本發(fā)明涉及一種依諾肝素鈉生產(chǎn)方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝素(heparin)是一種天然的抗凝血物質(zhì)，最初是由美國醫(yī)學(xué)生j.mclean于1916年在測定體內(nèi)血促凝血物質(zhì)的效價時，意外地發(fā)現(xiàn)肝的提取物不僅不能促進(jìn)血液凝固，反而阻止凝血，從而發(fā)現(xiàn)了其中含有的肝素，它是由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸組成的一類長鏈多糖。在各國藥典中，肝素僅規(guī)定作為抗凝血藥物。如今已知，肝素具有多種生物活性，可以提供廣泛的臨床應(yīng)用。肝素除了具有抗凝活性及抗血栓活性外，近幾年來還發(fā)現(xiàn)其具有抑制平滑肌細(xì)胞增生、抗炎癥、抗腫瘤等生物活性。

肝素類產(chǎn)品的來源一般是從動物組織（如肝臟、小腸、肺等）中提取，它可以激活抗凝血酶，加速抗凝血酶在凝血連鎖中抑制絲氨酸蛋白酶的速率，從而作為一種抗凝血的藥物被廣泛應(yīng)用。但長期使用會產(chǎn)生許多負(fù)面影響，如出血和誘導(dǎo)血小板減少、骨質(zhì)疏松等副作用。這些缺點(diǎn)限制了肝素在臨床上的應(yīng)用。因此，人們研制出了新型抗凝血藥物，低分子量肝素。這類藥物具有鏈短、結(jié)合部位少，生物利用度高，且半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，因而具有很好的醫(yī)療前景。

依諾肝素鈉屬于低分子肝素，其具有抗血栓作用強(qiáng)、出血危險(xiǎn)性小、生物利用度高，體內(nèi)半衰期長，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，是目前抗血栓、抗凝血的主要治療藥物，其市場占有率達(dá)到肝素類藥物的2/3以上。

依諾肝素鈉的制備方大多采用直接從肝素鈉通過成鹽、酯化、氧化、超濾、干燥等步驟獲得。在生產(chǎn)過程中，起始物料肝素鈉的質(zhì)量對依諾肝素鈉終產(chǎn)品有很大影響，因?yàn)?，肝素鈉的結(jié)構(gòu)與組成復(fù)雜，不同的生物體來源、甚至相同的生物體來源而批次不同，生長環(huán)境不同都會影響其結(jié)構(gòu)和組成，導(dǎo)致其在結(jié)構(gòu)確認(rèn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制上存在一定的不確定性，而原料對后期依諾肝素鈉成品的分子量分布有直接影響，因而從起始原料開始就需要進(jìn)行嚴(yán)格的控制，這樣才能更有效保證產(chǎn)品質(zhì)量。同時，依諾肝素鈉的制備過程一般采用甲醇溶劑，此種二類溶劑毒性大環(huán)境不友好，更重要的是得到的成品經(jīng)甲醇析晶后粒徑很細(xì)且發(fā)膩，過濾操作困難，部分成品殘留在母液之中，影響收率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種依諾肝素鈉生產(chǎn)方法，從原始物料開始（大分子肝素鈉）進(jìn)行特定條件的工藝處理，并選擇合適的溶劑，可以得到滿足歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)的依諾肝素鈉成品，且環(huán)境污染小，收率高，并能高效完美的控制最終所得成品的分子量和效價。

具體包括以下步驟：

（1）肝素鈉預(yù)處理：對肝素鈉進(jìn)行洗脫處理得到肝素鈉精品。

（2）肝素芐索氯銨鹽制備：向步驟（1）得到的肝素鈉精品中加入水中溶解得到肝素鈉水溶液，加入芐索氯銨水溶液，反應(yīng)一段時間后進(jìn)行過濾和烘干得到肝素芐索氯銨鹽。

（3）肝素芐基酯制備：將步驟（2）得到的肝素芐索氯銨鹽加入二氯甲烷，再加入氯化芐，反應(yīng)后用乙醇攪拌沉淀，過濾洗滌干燥。

（4）肝素芐基酯降解：將步驟（3）得到的肝素芐基酯溶解于水中，加入相對于氫氧化鈉水溶液進(jìn)行反應(yīng)，加入乙醇沉淀。

（5）脫色以及冷凍干燥：將步驟（4）得到的產(chǎn)物利用活性炭脫色之后，再利用雙氧水脫色得到的溶液利用乙醇沉淀，分離沉淀，冷凍干燥即得成品。

肝素鈉預(yù)處理的具體步驟如下：將deae改性后的微球勻漿后注入玻璃層析柱，將大分子肝素鈉溶解于乙醇中，溶清后將其注入玻璃層析柱中，注入完畢后將閥門切換至流動相b，將裝填好的肝素鈉用流動相b進(jìn)行沖洗，停止洗脫后，按洗脫要求將a、b兩相調(diào)制適當(dāng)比例開始沖洗層析柱，紫外檢測器監(jiān)測目標(biāo)產(chǎn)物，當(dāng)?shù)谝粋€目標(biāo)產(chǎn)物峰出現(xiàn)時開始收集，至目標(biāo)峰消失后停止收集，第二個目標(biāo)峰棄用，將收集到的目標(biāo)組分加入溶劑進(jìn)行沉淀，最后將沉淀物用水溶解并經(jīng)過濾膜過濾，冷凍干燥得肝素鈉精品。其中，收集的目標(biāo)產(chǎn)物中三糖和五糖序列比值在4-5之間，微球的粒徑為40-60um，流動相a為20mmol/l的tristan-hcl溶液；流動相b為：流動相a組分+1mol/lnacl，肝素鈉精品進(jìn)一步的與芐索氯銨縮合、再與氯化芐酯化后經(jīng)堿降解以及一系列水溶凍干步驟后合成依諾肝素鈉成品。

幾乎所有公開專利對依諾肝素鈉的研究都顯示其分子量會影響到成品效價，但是鮮有研究證明其對成品效價究竟會產(chǎn)生什么樣的影響。申請人通過創(chuàng)造性的研究發(fā)現(xiàn)：依諾肝素鈉的效價只是表象上和分子量具有相關(guān)性，但真正影響其效價的是其結(jié)構(gòu)單元中的多糖序列排布，因?yàn)榕挪纪瑫r會影響到效價和分子量，所以早期人們會理所當(dāng)然的認(rèn)為效價和分子量相關(guān)。

依諾肝素鈉的成品效價指標(biāo)包括fⅹa因子、fⅱa因子及他們的比值大小，申請人通過實(shí)驗(yàn)分離出的多糖片段發(fā)現(xiàn)：fⅹa因子主要受三糖序列控制，而fⅱa因子卻受五糖序列控制，因此只要控制好三糖序列和五糖序列的比率便能完美控制成品的效價。但是現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)在成品制備過程中很難控制二者的比率，原因是大分子肝素鈉（起始物料）中的兩種糖序列的比率及排布具有極度的不規(guī)則性（肝素鈉是由不同生物體提供的，因此不具備質(zhì)量均一性），導(dǎo)致后面的裂解過程雜亂無章，所以最終的結(jié)果就是同一個工藝卻生產(chǎn)出差異較大的成品。為了解決這一問題，申請人將購入的起始物料（大分子肝素鈉）通過特殊的工藝進(jìn)行預(yù)處理，所收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中三糖序列和五糖序列比值在4-5之間，其它不符合要求的組分棄去。再投入合成反應(yīng)中，最終所得成品的分子量及效價均可以被完美的控制。

通過控制上述工藝步驟，對原始物料進(jìn)行預(yù)處理，使目標(biāo)產(chǎn)物中三糖序列和五糖序列比值在4-5之間，能夠高效完美的控制最終所得成品的分子量和效價。

同時，在依諾肝素鈉的制備方法中，現(xiàn)有技術(shù)中通常采用的均是二類溶劑甲醇進(jìn)行酯化降解和脫色后的沉淀，該類溶劑毒性大，環(huán)境不友好，更重要的是申請人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，得到的成品經(jīng)甲醇析晶后粒徑很細(xì)且發(fā)膩，過濾操作困難，部分成品殘留在母液之中，影響收率；利用乙醇代替甲醇作為析晶溶劑，不僅環(huán)境污染小，而且經(jīng)車間放大試驗(yàn)，可操作性強(qiáng)，最主要是在乙醇中析出的中間體肝素芐基酯和成品依諾肝素鈉性狀和可操作性都得到改善，有限解決了難過濾的難題，減輕了環(huán)保壓力，降低了臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)，有助于實(shí)現(xiàn)項(xiàng)目原料藥的大批量生產(chǎn)。

本發(fā)明首先對原料肝素鈉進(jìn)行預(yù)處理，之后進(jìn)行相應(yīng)的成鹽、酯化、降解、脫色以及冷凍干燥，并在酯化降解和脫色后的沉淀步驟中利用乙醇代替現(xiàn)有技術(shù)的甲醇，減少了環(huán)境污染，增加了產(chǎn)品質(zhì)量和可操作性。

具體實(shí)施方式

實(shí)例：

（1）肝素鈉預(yù)處理：將deae（二乙基胺乙基纖維素）改性后的微球（40-60um）按一定比例勻漿后注入玻璃層析柱，壓實(shí)后再用250l純化水進(jìn)行平衡，檢測柱效，達(dá)到要求后平衡結(jié)束。將1.0kg大分子肝素鈉溶解于225l乙醇中，溶清后將其注入玻璃層析柱中，注入完畢后將閥門切換至流動相b。將裝填好的依諾肝素鈉用流動相b進(jìn)行沖洗，將乙醇洗脫干凈，檢測電導(dǎo)率至目標(biāo)值后停止洗脫，耗用流動相b約150l。按洗脫要求將a、b兩相調(diào)制適當(dāng)比例開始沖洗層析柱，紫外檢測器監(jiān)測目標(biāo)產(chǎn)物，當(dāng)?shù)谝粋€目標(biāo)產(chǎn)物峰出現(xiàn)時開始收集，至目標(biāo)峰消失后停止收集，第二個目標(biāo)峰棄用。

流動相a：20mmtris-hcl；流動相b:a+1mnacl；流速：20ml/min；檢測波長：232nm。

將收集到的目標(biāo)組分加入乙醇或甲醇沉淀，最后將沉淀物用純化水溶解并經(jīng)過濾膜過濾，冷凍干燥得肝素鈉精品，與芐索氯銨縮合、再與氯化芐酯化后經(jīng)堿降解以及一系列水溶凍干步驟后合成依諾肝素鈉成品。

通過嚴(yán)格控制上述工藝步驟，對原始物料進(jìn)行預(yù)處理，使目標(biāo)產(chǎn)物中三糖序列和五糖序列比值在4-5之間，能夠高效完美的控制最終所得成品的分子量和效價。

（2）肝素芐索氯銨鹽制備：向步驟（1）得到的肝素鈉精品中加入水中溶解得到肝素鈉水溶液，加入芐索氯銨水溶液，兩種溶液的體積比為：1:2-1:3，反應(yīng)一段時間后進(jìn)行過濾和烘干得到肝素芐索氯銨鹽；

（3）肝素芐基酯制備：將步驟（2）得到的肝素芐索氯銨鹽加入8-12質(zhì)量倍數(shù)的二氯甲烷，加入3-5質(zhì)量倍數(shù)的氯化芐，反應(yīng)后用乙醇攪拌沉淀，過濾洗滌干燥；

（4）肝素芐基酯降解：將步驟（3）得到的肝素芐基酯溶解于水中，加入相對于肝素芐基酯0.1-0.15質(zhì)量倍數(shù)的氫氧化鈉水溶液進(jìn)行反應(yīng)，加入乙醇沉淀；

（5）脫色以及冷凍干燥：將步驟（4）得到的產(chǎn)物利用活性炭脫色之后，再利用雙氧水脫色得到的溶液利用乙醇沉淀，分離沉淀，冷凍干燥即得成品。

先前的具體實(shí)施例是本發(fā)明實(shí)踐的說明。在不脫離本發(fā)明范圍的情況下進(jìn)行的各種改進(jìn)和改變對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的，也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。