm最終雙鏈體濃度進(jìn)行劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

使用dynabeadsmrna分離試劑盒(invitrogen公司，部件#：610-12)的總rna分離：

收獲細(xì)胞并且在150μl裂解/結(jié)合緩沖液中進(jìn)行裂解，然后使用eppendorfthermomixer在850rpm混合5分鐘，混合速度在整個(gè)過(guò)程中相同。將十微升磁珠與80μl裂解/結(jié)合緩沖液混合物添加至圓底板中并且混合1分鐘。使用磁性表座捕獲磁珠并且將該上清液除去而不擾動(dòng)這些珠子。使用磁性表座捕獲磁珠并且將該上清液除去而不擾動(dòng)這些珠子。在除去上清液后，將磁珠用150μl清洗緩沖液a(washbuffera)清洗2次并且混合1分鐘。珠子再次被捕獲并且去除上清液。然后將珠子用150μl清洗緩沖液b(washbufferb)進(jìn)行清洗并且除上清液。然后將珠子用150μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)進(jìn)行清洗、捕獲并且除上清液。允許珠子干燥持續(xù)2分鐘。在干燥之后，添加50μl的洗脫緩沖液并且在70℃混合5分鐘。用磁體捕獲珠子持續(xù)5分鐘。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。

使用abi高容量cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(appliedbiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司))，fostercity(福斯特城)，加利福尼亞州,cat#4368813)的cdna合成：

將母混合物(每一反應(yīng)：2μl10×緩沖液、0.8μl25×dntp、2μl隨機(jī)引物、1μl逆轉(zhuǎn)錄酶、1μlrnase抑制劑以及3.2μlh2o)添加至10μl總rna中。使用bio-radc-1000或s-1000熱循環(huán)儀(hercules公司，ca)通過(guò)以下步驟產(chǎn)生cdna：25℃10min、37℃120min、85℃5sec、4℃保持。實(shí)時(shí)pcr：

將2μl的cdna添加至母混合物中，該母混合物在一個(gè)384孔50板(roche(羅氏公司)cat#04887301001)中每一孔包含0.5μlgapdhtaqman探針(appliedbiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)cat#4326317e)、0.5μlapoc3taqman探針(appliedbiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)cat#hs00163644_m1)以及5μllightcycler480探針母混合物(roche(羅氏公司)cat#04887301001)。實(shí)時(shí)pcr在abi7900ht實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(appliedbiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司))上使用δδct(rq)測(cè)定而完成。將每一雙鏈體在兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)染中進(jìn)行測(cè)試并且每一轉(zhuǎn)染以一式兩份進(jìn)行測(cè)定，除非在總結(jié)表中另外指出。

為了計(jì)算相對(duì)倍數(shù)，使用δδct方法分析實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，并且將這些數(shù)據(jù)歸一化為利用以下這樣的細(xì)胞而進(jìn)行的測(cè)定：這些細(xì)胞是轉(zhuǎn)染了10nmad-1955的細(xì)胞，或是模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。使用4參數(shù)擬合模型使用xlfit計(jì)算ic50，并且將ic50歸一化為在相同劑量范圍內(nèi)或至其自身最低劑量轉(zhuǎn)染了ad-1955的細(xì)胞或原初細(xì)胞(cell)。

生存力篩選

在3天、5天時(shí)在hela以及hep3b細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞生存力，接著用100、10、1、0.1、0.01以及0.0001nmsirna進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞在96孔板中以每個(gè)孔中10,000個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行鋪板。每一sirna以一式三份進(jìn)行分析并且將數(shù)據(jù)平均化。靶向plk1與ad-19200的sirna被包括作為生存力損失的陽(yáng)性對(duì)照，而ad-1955作為陰性對(duì)照。plk1與ad-19200導(dǎo)致劑量依賴性的生存力損失。為了測(cè)量生存力，在3、5天之后將20ul的celltiterblue(promega公司)添加至該96孔板的每一孔并且在37℃孵育2小時(shí)。然后將板在560ex/590em在分光光度計(jì)(moleculardevices(分子儀器公司))中進(jìn)行讀數(shù)。將生存力表達(dá)為來(lái)自三個(gè)重復(fù)轉(zhuǎn)染+/-標(biāo)準(zhǔn)差的光單位的平均值。在一些情況中，通過(guò)首先將這三個(gè)重復(fù)轉(zhuǎn)染進(jìn)行平均化并且然后將其歸一化為獲得自最低劑量(0.001nm)的值來(lái)評(píng)估相對(duì)生存力。

這些結(jié)果提供在表3、4和5中。

實(shí)例5：在小鼠中的apoc3體內(nèi)測(cè)試

將靶向apoc3的sirna給予至小鼠，野生型(5.0mg/kg)與轉(zhuǎn)基因高脂血癥模型srebptg/ldlr-/-ko小鼠(1.0mg/kg)。在給予后兩天將小鼠處死并且確定肝靶標(biāo)mrna、血清甘油三酸酯以及血清總膽固醇水平。使用了包含mc3的lnp11制劑。

野生型小鼠的結(jié)果顯示在圖1中。給予靶向apoc3的sirna導(dǎo)致野生型小鼠中mrna水平的敲低，甘油三酯降低50％，并且總膽固醇降低。給予靶向apoc3的sirna導(dǎo)致高脂血癥模型小鼠中甘油三酯降低80％，數(shù)據(jù)未顯示。這些結(jié)果顯示apoc3是基于sirna治療高甘油三酯血癥(包括冠心病冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病(cad)以及胰腺炎)的有效靶標(biāo)。

實(shí)例6：修飾的靶向apoc3的sirna的合成與篩選(第二組)

另外的如表6與表7所描述的修飾的apoc3sirna使用以上描述的方法進(jìn)行合成。umdtdsdt修飾模式是對(duì)每一鏈添加dt-硫代磷酸酯-dt。decaf修飾模式如下：正義鏈——在所有嘧啶上的2’o-甲基，dtsdt/dtdt突出；反義鏈——在種子區(qū)域(位置2-9)中在雙核苷酸基序uu/ua/ug中的任何兩個(gè)位點(diǎn)處修飾‘u’加上在最后3個(gè)核苷酸上(位置17-19)的2’o-甲基加上在位置10-16中的每一‘u’上的2’o-甲基；dtsdt/dtdt突出。fome修飾模式如下：正義鏈——2’f(5’第一堿基)然后與2’ome交替，反義鏈——2’ome(5’第一堿基)，然后與2’f交替。

如上描述地對(duì)在hep3b細(xì)胞中的如表6與表7所描述的sirna進(jìn)行測(cè)定。這些結(jié)果顯示在表8中。

實(shí)例7：修飾的靶向apoc3的sirna的合成與篩選(第三組)

另外的如表9與表10所描述的修飾的apoc3sirna使用以上描述的方法進(jìn)行合成。如以上所述地對(duì)在hep3b細(xì)胞中的該sirna進(jìn)行測(cè)定。這些結(jié)果顯示在表11中。

表1.apoc3sirna(第一組)：未修飾的序列

表2.apoc3修飾的sirna(第一組)序列

小寫字母核苷酸(g、a、u、c)是2’-o-甲基核苷酸；nf(例如，gf、af、uf、cf)是2’-氟核苷酸；s是硫代磷酸酯鍵。

表3：apoc3修飾的sirna(第一組)單一劑量篩選

表4.apoc3修飾的sirna(第一組)ic50數(shù)據(jù)

表5.apoc3修飾的sirna(第一組)生存力

生存力數(shù)據(jù)表達(dá)為相對(duì)于用最低sirna劑量(0.0001nm)治療的細(xì)胞而言的生存力分?jǐn)?shù)。1＝100％生存，0＝100％致死

表6：apoc3sirna(第二組)未修飾的序列以及修飾的sirna的雙鏈體名稱

表7：apoc3修飾的sirna(第二組)序列

表8：細(xì)胞中apoc3修飾的sirna(第二組)的活性

表9：apoc3sirna(第三組)雙鏈體名稱以及修飾的sirna的修飾模式

表10：apoc3修飾的sirna(第三組)序列

表11：細(xì)胞中apoc3修飾的sirna(第三組)的活性

seqidno:1

ncbi參考序列：nm_000040.1，人類載脂蛋白c-iii(apoc3)，mrna