本發(fā)明屬于從天然原料中提取功能性生物大分子物質(zhì)以生產(chǎn)功能性保健食品領(lǐng)域，具體涉及一種山藥多糖提取方法。

背景技術(shù)：

山藥(薯蕷屬)，大約有600余種品種,其中約有50余種在全球范圍作為農(nóng)作物商業(yè)種植,在潮濕的熱帶地區(qū)為約6000萬(wàn)人每日貢獻(xiàn)200卡路里的能量。自古以來(lái)，山藥就被認(rèn)為具有藥食同源的性質(zhì)，中國(guó)第一部藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》就曾對(duì)山藥的各種藥效予以介紹。山藥在預(yù)防和治療糖尿病方面有很好的效果，對(duì)消化系統(tǒng)病癥有明顯的改善、在增強(qiáng)免疫功能、抗衰老等方面也具有積極的作用。大量研究表明，山藥多糖是山藥的主要活性成分之一，在體內(nèi)，體外都存在生物活性，包括抗氧化性，降血糖，抗腫瘤和提高免疫力等。在食品加工方面，山藥多糖也有很好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有的提取方法大多將山藥干燥成粉，采用水浸提、超聲波破壁技術(shù)、微波破壁技術(shù)、或使用酶類使植物組織細(xì)胞破裂，使多糖易于溶出，之后采取乙醇沉淀的方法。采用熱水浸提的方法成本低，耗時(shí)長(zhǎng)，提取率不高；超聲輔助提取時(shí)間短，效率高，但超聲波有可能使可溶性多糖發(fā)生降解，超聲波設(shè)備價(jià)格高，生產(chǎn)成本高；微波輔助提取高效、加熱均勻，適用于對(duì)熱穩(wěn)定的產(chǎn)物，但是耗電量大、容易破壞多糖結(jié)構(gòu)、有時(shí)會(huì)造成提取物分離困難，設(shè)備上適用于粉狀、顆粒狀等物料，對(duì)原料的狀態(tài)有局限；酶解法能夠有效去除細(xì)胞壁，但由于在溫和條件下進(jìn)行容易發(fā)生雜菌污染，且酶的價(jià)格高，過(guò)量的酶會(huì)引入蛋白質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用超濾濃縮從鮮山藥中提取山藥多糖的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種山藥多糖提取方法，包括如下步驟：

1)以鮮山藥為原料，經(jīng)去皮，切塊；

2)加入提取液，進(jìn)行打漿，獲得山藥勻漿；

3)對(duì)山藥勻漿進(jìn)行離心，得山藥勻漿離心上清液；

4)將山藥勻漿離心上清液過(guò)濾除去淀粉，得濾液；

5)調(diào)節(jié)濾液ph，進(jìn)行磁力攪拌，獲得懸浮液；

6)將懸浮液離心，沉淀山藥蛋白；

7)取上清液調(diào)節(jié)超濾ph、超濾溫度和超濾壓強(qiáng)進(jìn)行超濾；

8)將截留的部分經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后，得到山藥多糖。

所述一種山藥多糖提取方法，步驟2)提取液為ph＝8.5的1％亞硫酸氫鈉溶液；提取液的料液比為提取原料質(zhì)量(g)：提取液體積(ml)＝1：2。

所述一種山藥多糖提取方法，步驟3)的離心條件是將山藥勻漿在6000轉(zhuǎn)、4℃離心20min。

所述一種山藥多糖提取方法，步驟5)調(diào)節(jié)濾液ph＝3.5，磁力攪拌1h，獲得懸浮液。

所述一種山藥多糖提取方法，步驟6)的離心條件是將懸浮液在6000轉(zhuǎn)、4℃離心20min，沉淀山藥蛋白。

所述一種山藥多糖提取方法，步驟7)上清液調(diào)節(jié)超濾ph＝6-8，調(diào)節(jié)超濾溫度20-40℃，調(diào)節(jié)超濾壓強(qiáng)為0.03-0.05mpa，采用分子截留量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾。

所述一種山藥多糖提取方法，調(diào)節(jié)超濾ph＝6，調(diào)節(jié)超濾溫度20℃，調(diào)節(jié)超濾壓強(qiáng)為0.03mpa。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明利用了超濾濃縮法提取山藥多糖，山藥多糖提取率較高，高達(dá)88.69％，比傳統(tǒng)的醇沉法(恒溫濃縮)增加了10.77％，純度提高了5.33％，因此，本方法的山藥多糖提取率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的醇沉法；本方法還利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件、以提高產(chǎn)品的提取率，簡(jiǎn)化提取工藝。此外，還對(duì)所得山藥多糖進(jìn)行了成分測(cè)定、紅外圖譜分析、掃描電鏡分析與抗氧化活性測(cè)定，更系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了所得山藥多糖的特點(diǎn)與功能。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明方法中超濾ph值對(duì)山藥多糖提取率影響。

圖2為本發(fā)明方法中超濾溫度對(duì)山藥多糖提取率影響。

圖3為本發(fā)明方法中超濾壓強(qiáng)對(duì)山藥多糖提取率影響。

圖4(a)為本發(fā)明超濾ph值與超濾溫度對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)面二維圖。

圖4(b)為本發(fā)明超濾ph值與超濾溫度對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)面三維圖。

圖4(c)為本發(fā)明超濾ph值與超濾壓強(qiáng)對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)面二維圖。

圖4(d)為本發(fā)明超濾ph值與超濾壓強(qiáng)對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)面三維圖。

圖4(e)為本發(fā)明超濾溫度與超濾壓強(qiáng)對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)面二維圖。

圖4(f)為本發(fā)明超濾溫度與超濾壓強(qiáng)對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)面三維圖。

圖5為本發(fā)明方法提取山藥多糖的紅外譜圖。

圖6(a)為本發(fā)明方法提取山藥多糖100um掃描電鏡圖。

圖6(b)為本發(fā)明方法提取山藥多糖10um掃描電鏡圖。

圖7為不同濃度的本發(fā)明方法提取山藥多糖和抗壞血酸對(duì)羥基自由基清除率。

圖8為不同濃度的本發(fā)明方法提取山藥多糖和抗壞血酸對(duì)超氧陰離子清除率。

圖9為不同濃度的本發(fā)明方法提取山藥多糖和抗壞血酸對(duì)dpph自由基清除率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不受實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1：超濾提取山藥多糖適宜工作條件的確定

1.操作流程

1)準(zhǔn)確稱取完整新鮮的山藥500g，去皮，切塊。

2)按料液(g/ml)比1：2的比例加入ph＝8.5的1％亞硫酸氫鈉溶液1000ml，進(jìn)行打漿，獲得山藥勻漿。

3)將山藥勻漿在6000轉(zhuǎn)、4℃下離心20min。

4)將上清液過(guò)濾，除去淀粉。

5)取濾液調(diào)節(jié)ph＝3.5，磁力攪拌1h，獲得懸浮液。

6)將懸浮液在6000轉(zhuǎn)、4℃下離心20min，沉淀山藥蛋白。

7)將離心后的上清液調(diào)節(jié)超濾ph至一定值，調(diào)節(jié)超濾壓強(qiáng)至一定值，調(diào)節(jié)超濾溫度至一定值，采用分子截留量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾。

8)將截留的部分經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后，即可得到山藥多糖粉。

2.單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察步驟7)影響超濾輔助提取過(guò)程的主要因素，即超濾ph、超濾溫度、超濾壓強(qiáng)，為探索適宜的工藝參數(shù)依次做單因素實(shí)驗(yàn)。

(1)超濾ph對(duì)提取率的影響：

超濾時(shí)，控制其它因素一定，溫度25℃，壓力0.04mpa。超濾ph試驗(yàn)設(shè)定值：5.0、6.0、7.0、8.0。

(2)超濾溫度對(duì)提取率的影響：

超濾時(shí)，控制其它因素一定，ph為7.0，壓力0.04mpa。超濾溫度試驗(yàn)設(shè)定值：10℃、20℃、30℃、40℃。

(3)超濾壓強(qiáng)對(duì)提取率的影響：

超濾時(shí)，控制其它因素一定，ph為7.0，超濾溫度為25℃，超濾壓強(qiáng)試驗(yàn)設(shè)定值：0.03mpa、0.04mpa、0.05mpa。

結(jié)果如圖1、2、3所示，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，超濾ph值(a)、超濾溫度(b)和超濾壓強(qiáng)(c)3個(gè)變量對(duì)多糖提取率的影響較大，且其較佳值分別為超濾ph＝6.0、超濾溫度＝20℃和超濾壓強(qiáng)＝0.03mpa。利用design-expert8.0.6軟件，選取超濾ph值(a)、超濾溫度(b)和超濾壓強(qiáng)(c)3個(gè)自變量，轉(zhuǎn)換為box-behnken代碼為x1＝(a-6)/10；x1＝(b-20)/10；x3＝(c-0.03)/10，以山藥多糖的提取率(y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平如下表(表1)。

表1box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

實(shí)施例2：超濾提取山藥多糖響應(yīng)面優(yōu)化及分析

試驗(yàn)采用design-expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

(1)試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表2box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

(2)回歸模型方差分析

表3響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析

為了檢查變量，超濾ph值(a)、超濾溫度(b)、超濾壓強(qiáng)(c)，對(duì)于提取率的影響，利用box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。通過(guò)應(yīng)用多元回歸分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),預(yù)測(cè)反應(yīng)y(多糖的提取率)獲得以下方程:

r1＝39.788-2.22a+2.75b-1.44c-1.08ab+1.37ac+1.41bc-3.47a²+0.24b²-1.67c²

響應(yīng)面方差分析的二次模型在表3中提供。高的回歸模型f值(42.30)和低假定值(p<0.0001)表明，模型是非常顯著的。失擬項(xiàng)f值(0.81)表示，相對(duì)于純誤差不顯著。與此同時(shí)，多糖產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，p值(0.5518)不顯著。r²(0.9981)表明模型的高準(zhǔn)確性，并表示此模型可以解釋大部分的因變量的變化。因此，綜合看來(lái)，模型成立，可以對(duì)山藥多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，同時(shí)回歸方程能夠較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)山藥多糖提取率隨著各單因素的變化規(guī)律。

(3)各因素交互作用分析

各因素的交互作用使指兩個(gè)因素在不同水平上呈現(xiàn)出的差異，超濾ph(a)、超濾溫度(b)及超濾壓強(qiáng)(c)各有三個(gè)個(gè)水平，每個(gè)因素的每個(gè)水平在不同單因素上的效應(yīng)都具有區(qū)別，這表示因素之間存在交互作用。采用降維分析法，探討交互式操作變量對(duì)反應(yīng)的影響，確定最優(yōu)水平的每個(gè)變量的最大響應(yīng)。三維響應(yīng)面和二維輪廓響應(yīng)面圖提供了回歸方程的圖形分析，如圖4所示。

從圖4(a)和(b)可知，當(dāng)超濾溫度一定時(shí)，隨著超濾ph的增加，提取率逐漸減少，超濾ph一定時(shí)，隨著超濾溫度的升高提取率先升高后下降，從等高線的圖形和疏密程度可知，超濾ph值和超濾溫度的交互作用明顯。從圖4(c)和(d)可知，當(dāng)ph一定時(shí)，隨著超濾ph的增加，提取率先升高后降低，超濾壓強(qiáng)一定時(shí)，提取率也先升高后降低，從等高線的形狀和疏密程度可知，超濾ph和超濾壓強(qiáng)之間的交互作用較顯著。從圖4(e)和(f)可知，當(dāng)超濾溫度一定時(shí)，隨著超濾壓強(qiáng)的增加，提取率逐漸減少，當(dāng)超濾壓強(qiáng)一定時(shí)，隨著超濾溫度的增加，提取率先增加后降低。從等高線的形狀和疏密程度可知，超濾溫度和超濾壓強(qiáng)之間的交互作用較顯著。

響應(yīng)面優(yōu)化后，得到提取山藥多糖的最佳工藝參數(shù)為超濾ph＝6.5、超濾溫度為20℃、超濾壓強(qiáng)為0.03mpa。在此條件下，所得山藥多糖純度為43.84％，提取率為88.69％(以鮮山藥計(jì))。

實(shí)施例3：山藥多糖成分的測(cè)定

利用國(guó)標(biāo)方法測(cè)得山藥多糖樣品構(gòu)成如表4所示。多糖含量43.84％，蛋白質(zhì)含量18.52％，粗脂肪含量2.52％，粗纖維含量1.28％，水分含量9.62％，灰分含量4.28％。

表4多糖成分組成表

實(shí)施例4：山藥多糖紅外譜圖分析

多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化采用傅立葉變換紅外光譜定性分析。樣本磨成細(xì)粉與kbr混合，光譜被記錄在400和4000cm^-1之間的波數(shù)范圍。(ft/ir3000,jusco,japan)。

山藥多糖的紅外譜圖如圖5所示，通過(guò)對(duì)山藥多糖與其它多糖的紅外譜圖分析對(duì)比，山藥多糖顯示出一般類多糖的特征吸收峰。在指紋區(qū)，在3440cm^-1處能發(fā)現(xiàn)明顯的吸光度，這種現(xiàn)象可以歸結(jié)為氫氧鍵的拉伸所致。在2928cm^-1處展現(xiàn)出吸收峰是碳?xì)滏I拉伸振動(dòng)的顯著標(biāo)志。另一個(gè)特征峰值出現(xiàn)在1638cm^-1處，可以推測(cè)其成因是由為碳氧雙鍵的不對(duì)稱運(yùn)動(dòng)所致。而1410cm^-1處的吸收峰則是因碳氧單鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的。在2950cm^-1處顯示出的峰是碳?xì)滏I的振動(dòng)吸收峰。1150cm^-1處的吸收峰是脂肪醚的碳氧單鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，相近的1080cm^-1處吸收峰，是環(huán)內(nèi)醚的碳氧單鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，這兩個(gè)吸收峰的出現(xiàn)表明多糖中有醚鍵的存在。

實(shí)施例5：山藥多糖掃描電鏡分析

采用zesisevo10掃描電子顯微鏡(carlzeissag,germany)檢測(cè)山藥多糖的形態(tài)學(xué)特征。測(cè)試之前，樣品被固定到帶有導(dǎo)電銀膠的金屬托盤，然后撒上一層黃金粉，放大倍數(shù)為100um和10um。

圖6(a,b)顯示山藥多糖具有外形不規(guī)則的特點(diǎn)，表面凹凸不平，是帶有孔洞的褶皺結(jié)構(gòu)。這說(shuō)明多糖分子間存在排斥力，分子間吸引力較弱。形狀不規(guī)則和褶皺結(jié)構(gòu)均為非晶粉末的表面的典型特征。因此，我們得出的結(jié)論，山藥多糖屬于非晶粉末。此外,提取和純化的方法或產(chǎn)品的準(zhǔn)備也會(huì)影響多糖的形狀，結(jié)構(gòu)或表面。

實(shí)施例6：山藥多糖抗氧化性質(zhì)的測(cè)定

(1)羥基自由基清除率

羥基自由基被認(rèn)為是最有害的活性氧自由基,它們會(huì)影響細(xì)胞中的生物大分子活性。因此，清除羥基自由基對(duì)生命系統(tǒng)的保護(hù)非常重要。山藥多糖和抗壞血酸的羥基自由基清除效果如圖7所示。圖7表明羥基自由基的清除效果隨著濃度的增大而增大。山藥多糖的濃度范圍從0.01到5mg/ml時(shí)，羥基自由基的清除率從7.63％急劇增加到91.25％?？箟难岷蜕剿幎嗵堑膃c50值分別為0.09mg/ml和0.95mg/ml。當(dāng)山藥多糖的濃度達(dá)到5mg/ml時(shí),羥基自由基的清除率超過(guò)90％而抗壞血酸在濃度為0.5mg/ml時(shí)清除效果就達(dá)到98％。據(jù)報(bào)道，山藥多糖通過(guò)捐贈(zèng)自身羥基的氫鍵，與氫氧自由基結(jié)合進(jìn)而達(dá)到清除的效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有理由認(rèn)為山藥多糖在清除羥基自由基中起著重要的作用。

(2)超氧陰離子清除率

過(guò)度生產(chǎn)超氧化物陰離子自由基被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)活性氧積累的開始，會(huì)導(dǎo)致氧化還原狀態(tài)失衡，還會(huì)導(dǎo)致相關(guān)得有害生理后果。因此，清除超氧化物陰離子自由基是非常重要的。不同濃度的山藥多糖和抗壞血酸的清除效果如圖8所示。超氧陰離子清除率隨著山藥多糖的濃度的增加而增加。山藥多糖的濃度范圍從0.01到5mg/ml，超氧陰離子清除率從4.28％上升到30.75％。然而，抗壞血酸在濃度為1.0mg/ml時(shí)的清除效果高達(dá)94.68％。比較表明，抗壞血酸比山藥多糖對(duì)于清除超氧化物自由基的影響更大。據(jù)報(bào)道，清除超氧化物陰離子的機(jī)制可能o-h鍵的離解能有關(guān)，也就是說(shuō)，大量吸附于山藥多糖的吸電子基團(tuán)可能導(dǎo)致o-h鍵離解變?nèi)酢＿@可能是由于葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸中存在的酮或醛導(dǎo)致的。

(3)dpph自由基清除率

清除dpph自由基是一種廣泛使用的評(píng)估化合物自由基清除能力性質(zhì)的模型方法。不同樣品在不同濃度下清除dpph自由基的測(cè)量結(jié)果如圖9所示。從圖9可以看出，dpph自由基清除效果隨著樣品濃度的增加而增加。樣品濃度抑制百分比達(dá)到50％定義為ec50。因此，抗氧化活性與ec50值是負(fù)相關(guān)，這表明當(dāng)ec50值越低,測(cè)試樣本的抗氧化活性就會(huì)越高。通過(guò)對(duì)比二者的對(duì)于dpph自由基抑制率，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸在濃度為0.02mg/ml時(shí)的抑制效果就達(dá)到了頂峰(98.89％)，而山藥多糖在濃度為5.0mg/ml時(shí)才到達(dá)最佳效果(62.74％)。此外，dpph自由基清除的效果受很多因素的影響。據(jù)報(bào)道，當(dāng)dpph自由基遇到如抗氧化劑等物質(zhì)時(shí)，自由基清除效果和吸光度值將會(huì)降低。