本發(fā)明涉及一種具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽的制備方法，屬于生物活性肽的制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

食品腐敗菌、致病菌引起的食品腐敗變質(zhì)和食品成分的氧化變質(zhì)可影響食品品質(zhì)及食品安全。這兩種食品變質(zhì)不僅會造成經(jīng)濟損失，甚至危害公眾健康，給食品安全帶來巨大壓力。如何防治食品微生物變質(zhì)和氧化變質(zhì)是食品工業(yè)要解決的重要問題。目前通過食品加工或添加防腐劑、抗氧化劑是預(yù)防食品微生物變質(zhì)和食品氧化變質(zhì)的主要措施。但是加工過程對食品營養(yǎng)的影響、非食品成分的添加，以及化學(xué)防腐劑和抗氧化劑對食品感官品質(zhì)的影響、在食品體系中的使用范圍窄、化學(xué)添加劑自身毒副作用以及化學(xué)添加劑攝入后在體內(nèi)殘留等缺點是不容忽視的。隨著人們消費方式的改變和對食品安全及自身健康的關(guān)注，追求更天然、更少化學(xué)殘留和更少加工過程的健康食品是食品工業(yè)發(fā)展的一個新方向，這就需要更天然、更有效、更安全的生物防腐劑和抗氧化劑來防控食品的微生物及氧化變質(zhì)。

生物活性肽是蛋白中具有一種或多種特定活性如抗氧化、抗微生物、抗高血壓等，長度在2~20個氨基酸的序列，因其低毒、高活性的特點，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。抗菌肽是一類具有抗微生物活性的生物活性肽，屬于抗生素家族。它們除了對細(xì)菌、真菌有抑菌活性以外，有的抗菌肽對腫瘤細(xì)胞、病毒等也具有毒性。抗菌肽在體內(nèi)最終酶解為氨基酸，無殘留毒性?？寡趸氖蔷哂幸种浦|(zhì)過氧化和清除自由基功能的一類生物活性肽。與傳統(tǒng)的化學(xué)抗氧化劑相比，抗氧化肽對人體潛在危害更小，因此越來越多的抗氧化肽被發(fā)現(xiàn)，特別是蛋白酶解肽。因此，以天然具有抗菌和抗氧化活性的活性肽為基礎(chǔ)解決食品變質(zhì)問題具有重要意義。

獲得天然活性肽的化學(xué)法和酶解法存在程序繁瑣、化學(xué)試劑殘留、費用高等缺點；微生物液態(tài)發(fā)酵法的培養(yǎng)基組成復(fù)雜、發(fā)酵產(chǎn)物濃度低、能耗高。固態(tài)發(fā)酵法則有培養(yǎng)基簡單、產(chǎn)率高、能耗低、環(huán)境污染較少等優(yōu)點。目前固態(tài)發(fā)酵法制備活性肽主要集中在對抗氧化肽的研究，而固態(tài)發(fā)酵制備抗菌肽的研究甚少。

中國專利cn103333937a一種利用枯草芽孢桿菌制備抗菌肽的工藝方法采用分批補料深層液體發(fā)酵方式，培養(yǎng)基成分復(fù)雜、設(shè)備投資大、操作工藝繁瑣。中國專利cn101381757a公開了抗菌肽的固態(tài)發(fā)酵制備方法，這種方法前期需要將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入真菌并馴化真菌菌種的復(fù)雜工藝，且制備抗菌肽的培養(yǎng)基還需加入尿素、鉀鹽和生物素這些化學(xué)物質(zhì)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜。

我國蕎麥資源豐富，是特色糧食作物苦蕎的起源中心之一。苦蕎是一種糧藥兼用的糧食經(jīng)濟作物，苦蕎的蛋白質(zhì)含量約為10～15%，且50%以上是清蛋白和球蛋白。但目前苦蕎利用率不高、產(chǎn)品附加值低。以資源豐富的苦蕎為原料，固態(tài)發(fā)酵制備抗菌及抗氧化雙活性肽對活性肽的簡單、大量制備及苦蕎的深加工和高值化利用有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽的制備方法，該苦蕎活性肽可應(yīng)用于食品、飼料和化妝品行業(yè)中。包括如下步驟：

（1）將真菌孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，28～30℃，相對濕度70～90%，培養(yǎng)5～7天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為1×10⁶～1×10⁸個/ml，得到真菌孢子懸液；

（2）取苦蕎粉80～200g、蒸餾水40～100ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌20～30min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的真菌孢子懸液20～50ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于28～30℃、相對濕度70～90%下培養(yǎng)2～4天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入300～800ml蒸餾水，溫度10～20℃，功率150～300w超聲提取30～60min，置于離心機4℃、10000r/min離心10～20min，收集上清液，在沸水中煮沸5～10min滅酶，10000r/min離心10～20min，上清液即為苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析18～36h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

步驟（1）中所采用的真菌為黑曲霉、黃曲霉、總狀毛霉中的任意一種。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明提供了一種利用絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵苦蕎制備活性肽的方法，直接以苦蕎和水為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，采用對人無危害的絲狀真菌黑曲霉、黃曲霉和總狀毛霉作為發(fā)酵用真菌進行固態(tài)發(fā)酵制備活性肽；制備方法工藝設(shè)備簡單，原料價廉易得，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品得率高，過程無化學(xué)物質(zhì)添加，適合大規(guī)模生產(chǎn)活性肽；

2、本發(fā)明制備的活性肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑制作用，且具有清除自由基的活性，制備的活性肽產(chǎn)品活性好、無殘留、無污染、成本低，可直接應(yīng)用于食品防腐保鮮、飼料及化妝品添加劑等。

具體實施方式

以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。

實施例1

（1）用無菌接種環(huán)挑取斜面總狀毛霉（cicc40241）孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，29℃，相對濕度85%，培養(yǎng)5天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為2×10⁷個/ml，得到總狀毛霉孢子懸液；

（2）取苦蕎粉200g、蒸餾水70ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌20min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的總狀毛霉孢子懸液20ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于30℃、相對濕度70%下培養(yǎng)2天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入300ml蒸餾水，溫度10℃，功率230w超聲提取45min，置于離心機4℃、10000r/min離心15min，收集上清液，在沸水中煮沸5min滅酶，10000r/min離心15min，收集上清液得到苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析18h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

本實施例制得的苦蕎活性肽得率為15.6%，大腸桿菌抑菌率54%，金黃色葡萄球菌抑菌率72%，羥自由基清除率56%。

肽得率檢測方法如下：取固態(tài)發(fā)酵液，加入10vt%的三氯乙酸，渦漩震蕩后靜置20min，10000r/min離心10min，取1ml上清液，加入5ml堿性銅溶液，混勻，室溫放置10min，加入0.5ml福林-酚試劑并迅速搖勻，30℃水浴孵育30min后測定650nm處吸光值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出可溶性肽含量。按如下公式計算肽得率：

肽得率（%）=發(fā)酵液中多肽含量/固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中苦蕎蛋白含量×100%

細(xì)菌抑制率檢測方法如下：將100μl經(jīng)0.22μm水系微孔濾膜過濾的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液加入96孔酶標(biāo)板中，再加入等體積1×10⁶cfu/ml的菌懸液作為試驗組；以100μl無菌生理鹽水代替等體積苦蕎固態(tài)發(fā)酵液作為對照組；用100μl無菌生理鹽水代替等體積的菌懸液用于扣除樣品顏色；37℃培養(yǎng)12h后用酶標(biāo)儀測定620nm下吸光值；按如下公式計算發(fā)酵產(chǎn)物液的抑菌率：

抑菌率（%）=[對照組od值-（試驗組od值-樣品顏色od值）]/對照組od值×100%

羥自由基清除率檢測方法如下：向離心管中加入9mmol/lfeso4溶液、9mmol/l水楊酸-乙醇溶液、發(fā)酵液各1ml，混勻后加入6mmol/lh2o21ml混勻，37℃水浴30min，取出10000r/min離心2min；取上清液測定510nm吸光值記為a1；空白和對照分別用1ml蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液和發(fā)酵液，測定吸光值分別記為a0和a2；以蒸餾水調(diào)零，按如下公式計算羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=[1-(a1-a0)/a2]×100%。

實施例2

（1）用無菌接種環(huán)挑取斜面黃曲霉（cicc41470）孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，30℃，相對濕度70%，培養(yǎng)6天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為1×10⁸個/ml，得到黃曲霉孢子懸液；

（2）取苦蕎粉80g、蒸餾水40ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌25min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的黃曲霉孢子懸液30ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于29℃、相對濕度85%下培養(yǎng)4天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入400ml蒸餾水，溫度18℃，功率300w超聲提取30min，置于離心機4℃、10000r/min離心10min，收集上清液，在沸水中煮沸8min滅酶，10000r/min離心20min，收集上清液得到苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析24h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

本實施例制得的苦蕎活性肽得率為23%，大腸桿菌抑菌率78%，金黃色葡萄球菌抑菌率84%，羥自由基清除率46%。

實施例3

（1）用無菌接種環(huán)挑取斜面黑曲霉（cicc2377）孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，28℃，相對濕度90%，培養(yǎng)7天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為1×10⁶個/ml，得到黑曲霉孢子懸液；

（2）取苦蕎粉160g、蒸餾水100ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌30min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的黑曲霉孢子懸液50ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于28℃、相對濕度90%下培養(yǎng)3天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入800ml蒸餾水，溫度20℃，功率150w超聲提取60min，置于離心機4℃、10000r/min離心20min，收集上清液，在沸水中煮沸10min滅酶，10000r/min離心10min，收集上清液得到苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析36h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

本實施例制得的苦蕎活性肽得率為17%，大腸桿菌抑菌率67%，金黃色葡萄球菌抑菌率79%，羥自由基清除率71%。