本申請屬于腫瘤治療領(lǐng)域，涉及一種用于結(jié)直腸癌診斷和治療效果評價的分子標志物。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸屬中醫(yī)學(xué)“腸積”、“積聚”、“癥瘕”、“腸覃”、“腸風(fēng)’等病的范疇。中醫(yī)在晚期結(jié)直腸癌的綜合治療中占據(jù)著不可替代的位置，而辨證論治這一獨特優(yōu)勢卻存在較多的主觀性，導(dǎo)致其準確性與臨床醫(yī)師的臨床經(jīng)驗直接相關(guān)；若辨證失當(dāng)則會降低療效，甚至造成嚴重的不良后果。因而證的客觀化是廣大中醫(yī)研究者必須面對的一個重要研究方向。濕熱內(nèi)蘊證是結(jié)直腸癌最常見的單純實證，是指由于濕熱侵犯腸道，傳導(dǎo)失職，表現(xiàn)為以泄瀉下痢為主的證候。在三焦辨證中屬下焦病證，多因夏秋之季，感受暑濕熱邪，侵犯腸道，或飲食不潔，致使?jié)駸岱x濁之邪蘊結(jié)腸道而成。臨床表現(xiàn)為：脘脹腹痛，下痢膿血，里急后重，或暴注下瀉，色黃而穢臭，肛門灼熱，身熱，口渴，小便短黃，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈滑數(shù)。中醫(yī)“證”是機體在疾病發(fā)展過程中某一階段病因病機的高度概括，反應(yīng)該階段病理變化的本質(zhì)。既然同一個“證”，具有共同的臨床表現(xiàn)和病理基礎(chǔ)，那考慮其有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，而這種物質(zhì)基礎(chǔ)很有可能反映在基因水平上。基因表達水平的變化反映了機體特定階段的生命特征，對疾病的診斷和臨床分型等有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于結(jié)直腸癌診斷或治療效果評價的分子標志物，所述分子標志物是syce3基因及其表達產(chǎn)物。該分子標志物的來源是血液，通過檢測血液中的syce3來進行結(jié)直腸癌診斷或治療效果評價具有以下優(yōu)勢：無創(chuàng)、快速、靈敏。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了檢測syce3的產(chǎn)品在制備濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者診斷或治療效果評價工具中的應(yīng)用。進一步，所述檢測syce3的產(chǎn)品包括檢測樣品中syce3基因表達量的產(chǎn)品。更進一步，所述檢測syce3的產(chǎn)品包括能夠定量樣品中syce3基因mrna的產(chǎn)品，和/或能夠定量樣品中syce3蛋白的產(chǎn)品。本發(fā)明的定量樣品中syce3基因mrna的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學(xué)合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述能夠定量樣品中syce3基因mrna的試劑包括實時定量pcr中使用的特異擴增syce3基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。產(chǎn)品中包括的引物可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計，并通過化學(xué)合成來制備。上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當(dāng)設(shè)計，并通過化學(xué)合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。本發(fā)明的定量樣品中syce3蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學(xué)法、western印跡等。本發(fā)明的定量樣品中syce3蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合syce3蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的定量樣品中syce3蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞?？贵w可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。標記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實施。作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢患者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來源于血液。進一步，所述定量syce3基因或syce3蛋白的產(chǎn)品可以是檢測syce3基因或syce3蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。本發(fā)明還提供了一種用于濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者診斷或治療效果評價的工具，所述工具包括能夠檢測樣品中syce3的工具。進一步，所述工具包括能夠檢測樣品中syce3基因表達量的工具。更進一步，所述工具包括包括能夠定量樣品中syce3基因mrna的試劑，和/或能夠定量樣品中syce3蛋白的試劑。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述能夠定量樣品中syce3基因mrna的試劑是實時定量pcr中使用的特異擴增syce3基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述能夠定量樣品中syce3蛋白的試劑包括特異性結(jié)合syce3蛋白的抗體。進一步，所述用于濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者診斷或治療效果評價的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和對照人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知syce3基因的異常與濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌相關(guān)也屬于syce3的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。作為依照本發(fā)明的檢測工具的樣品，可以使用例如自活檢患者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來源于血液。本發(fā)明提供了一種濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者診斷或治療效果評價的方法，所述方法包括檢測患者血液中syce3基因的表達量。本發(fā)明的分子標志物用于診斷時，當(dāng)檢測到晚期結(jié)直腸癌患者血液中syce3基因的表達量顯著低于非濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者時，表明該晚期結(jié)直腸癌患者是濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者。本發(fā)明的分子標志物用于治療效果評價時，給予濕熱內(nèi)蘊證治療藥物干預(yù)后，當(dāng)檢測到濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者血液中syce3基因的表達量顯著低于非濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者時，表明該晚期結(jié)直腸癌患者藥物治療效果緩慢，還需繼續(xù)藥物干預(yù)治療，直到濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者血液中syce3基因的表達量基本與非濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者持平，則可以判斷該晚期結(jié)直腸癌患者的濕熱內(nèi)蘊證消除，患者可以停止服用藥物。從另外一個角度來說，治療效果的評價還可以表示成治療周期或者治療終止的判斷，當(dāng)濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者血液中syce3基因的表達量基本與非濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者持平時，患者治療才可以終止。在本發(fā)明的具體實施方案中，用于濕熱內(nèi)蘊證的治療藥物是白頭翁顆粒。附圖說明圖1顯示利用qpcr在mrna水平上檢測syce3基因差異表達情況的統(tǒng)計圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1差異表達基因篩選1、病例收集收集醫(yī)院腫瘤科經(jīng)病理明確診斷的iii-iv期結(jié)直腸癌患者；選擇濕熱內(nèi)蘊證5例作為實驗組，非濕熱內(nèi)蘊證5例作為對照組；僅接受純中醫(yī)治療。1.1結(jié)直腸癌的診斷及分期標準參照中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司2010年10月編著的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》，2011nccn腫瘤臨床實踐指南(中國版)第一版tnm分期標準。1.2諸證的診斷標準參照《中醫(yī)診斷學(xué)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定。濕熱內(nèi)蘊證主證：脘脹腹痛，暴注下泄，下痢膿血、里急后重，腹瀉不暢、粘膩腥臭、肛門灼熱；次證：身熱，口渴，小便短黃，舌紅苔黃膩，脈滑數(shù)。診斷：具備主證1項，次證3項；或主證2項，次證2項可診斷。1.3納入、排除標準納入標準：(1)漢族iii-iv期結(jié)直腸癌患者，有病理診斷，僅接受純中醫(yī)治療；(2)kps評分≥60；(3)年齡18-75歲之間(包含18歲和75歲)；(4)預(yù)計生存期在3個月以上；(5)依從性好，簽署知情同意書自愿參與實驗。排除標準：(1)合并有嚴重的或需要治療的心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)疾病；(2)孕婦、哺乳期及精神病患者；(3)有明顯的復(fù)合證患者。2、治療方法濕熱內(nèi)蘊證5例使用白頭翁顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))進行干預(yù)，方法為每次l袋，水沖服，2次/d，治療時間為21d，期間患者不接受其他中醫(yī)藥治療。3、總mrna提取對照患者，療前和治療后患者清晨空腹采集外周靜脈血5ml，以紅細胞裂解液分離出白細胞，加入細胞20倍體積的trizol，用移液器進行反復(fù)抽打細胞直至無成團細胞塊，使之充分溶解于trizol中形成清亮不黏稠的液體，置-80℃冰箱中保存。trizol一步法抽提總mrna?？俶rna純度及完整性分析：采用分光光度計在260nm和280nm處分別測定吸光度(a)值，a260/a280比值1.8-2.0為較純的mrna；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測：28s條帶亮度約是18s條帶的2倍表明所提取rna完整性較好，可用于芯片檢測。4、agilent表達譜芯片雜交rna質(zhì)檢合格后，參照芯片標準流程進行樣本標記、芯片雜交以及洗脫。首先，總rna反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cdna，再進一步合成以cyanine-3-ctp(cy3)標記的crna。將標記好的crna和芯片雜交，洗脫后利用agilentscannerg2505c(美國安捷倫科技有限公司)掃描得到原始圖像。5、數(shù)據(jù)處理采用featureextraction軟件(version10.7.1.1，agilenttechnologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用genespring軟件(version12.5：agilenttechnologies)進行quantile標準化和后續(xù)處理。標準化后的數(shù)據(jù)進行過濾，在用于比較的每組樣本中至少有一組100％標記為detected的探針留下進行后續(xù)分析。利用t檢驗得到的差異顯著性p值和標準化信號值的差異倍數(shù)foldchange值進行差異基因篩選，篩選的標準為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且p<0.05。6、結(jié)果結(jié)果顯示，濕熱內(nèi)蘊證與對照組相比共篩選出168條差異表達基因，其中上調(diào)的75條，下調(diào)的93條。經(jīng)白頭翁顆粒干預(yù)后與干預(yù)前相比，篩選出159條差異表達基因，其中表達上調(diào)有38條，下調(diào)有121條。實施例2差異表達基因的驗證根據(jù)實施例1的結(jié)果，選擇差異表達的syce3基因進行大樣本驗證。1、病例收集按照實施例1的方法收集濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者50例、非濕熱內(nèi)蘊證晚期結(jié)直腸癌患者50例作為對照。2、治療方法同實施例1。3、在mrna水平上進行驗證3.1提取血液總rna步驟同實施例1。3.2逆轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄使用primescript1ststrandcdnasynthesiskit試劑盒，操作步驟如下進行：(1)在微量離心管中加入以下反應(yīng)液體，如表1所示：表1反應(yīng)液體試劑劑量rna2.0μgdntp1.0μloligo(dt)2.0μlrnasefreedh2o加至10.0μl(2)70℃孵育5min，迅速冷卻至4℃；在微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)試劑，制成反應(yīng)體系：表2反應(yīng)體系的配制試劑劑量5x1ststrandsynthesisbuffer4.0μlprimescriptrtase1.0μlrnaseinhibitor1.0μlrnasefreedh2o4.0μl輕輕震蕩，快速離心后，42℃反應(yīng)1h，70℃10min終止反應(yīng)，4℃冷卻，-20℃保存。采用sybppremixextaptmii試劑盒，在eppendorfreal-timepcr分析儀進行，具體操作如下：(1)在冰上配制以下pcr反應(yīng)液：表3pcr反應(yīng)液的配制試劑劑量sybr10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcdna2.0μlddh2o6.0μl總量20.0μl引物序列設(shè)計如下：syce3基因：5’-atctgaataaggacttggaa-3’(seqidno.1)；5’-atcaccaccatgtcatag-3’(seqidno.2)β-actin：5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno.3)；5’-ctccttaatgtcacgcacgattt-3’(seqidno.4)(2)上機，執(zhí)行下述程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，60℃退火，15s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。結(jié)果釆用相對定量法，運用公式2-△△ct計算。實驗重復(fù)3次?！鱟t＝ct(a)-ct(β-actin)△△ct＝△ct(實驗組)-△ct(對照組)結(jié)果如圖1所示，濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者與對照組相比，syce3基因mrna量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。濕熱內(nèi)蘊型晚期結(jié)直腸癌患者經(jīng)白頭翁顆粒干預(yù)后與干預(yù)前相比，syce3基因mrna量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，基本與對照組持平。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。sequencelisting<110>新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院；西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院<120>syce3在結(jié)直腸癌診斷和治療效果評價中的應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atctgaataaggacttggaa20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2atcaccaccatgtcatag18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gtggggcgccccaggcacca20<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4ctccttaatgtcacgcacgattt23當(dāng)前第1頁12