本發(fā)明屬于病原分子檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地，涉及桑假尾孢菌rdna及其在桑假尾孢菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：桑污葉病是我國發(fā)病最廣的病害(張?jiān)录荆?975)。發(fā)病危害較嚴(yán)重，且發(fā)病范圍具一定規(guī)模，夏秋開始發(fā)生，持續(xù)至入冬落葉，多發(fā)生于成熟老化的葉片上，嫩葉偶有發(fā)生，該病可使桑葉葉片葉質(zhì)變劣，提早硬化，容易萎凋，不能用作食用桑，也不適于飼養(yǎng)蠶(王向東，2009)。桑污葉病的傳播主要為在病葉組織內(nèi)越冬的菌絲，在自然環(huán)境中越冬的分生孢子活力很差，不足以引起感染；次年越冬菌絲上產(chǎn)生分生孢子，傳播引起初侵染，后在新病斑上又產(chǎn)生分生孢子進(jìn)行再侵染，造成大面積發(fā)病(張?jiān)录荆?975；王衛(wèi)芳等，1994)。而且由于桑園病原菌積累等因素，發(fā)病率會(huì)逐年上升(黃章玉等，2013)。根據(jù)《中華人民共和國年鑒》氣候卷(2015)對(duì)氣候和溫度帶的劃分可知，我國疆域廣闊，南北跨緯度廣，復(fù)雜的地形與降雨量、氣候等共同造成了不同地區(qū)的生態(tài)環(huán)境多樣性。由于各地區(qū)氣候環(huán)境的差異，桑樹病害的種類分布、危害程度、發(fā)病規(guī)律等存在較大差別(夏志松，2005)。部分地區(qū)較獨(dú)特的氣候環(huán)境可能使本地區(qū)的桑樹以及桑樹病害發(fā)作規(guī)律存在一些當(dāng)?shù)鬲?dú)有的特征(林壽康等，1983；陳贊華，2010；杜偉，2011)。如廣東地區(qū)在氣候區(qū)劃上屬于夏熱冬暖地區(qū)，冬季溫度不會(huì)如中國北方或中部長時(shí)間降至零度以下，可以假定在環(huán)境中越冬的桑污葉病分生孢子不會(huì)因寒冷而完全喪失侵染活力(伍紅雨等，2014)。而夏秋季有臺(tái)風(fēng)過境，可能會(huì)擴(kuò)大分生孢子的傳播范圍(唐曉春等，2003)。另外，該地區(qū)的桑樹栽培方式多為灌木形式，這樣種植的桑樹桑葉密度較大，下層葉片不易見光，且空氣流通較小，便于桑污葉病的發(fā)作；加上地氣濕暖，溫度與濕度均較適合病原真菌的生長(姚小英等，2015)。而桑污葉病的病原菌較為單一。目前沒有桑假尾孢菌與同屬的其他菌交叉感染，或跨寄主侵染的報(bào)道，基本可以確定桑污葉病的病原菌為單一的真菌，即桑假尾孢菌。桑污葉病的病征為葉片背面存在灰黑色病斑，而有病斑存在的葉片已不可用于生產(chǎn)使用。因此，在病害出現(xiàn)明顯癥狀、大規(guī)模爆發(fā)前，檢測(cè)葉片中病原菌的存在及其含量，對(duì)于實(shí)際工作具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有桑污葉病的預(yù)測(cè)監(jiān)控技術(shù)的缺陷和不足，提供一種在桑污葉病出現(xiàn)明顯病癥、病害大規(guī)模爆發(fā)前，檢測(cè)葉片中病原菌的存在及其含量的技術(shù)，進(jìn)而對(duì)桑園葉片等進(jìn)行及時(shí)相應(yīng)的處理。具體是在獲得了桑假尾孢菌rdna全長的基礎(chǔ)上，以18srrna基因和its1區(qū)段為靶基因，設(shè)計(jì)了桑假尾孢菌的特異檢測(cè)引物，可以以病葉、菌絲體、病斑葉片、土壤、枝條等多種樣本的總dna為模板，并且檢測(cè)結(jié)果可靠、易于操作(簡(jiǎn)單快速)、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于桑假尾孢菌的快速檢測(cè)，尤其是侵染早期檢測(cè)和土壤中、枝條上病原菌的快速檢測(cè)，在桑假尾孢菌的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和意義。本發(fā)明的目的是提供一種桑假尾孢菌rdna。本發(fā)明另一目的是提供所述桑假尾孢菌rdna的18srrna序列和its1序列。本發(fā)明再一目的是提供所述桑假尾孢菌rdna、18srrna和its1在桑假尾孢菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明再一目的是提供一組桑假尾孢菌特異性檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種桑假尾孢菌rdna，其核苷酸序列如seqidno.1所示。所述桑假尾孢菌rdna的18srrna，序列如seqidno.2所示。所述桑假尾孢菌rdna的its1，序列如seqidno.3所示。所述桑假尾孢菌rdna、所述18srrna或所述its1在桑假尾孢菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用，或在制備桑假尾孢菌分子檢測(cè)試劑方面的應(yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)?；诒景l(fā)明人對(duì)桑假尾孢菌rdna的研究實(shí)驗(yàn)和針對(duì)性分析總結(jié)，選擇該區(qū)段序列作為檢測(cè)的靶基因，設(shè)計(jì)出一組桑假尾孢菌的特異檢測(cè)引物，包括上游引物w1724f和下游引物w2196r，核苷酸序列分別如seqidno.4和seqidno.5所示。所述引物靈敏、快速、特異性高，依據(jù)本引物可有效地檢測(cè)桑假尾孢菌，尤其是對(duì)侵染早期的檢測(cè)和蠶卵中家蠶微孢子蟲的快速檢測(cè)，具有重要的意義。因此，所述桑假尾孢菌特異性檢測(cè)引物在桑假尾孢菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用或在制備桑假尾孢菌分子檢測(cè)產(chǎn)品方面的應(yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。一種包含有上述桑假尾孢菌特異性檢測(cè)引物的桑假尾孢菌特異性檢測(cè)試劑盒，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，還包括dna提取所需試劑或pcr擴(kuò)增反應(yīng)所需試劑。所述試劑盒的使用方法為：以待測(cè)樣本dna為模板，利用上游引物w1724f和下游引物w2196r進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增dna片段的大小判定結(jié)果；所述判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)為：瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)特異性地473bp的dna片段產(chǎn)物，即樣品中存在有桑假尾孢菌。其中，所述待測(cè)樣本可以為桑葉、菌絲體、土壤、桑枝條等，適用范圍廣。優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系為：其中，2×反應(yīng)緩沖液的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp；優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明首次獲得了桑污葉病病原菌——桑假尾孢菌的rdna全長序列，并對(duì)其進(jìn)行了注釋，確定了桑假尾孢菌的rdna各基因區(qū)段與轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)的核苷酸序列及其在rdna上的位置。并在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)獲得了一組特異性、靈敏性較好的快速檢測(cè)桑假尾孢菌的引物組，該引物可用于桑污葉病的pcr檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確地判斷樣品是否含有桑假尾孢菌，且可為桑葉的健康生產(chǎn)與資源利用提供保證。另外，本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，使用方便。而且適用的pcr擴(kuò)增模板非常多樣，適用范圍廣，可以是多種樣品的dna，病葉、菌絲體、病斑葉片、土壤、枝條等提取的總dna為模板，大大增加了檢測(cè)對(duì)象的范圍。重要的是，本發(fā)明的特異檢測(cè)引物和試劑盒均能夠在病原菌侵染早期就能夠特異性的檢測(cè)出來，為桑污葉病的早期檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單快速的方法，具有很好的實(shí)際推廣應(yīng)用前景。附圖說明圖1為引物its1/its4用于不同材料提取的總dna驗(yàn)證。注：m：takaradl2000marker；各泳道的dna模板提取材料分別為：1.實(shí)驗(yàn)組桑污葉病病葉病斑處的子實(shí)體；2病斑葉片；3.新鮮的發(fā)病病葉；4.老化的病葉；5.腐爛處理的病葉；6.風(fēng)干的病葉；7.破損的病葉風(fēng)干處理；8.破損葉片腐爛處理；泳道9.水(空白對(duì)照)。圖2為引物p1-f/p1-r用于不同材料提取的桑污葉病病原菌dna驗(yàn)證。注：mtakaradl5000marker；各泳道的dna模板提取材料分別為：1.實(shí)驗(yàn)組桑污葉病病葉病斑處的子實(shí)體；2病斑葉片；3.新鮮的發(fā)病病葉；4.老化的病葉；5.腐爛處理的病葉；6.風(fēng)干的病葉；7.破損的病葉風(fēng)干處理；8.破損葉片風(fēng)干處理；泳道9.菌絲體dna(陽性對(duì)照)；泳道10.桑葉dna(陰性對(duì)照)；泳道11.水(空白對(duì)照)。圖3為引物w1724f/w2196r用于不同材料提取的桑污葉病病原菌dna驗(yàn)證。注：mtakaradl2000marker；各泳道的dna模板提取材料分別為：1.實(shí)驗(yàn)組桑污葉病病葉病斑處的子實(shí)體；2病斑葉片；3.新鮮的發(fā)病病葉；4.老化的病葉；5.風(fēng)干的病葉；6.破損的病葉；泳道7.菌絲體dna(陽性對(duì)照)；泳道8.桑葉dna(陰性對(duì)照)；泳道9.水(空白對(duì)照)。圖4為引物w1724f/w2196r的特異性驗(yàn)證。注：m：takaradl2000marker；泳道1-15為特異性測(cè)試；各泳道dna模版分別為：1為桑污葉病子實(shí)體dna；2為cladosporium屬(枝孢霉)；3為penicilliumverruculosum(疣孢青霉)；4為aspergillus屬(曲霉)；5為lecanicilliumpsalliotae(刀孢輪枝菌)；6為phanerinamellea(蜂蜜色蠟質(zhì)菌)；7為.schizophyllumcommune(裂褶菌)；8為candidamucifera(假絲酵母)；9為lasiodiplodiatheobromae(桑根腐病病原菌)；10為pseudomonasaeruginosa(銅綠假單胞菌)；11為phyllactiniamoricola(桑里白粉病病原菌-桑球針殼)；12為ciboriacarunculoides(桑菌核病病原菌-肉阜狀杯盤菌)；13為桑污葉病病原菌dna(陽性對(duì)照)；14為桑樹dna(陰性對(duì)照)；15水(空白對(duì)照)。圖5為引物w1724f/w2196r的靈敏度測(cè)試。注：m：takaradl2000marker；泳道1-6為敏感性測(cè)試；泳道1-6均為梯度稀釋的病原菌dna；濃度分別為：1為30ng/μl；2為3ng/μl；3為3×10-1ng/μl；4為3×10-2ng/μl；5為3×10-3ng/μl；6為3×10-4ng/μl。圖6為帶明顯病斑的桑污葉病桑葉。注：a.桑污葉病病葉葉面；b.桑污葉病病葉葉背；圖中標(biāo)尺為1cm。圖7為回感葉片葉肉組織切片圖。注：圖為葉片橫切面圖，a為下表皮與海綿組織，b為下表皮、海綿組織、柵欄組織等部分，圖中標(biāo)尺為5μm，可見葉片內(nèi)有菌絲生長。圖8為桑園桑樹枝條。注：a為有桑污葉病發(fā)作的桑樹枝條；b為新生的桑樹枝條；圖中標(biāo)尺為1cm。圖9為患病桑樹各部位病原菌存在性檢測(cè)結(jié)果。注：m.takaradl1000marker；各泳道dna模板提取材料分別為：1、2.有病桑枝條；3.無病桑枝條；4、5.回感桑葉；6.有病斑桑葉；泳道7-11為不同梯度濃度的桑污葉病子實(shí)體dna(陽性對(duì)照)，濃度分別為：7為30ng/μl；8為3ng/μl；9為3×10-1ng/μl；10為3×10-2ng/μl；11為3×10-3ng/μl；12.桑樹dna(陰性對(duì)照)；13.無菌水(空白對(duì)照)。圖10為不同來源土壤中桑污葉病病原菌檢測(cè)結(jié)果。注：m.takaradl1000marker；各泳道dna模板提取材料分別為：1.實(shí)驗(yàn)室桑樹種植區(qū)泥土；2.回感實(shí)驗(yàn)區(qū)泥土；3-8為不同地區(qū)發(fā)病桑園的泥土；泳道9-13為不同梯度濃度的桑污葉病子實(shí)體dna(陽性對(duì)照)濃度分別為：9為30ng/μl；10為3ng/μl；11為3×10-1ng/μl；12為3×10-2ng/μl；13為3×10-3ng/μl；泳道14.桑樹dna(陰性對(duì)照)；泳道15.無菌水(空白對(duì)照)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。實(shí)施例1桑假尾孢菌的rdna全長序列獲得1、利用高通量測(cè)序的方法，克隆獲得了桑污葉病病原菌——桑假尾孢菌的rdna全長，如seqidno.1所示。2、根據(jù)測(cè)序結(jié)果的多次確認(rèn)，對(duì)桑假尾孢菌的rdna全長進(jìn)行了注釋，如表所示，確定了桑假尾孢菌的rdna各基因區(qū)段與轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)的核苷酸序列及其在rdna上的位置。表1假尾孢屬菌全rdna序列注釋featurestart(bp)end(bp)length(bp)ets1133233218srrna33320591726its1206022251655.8srrna22262366140its22367251614928srrna251758153298ets258166084268實(shí)施例2檢測(cè)引物設(shè)計(jì)及pcr擴(kuò)增方法的建立1、引物設(shè)計(jì)在獲得桑假尾孢菌rdna全長的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，通過大量的特異性和靈敏性檢測(cè)，最終選取了2對(duì)有代表性的引物組，引物序列如下：p1-f/p1-r引物組上游引物p1-f：5’-gtttcaacgggtaacgggga-3’下游引物p1-r：5’-tccctacctgatccgaggtc-3’w1724f/w2196r引物組上游引物w1724f(seqidno.4)：5’gctacactgacagagccaacg3’下游引物w2196r(seqidno.5)：5’gctacactgacagagccaacg3’。2、pcr擴(kuò)增方法的建立以病葉、枝條、土壤的總dna為模板，用實(shí)施例1所述的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。所述pcr反應(yīng)體系(總體積20μl)：其中，2×taqmastermix(反應(yīng)緩沖液)的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。3、結(jié)果判斷第一對(duì)引物its1/its4(已有的真菌通用檢測(cè)引物)病葉樣品檢測(cè)：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到500-600bp的dna片段判定真菌dna是否提取成功。當(dāng)能擴(kuò)增出500-600bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷總dna提取成功。第二對(duì)引物p1-f/p1-r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到1935bp的dna片段判定樣品中是否含有桑假尾孢菌存在。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出1935bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷樣品中存在桑假尾孢菌。第三對(duì)引物w1724f/w2196r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到473bp的dna片段判定樣品中是否含有桑假尾孢菌存在。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出473bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷樣品中是否含有桑假尾孢菌存在。4.不同材料中病原菌的檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果分別如附圖1～3所示，引物its1/its4能擴(kuò)增植物與真菌的dna，得到結(jié)果均為兩條帶，而引物p1-f/p1-r和引物w1724f/w2196r均能夠特異檢測(cè)到桑假尾孢菌的存在。另外，按照檢測(cè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小適中的原則，引物w1724f/w2196r和建立的pcr方法可以更好的用于桑假尾孢菌的快速檢測(cè)。實(shí)施例3引物w1724f/w2196r的特異性檢測(cè)1、分別以多種從污葉病病斑菌絲體中分離到的真菌和細(xì)菌，以及同為桑樹病原真菌的桑里白粉病病原菌(phyllactiniamoricola)和桑菌核病病原菌(ciboriacarunculoides)作為對(duì)照組，利用引物w1724f/w2196r，以實(shí)施例2的方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。2、引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖4所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌(桑假尾孢菌)dna在目標(biāo)位置(473bp)有條帶。表明該引物組可以特異性的檢測(cè)桑假尾孢菌。實(shí)施例4引物w1724f/w2196r的靈敏性檢測(cè)1、提取桑假尾孢菌的dna，原始濃度為30ng/μl。將上述dna用1×te進(jìn)行稀釋，分別稀釋10、102、103、104、105、106倍。即得到濃度梯度為3.0、3.0×10-1、3.0×10-2、3.0×10-3、3.0×10-4、3.0×10-5ng/μl。2、以上述各濃度的dna為模板，以引物w1724f/w2196r，以實(shí)施例2的方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。3、結(jié)果如圖5所示，引物w1724f/w2196r能檢測(cè)到3.0×10-2ng/μl濃度的病原菌dna，具有很好的檢測(cè)靈敏性。因此，綜上所述，從特異性和靈敏性的角度考慮，只有引物w1724f/w2196r既能夠特異性的檢測(cè)桑假尾孢菌，又具有很好的檢測(cè)靈敏性。以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)引物w1724f/w2196r的檢測(cè)適用性和靈敏性進(jìn)行測(cè)試。實(shí)施例5感染桑假尾孢的桑葉與患病桑葉的病原菌檢測(cè)1、材料的選定選擇的實(shí)驗(yàn)材料，包括患病桑園的枝條，與無病的新鮮紙條；回感實(shí)驗(yàn)葉肉中有菌絲生長的葉片，以及帶病斑的葉片等材料，如附圖6-8所示。2、包含桑樹成分的材料總dna提取使用鼎國植物基因組dna提取試劑盒(lot：69700110)進(jìn)行dna的提取，步驟如下：選取含植物組織材料，使用液氮充分研磨至粉末；1.5ml離心管中加入800μl的lysisbuffer，并添加β-巰基乙醇至終濃度0.1％；加入液氮研磨后的粉末樣品，65℃恒溫金屬浴30分鐘至2小時(shí)；先使用500μl酚/氯仿/異戊醇振蕩混勻5分鐘，后12000r/min離心10分鐘，取上清；加入500μl氯仿，振蕩混勻5分鐘，后12000r/min離心10分鐘，取上清；加入700μl的bindingbuffer，混勻；吸取混合液于離心柱中，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的washingbuffera，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的washingbufferb，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入500μl的washingbufferb，12000r/min，離心1分鐘，棄濾液；再次12000r/min離心2分鐘，棄濾液棄收集管；將離心柱裝入1.5ml離心管中，加入50μltebuffer，室溫放置3分鐘，12000r/min離心2分鐘；重復(fù)上一步驟，即獲得純度較高的總dna。3、pcr檢測(cè)以步驟2得到的各材料提取dna為模板，用特異性引物w1724f/w2196r進(jìn)行pcr反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果如附圖9所示，桑污葉病發(fā)作的桑園的桑枝條與回感實(shí)驗(yàn)葉片中存在菌絲的材料，均可檢測(cè)出病原菌dna的存在。如圖9所示，發(fā)作過桑污葉病的桑樹枝條上檢測(cè)到病原菌dna存在(泳道1、泳道2)，而用作對(duì)照的新鮮桑枝)則未檢測(cè)出病原存在(泳道3)，證明有桑污葉病發(fā)作過的桑園，其桑樹枝條上存在有病原菌。而通過條帶亮度對(duì)比發(fā)現(xiàn)，提取dna時(shí)選用同樣質(zhì)量的材料(桑枝表皮與桑葉)，dna條帶亮度差別不大，說明桑樹枝條上病原菌(泳道1、2)含量不少于葉面帶病斑的桑葉材料(泳道6)，dna濃度介于3ng/μl與30ng/μl之間(泳道7與泳道8)，表明桑枝條上的病原菌數(shù)量是較為可觀的，引發(fā)病害再侵染的可能性接近帶病斑較多的葉片。而回感實(shí)驗(yàn)中處于潛育期的桑葉(泳道4、5號(hào))，條帶亮度與陽性對(duì)照(泳道10)較接近，故猜測(cè)dna濃度應(yīng)在3×10-2ng/μl左右，表明當(dāng)葉片處于潛育期，病原菌數(shù)量較少時(shí)，仍能檢測(cè)到病原菌存在，說明該引物可用于葉片的污葉病病害診斷。由圖9結(jié)果可知，在桑樹病害防控時(shí)，應(yīng)考慮桑樹枝條在病原菌傳播循環(huán)中的作用，在桑園管理時(shí)，應(yīng)做好桑枝條的處理工作。實(shí)施例6患病桑園泥土中的病原菌檢測(cè)1、土壤總dna的提取土壤中真菌dna的提取理念參考林福呈等(2010)的方法，并做修改。步驟如下：采集自不同桑區(qū)的每份的泥土采集量超過10克，對(duì)采集的泥土樣品進(jìn)行充分研磨，去除不能研磨的石籽與沙礫，稱取研磨后的泥土0.5克，采用試劑盒g(shù)enview進(jìn)行dna的提取，提取方法略作改動(dòng)。所用于提取dna的泥土樣品呈粉末狀，不適合使用液氮研磨；且為保證提取dna的含量，使用的樣品量遠(yuǎn)多于試劑盒要求的100mg或30mg，為避免浪費(fèi)試劑盒材料，將對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟略作改動(dòng)。稱取研磨后的泥土0.5克，加入試劑bufferp1體積為1ml，且加入蛋白酶k與rnasea，進(jìn)行水浴消化處理，時(shí)間為65℃3小時(shí)左右，期間不斷震蕩混勻，后加入500μl氯仿，振蕩混勻5分鐘，后12000r/min離心10分鐘，取上清；加入700μl的buffergf2(鹽溶液使dna析出)，混勻；吸取混合液于離心柱中，靜置2分鐘，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的bufferwf1(高濃度乙醇洗去鹽分)，靜置2分鐘，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的bufferwf2(75％乙醇)，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入500μl的bufferwf2，12000r/min，離心1分鐘，棄濾液；再次12000r/min離心2分鐘，棄濾液棄收集管；將離心柱裝入1.5ml離心管中，加入50μl洗脫液elution(溶解dna)，室溫放置5分鐘，12000r/min離心2分鐘；重復(fù)上一步驟，即獲得純度較高的總dna。2、pcr檢測(cè)以步驟1得到的各材料提取dna為模板，用特異性引物w1724f/w2196r進(jìn)行pcr反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果如附圖10所示，桑污葉病發(fā)作的桑園泥土中，均可檢測(cè)出病原菌dna的存在。土壤樣品均為冬季收集，可知桑污葉病的發(fā)病區(qū)土壤中均可提取到桑污葉病病原菌的dna，濃度各有差別；泳道1樣品條帶亮度與泳道12相近，病原菌dna濃度應(yīng)為3×10-2ng/μl左右；泳道2亮度遠(yuǎn)弱于陽性對(duì)照12號(hào)，猜測(cè)病原菌dna濃度應(yīng)略大于3×10-3ng/μl；泳道3條帶亮度與陽性對(duì)照11號(hào)相近，病原菌dna濃度應(yīng)為3×10-1ng/μl左右；泳道4條帶亮度介于陽性對(duì)照(泳道11與12)之間，病原菌dna濃度應(yīng)為3×10-1ng/μl至3×10-2ng/μl之間；泳道5、泳道8條帶稍亮，泳道6、泳道7條帶極弱，表明土壤中分生孢子較少；條帶亮度弱于陽性對(duì)照12號(hào)，病原菌dna濃度應(yīng)低于3×10-2ng/μl，而高于3×10-3ng/μl。sequencelisting<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>桑假尾孢菌rdna及其在桑假尾孢菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用<130><160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>6084<212>dna<213>桑假尾孢菌的rdna全長<400>1cacctgtgtaccggtaaccgccttcgggcgtgactggcgacaggtagcctcctcttgcgg60tggatatgcctcagtattgatgactcgctcgtcaatttcttacgcggacttcactgtgag120gaattcggttgtggcaattggatggcgatttggttaatcgaagggctcacgccccgagag180gagccgttcgccgggtgagcgatcatcccgacctttaactaactctgacctctcgcttcg240gcgttggtcttcaaagatagttacctggttgattctgccagtagtcatatgcttgtctca300aagattaagccatgcatgtctaagtataagcaactatacggtgaaactgcgaatggctca360ttaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacatggataaccgtggtaattcta420gagctaatacatgctaaaaaccccaacttcggaaggggtgtatttattagataaaaaacc480aatgcccttcggggctccttggtgaatcataataacttcacgaatcgcatggccttgcgc540cggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctac600catggtttcaacgggtaacggggaattagggttcgactccggagagggagcctgagaaac660ggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggagg720tagtgacaataaatactgatacagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaat780ttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaatt840ccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgg900gcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactggtccggccgggcctttccttctggg960gagcctcatgcccttcactgggcgtgttggggaaccaggacttttactttgaaaaaatta1020gagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtg1080tggttctattttgttggtttctaggaccaccgtaatgattaatagggacagtcgggggca1140tcagtattccgttgtcagaggtgaaattcttggatttacggaagactaactactgcgaaa1200gcatttgccaaggatgttttcattaatcaggaacgaaagttaggggatcgaagacgatca1260gataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcggtggatgttatcttt1320ttgactccatcggcaccttacgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggtc1380gcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggct1440taatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaagtaggattgacagattg1500agagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgat1560ttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctgctaaatagccaggcccgctt1620tggcgggtcgccggcttcttagagggactatcggctcaagccgatggaagtttgaggcaa1680taacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgacagagcc1740aacgagttcatcaccttggccggaaggtctgggtaatcttgttaaactctgtcgtgctgg1800ggatagagcattgcaattattgctcttcaacgaggaatgcctagtaagcgcatgtcatca1860gcatgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaa1920tggctcagtgaggcctccggactggcccagggaggtcggcaacgaccacccagggccgga1980aagttggtcaaactcggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtctccgtaggtg2040aacctgcggagggatcattactgagtgagggctcacgcccgacctccaaccctttgtgaa2100ccaaacttgttgcttcgggggcgaccctgccgacgactccgtcgccgggcgcccccggag2160gtcttctaaacactgcatctttgcgtcggagtttcaaacaaatgaaacaaaactttcaac2220aacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtga2280attgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctttggtattccg2340aagggcatgcctgttcgagcgtcatttcaccactcaagcctggcttggtattgggcgccg2400cggtgtttccgcgcgcctgaaagtcttccggctgagctgtccgtctctaagcgttgtgga2460tttttcaattcgcttcggagtgcgggcggccgcggccgttaaatctttattcaaaggttg2520acctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaaga2580aaccaacagggattgccctagtaacggcgagtgaagcggcaacagctcaaatttgaaatc2640tggcgtaagcccgagttgtaatttgtagaggatgcttctgggtagcggccggtctaagtt2700ccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtatgtgactggcttgcaccctcca2760cgtagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggaggtaaattt2820cttctaaagctaaataccggccagagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatg2880aaaagcactttggaaagagagttaaaaagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcccgc2940aaccagactttgcggcggtgttcggccggtcttctgaccggtttactcgccgccgtgagg3000ccatcatcgtctgggaccgctggataagacctgaggaatgtagctcccttcggggtgtgt3060tatagcctctggtgatgcagcgcgtctcgggcgaggtccgcgcttcggcaaggatgatgg3120cgtaatggttgtcggcggcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacatctatgcga3180gtgttcgggtgtcaaacccctacgcgtaatgaaagtgaacggaggtgggaactttttgtg3240caccatcgaccgatcctgatgtcctcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggac3300ccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggct3360cgcagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatttgggtataggggcgaaagactaat3420cgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtttccctcaggatagcagtaacgttttca3480gttttatgaggtaaagcgaatgattagaggccttggggttgaaacaaccttaacctattc3540tcaaactttaaatatgtaagaagtccttgttacttagttgaacgtggacatttgaatgta3600ccgttactagtgggccatttttggtaagcagaactggcgatgcgggatgaaccgaacgcg3660aggttaaggtgccggaatatacgctcatcagacaccacaaaaggtgttagttcatctaga3720cagcaggacggtggccatggaagtcggaatccgctaaggagtgtgtaacaactcacctgc3780cgaatgaactagccctgaaaatggatggcgcttaagcgtattacccatacctcgccgcca3840gggtagaaacgatgccctggcgagtaggcaggcgtggaggctcgtgacgaagccttcgga3900gtgatccggggtagaacagcctctagtgcagatcttggtggtagtagcaaatactcaaat3960gagaactttgaggactgaagtggggaaaggttccgtgtgaacagcagttggacacgggtt4020agtcgatcctaagccatagggaagttccgttttaaagtgtgcgctccgcaccgcctggcg4080aaagggaagccggttaacattccggcacctcgatgtggattatccgcggcaacgcaactg4140aaggtggagacgtcggcgggggccccgggaagagttctcttttcttcttaacggtccatc4200accctgaaatcggtttgtccggagctagggtttaacgaccggtagagcggcacacctttg4260tgccgtccggtgcgctcccgacgac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