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一種煙草黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分的應(yīng)用方法與流程

文檔序號:11647268閱讀:345來源:國知局
一種煙草黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分的應(yīng)用方法與流程

本發(fā)明屬于病理學(xué)領(lǐng)域,特別涉及一種利用煙草黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分快速篩選抗黑脛病煙草新品系的方法。



背景技術(shù):

煙草黑脛病最早在印度尼西亞的瓜哇被發(fā)現(xiàn)。1950年首次報道該病發(fā)生于我國黃淮煙區(qū),并長時間為害且病情越來越嚴(yán)重。目前煙草黑脛病除東北煙區(qū)零星發(fā)病外,全國其他煙區(qū)均普遍發(fā)生,每年造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重,僅次于病毒病。

當(dāng)前,防治煙草黑脛病的常用化學(xué)藥劑主要有瑞毒霉(甲霜靈)可濕性粉劑、波爾多液、甲基托布津、敵克松可濕性粉劑、殺毒礬m-8可濕性粉等,期間多種藥劑可聯(lián)合施用,分時分期噴灑,具有理想的防病增產(chǎn)作用。此外,尋找新的防治方法以克服煙葉農(nóng)藥殘留和病菌抗藥性的問題,生物防治的多樣性決定了防治方法的多樣性,也保證了煙草黑脛病的生物防治途徑的多樣性。國外有研究表明:在煙草黑脛病的防治工作中,木霉菌拮抗效果突出,主要緣于木霉菌在土壤中占據(jù)了侵染點(diǎn)位后,與黑脛病菌產(chǎn)生競爭,進(jìn)而降低煙草黑脛病菌的侵染幾率。

隨著煙草行業(yè)不斷向綠色無公害方向發(fā)展,對煙草黑脛病的防治僅僅停留在合理輪作為主、起壟栽培和化學(xué)防治為輔的綜合防治措施已不能滿足發(fā)展的需求。生物防治中尋找拮抗煙草黑脛病的菌株雖然也能在一定程度上有效防治煙草黑脛病菌,但只有煙草品種的抗病性本身才是防治病害的基礎(chǔ),因而對抗性品種的研究是當(dāng)今煙草領(lǐng)域的一個熱門話題。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是首先利用黑脛病菌的發(fā)酵液,然后將得到的95%乙醇洗脫液作為黑脛病致病因子的選擇壓對煙草品系的花藥進(jìn)行抗黑脛病篩選;最后對抗病花藥加倍后進(jìn)行抗病性鑒定。本發(fā)明操作簡單快速、結(jié)果可靠。

一種煙草黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分的應(yīng)用方法,步驟包括:

(1)黑脛病菌菌絲在液體培養(yǎng)基中搖床振蕩培養(yǎng);收集無菌發(fā)酵液,離心,將上清液過濾除菌,待用;

(2)將步驟(1)得到的除菌后的黑脛病菌無菌發(fā)酵液通過微濾中空纖維素膜和超濾中空纖維素膜進(jìn)行膜過濾分離,得到澄清透明的超濾液;將超濾液上柱進(jìn)行大孔吸附樹脂富集,最后用80-95%的乙醇將樹脂上吸附的成分沖下,得到80-95%乙醇洗脫液,即黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分;

(3)以步驟(2)得到的80-95%乙醇洗脫液做為致病因子選擇壓對煙草品系的花藥進(jìn)行抗黑脛病篩選。

以步驟(3)中篩選出的抗病花藥加倍后的煙株為材料,通過葉片離體注射法,對篩選出的煙株進(jìn)行抗黑脛病鑒定。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(1)所述的液體培養(yǎng)基為pda液體培養(yǎng)基。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(1)中的搖床培養(yǎng)條件:26-30℃、180-250rpm,優(yōu)選28℃,220rpm。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(1)中從培養(yǎng)后的第5d-7d收集無菌發(fā)酵液,優(yōu)選第7d。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(1)中4℃、6000-10000rpm離心10-20min,優(yōu)選8000rpm離心15min;將上清液經(jīng)0.22um細(xì)菌過濾器過濾除菌,保存于4℃冰箱中待用。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(2)中采用的是5kda微濾中空纖維素膜和3kda超濾中空纖維素膜進(jìn)行膜過濾分離。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(2)中采用的是d101型大孔吸附樹脂。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),步驟(2)和步驟(3)中采用的乙醇濃度是95%。

作為進(jìn)一步的改進(jìn),以80-95%乙醇洗脫液作為致病因子,且以2-3%的質(zhì)量濃度作為選擇壓。

本發(fā)明操作簡單、結(jié)果可靠、黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分的致病能力強(qiáng),穩(wěn)定性好,能夠高效的用于煙草黑脛病菌抗性品種的篩選。

附圖說明

圖1為v8培養(yǎng)基中黑脛病菌發(fā)酵液的煙葉hr反應(yīng);

從左至右分別代表黑脛病菌振蕩培養(yǎng)0d、5d、6d、7d后的無菌發(fā)酵液hr反應(yīng);

圖2為胡蘿卜培養(yǎng)基中黑脛病菌發(fā)酵液的煙葉hr反應(yīng);

從左至右分別代表黑脛病菌振蕩培養(yǎng)0d、5d、6d、7d后的無菌發(fā)酵液hr反應(yīng);

圖3為燕麥培養(yǎng)基中黑脛病菌發(fā)酵液的煙葉hr反應(yīng);

從左至右分別代表黑脛病菌振蕩培養(yǎng)0d、5d、6d、7d后的無菌發(fā)酵液hr反應(yīng);

圖4為煙葉汁培養(yǎng)基中黑脛病菌發(fā)酵液的煙葉hr反應(yīng);

從左至右分別代表黑脛病菌振蕩培養(yǎng)0d、5d、6d、7d后的無菌發(fā)酵液hr反應(yīng);

圖5為馬鈴薯培養(yǎng)基中黑脛病菌發(fā)酵液的煙葉hr反應(yīng);

從左至右分別代表黑脛病菌振蕩培養(yǎng)0d、5d、6d、7d后的無菌發(fā)酵液hr反應(yīng);

圖6為黑脛病菌發(fā)酵液不同處理的煙葉hr反應(yīng);

圖7為煙草高鉀品系hkdn-2的花藥抗黑脛病菌原液和發(fā)酵液活性成分最適選擇壓的篩選比較;

圖8為煙草高鉀品系hkdn-5的花藥抗黑脛病菌原液和發(fā)酵液活性成分最適選擇壓的篩選比較;

圖9為黑脛病菌發(fā)酵液活性組分花培幼苗的黑脛病抗性鑒定;

(注:h.r表示高抗;m.r表示中抗;a表示盆栽鑒定;b表示大田;c表示大田單株)

圖10為黑脛病菌原液花培幼苗的黑脛病抗性鑒定;

(注:h.s表示高感;a表示移盆栽鑒定;b表示大田;c表示大田單株)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明,而非限制本發(fā)明。

黑脛病菌發(fā)酵液的制備及其活性組分的分離:首先接種環(huán)挑取適量菌絲塊于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,置于28℃、220rpm的搖床中培養(yǎng),從第7d收集無菌發(fā)酵液于10ml的無菌離心管中,4℃、8000rpm離心15min,將上清液經(jīng)0.22um細(xì)菌過濾器過濾得到黑脛病菌發(fā)酵液;然后將其過5kda微濾中空纖維素膜和3kda超濾中空纖維素膜處理,得到澄清透明的超濾液;最后將濾液經(jīng)6kgd101型大孔吸附樹脂,后用95%乙醇將樹脂上吸附的成分沖下,得到95%乙醇洗脫液。

實(shí)施例1:黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

(1)v8培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

由圖1可知:與對照(ck)(ck為培養(yǎng)0天)相比,黑脛病菌振蕩培養(yǎng)5天后獲得的發(fā)酵液已使葉片注射區(qū)出現(xiàn)輕微凹陷狀,伴有白色圈點(diǎn),經(jīng)一段時間振蕩培養(yǎng),至第7天后,所取發(fā)酵液使葉片注射區(qū)出現(xiàn)凹陷狀和圈點(diǎn)。但總體來說,煙葉均未出現(xiàn)明顯hr壞死斑現(xiàn)象。

(2)胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

由圖2可知:黑脛病菌培養(yǎng)5天后所取得的黑脛病菌無菌發(fā)酵液對葉片的注射結(jié)果與對照(ck)一樣,無hr反應(yīng),培養(yǎng)6天后,所取得的發(fā)酵液使葉片的注射孔周圍開始出現(xiàn)輕微白色斑點(diǎn),培養(yǎng)7天與培養(yǎng)6天相比,白色斑點(diǎn)增多,面積擴(kuò)大,并伴隨著注射區(qū)煙葉大范圍凹陷。綜合整個培養(yǎng)周期來看,未產(chǎn)生明顯hr壞死斑現(xiàn)象。

(3)燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

從圖3可知:培養(yǎng)0天(ck)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液對煙葉無hr反應(yīng)。黑脛病菌培養(yǎng)了5天的發(fā)酵液對煙葉即有輕微影響,伴有白色斑點(diǎn)出現(xiàn),培養(yǎng)了6天的黑脛病菌無菌發(fā)酵液與5天的相比,煙葉注射區(qū)產(chǎn)生的白色斑點(diǎn)較大,培養(yǎng)7天后,所取得的黑脛病菌無菌發(fā)酵液即使煙葉注射區(qū)產(chǎn)生黃色斑點(diǎn),有產(chǎn)生hr反應(yīng)的趨勢但并不明顯。

(4)煙葉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

由圖4可知,培養(yǎng)0天(ck)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液對煙葉未產(chǎn)生明顯的注射效果,黑脛病菌培養(yǎng)5天后,所取得的黑脛病菌無菌發(fā)酵液即使煙葉注射區(qū)出現(xiàn)白色凹陷,伴有白色斑塊,部分斑塊存在變黃的現(xiàn)象,培養(yǎng)6天和7天所取的黑脛病菌無菌發(fā)酵液對葉片的注射效果與培養(yǎng)5天的相比,均無變化,未出現(xiàn)明顯hr壞死斑。

(5)馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

從圖5可知:培養(yǎng)0天的黑脛病菌無菌發(fā)酵液(ck)對煙葉無明顯損傷現(xiàn)象;黑脛病菌培養(yǎng)5天后所取的無菌發(fā)酵液對煙葉的注射效果有輕微壞死斑現(xiàn)象并伴隨著小范圍黃色斑點(diǎn)出現(xiàn);黑脛病菌培養(yǎng)7天后所取的無菌發(fā)酵液與培養(yǎng)6天的相比,煙葉注射處的斑點(diǎn)逐漸變大變黃,出現(xiàn)明顯抗敏感性壞死斑,即產(chǎn)生hr反應(yīng)。

(6)5種培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果比較

綜上所述(表1):馬鈴薯培養(yǎng)基(pda)培養(yǎng)獲得的黑脛病菌無菌發(fā)酵液對煙葉的注射效果最明顯,煙葉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的次之,v8培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果最差;分別在黑脛病菌培養(yǎng)5、6和7天取無菌發(fā)酵液并對煙葉進(jìn)行離體注射,培養(yǎng)7天取得的黑脛病菌無菌發(fā)酵液的注射效果最好;分別將5種培養(yǎng)0天的黑脛病菌無菌發(fā)酵液(培養(yǎng)基原液)對葉片進(jìn)行離體注射,均無壞死斑現(xiàn)象,排除培養(yǎng)基自身的致病性。

表15種培養(yǎng)基的黑脛病菌無菌發(fā)酵液致病效果

注:-代表煙葉無hr反應(yīng);+代表煙葉有輕微hr反應(yīng);++代表煙葉有hr反應(yīng);++++代表煙葉有明顯hr反應(yīng)。

實(shí)施例2:黑脛病菌發(fā)酵液活性成分致病性的測定

由表2和圖6可知:黑脛病菌無菌發(fā)酵液經(jīng)5kda微濾中空纖維素膜和3kda超濾中空纖維素膜處理后的超濾液經(jīng)葉片注射后,可使煙葉產(chǎn)生明顯的hr壞死斑,病斑面積平均值達(dá)0.87cm2,其與原液注射葉片后的病斑面積相比,均值增加0.32cm2,二者的差異達(dá)到了5%的顯著性水平;超濾液經(jīng)開放層析柱處理后,得到的70%、80%和95%乙醇洗脫液可使煙葉產(chǎn)生hr反應(yīng),比較原液和超濾液的hr反應(yīng),乙醇洗脫液引起的壞死斑更明顯,顏色更深,微現(xiàn)黃,病斑面積平均值達(dá)0.88-0.93cm2;其中80%(c4)和95%(c5)乙醇洗脫液壞死斑面積平均值與超濾液之間的差異也達(dá)到了5%的顯著性水平;雖然70%(c3)乙醇洗脫液壞死斑面積平均值與超濾液之間的差異不顯著性,但其變異系數(shù)(9.075)小于超濾液的(11.49)。

表2黑脛病菌發(fā)酵液不同處理的煙葉hr壞死斑面積差異

實(shí)施例3花藥抗黑脛病突變體的獲得

(1)花藥抗黑脛病菌原液和本發(fā)明的發(fā)酵液活性成分最適選擇壓的篩選比較

①煙草高鉀品系hkdn-2

第一,從圖7和表3可知:隨著本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分濃度的增大,hkdn-2的花藥的萌發(fā)率逐漸減少;與對照組(ck,0%)相比,含1%的本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分濃度的培養(yǎng)基中花藥的萌發(fā)率為12.0%,二者不存在差異顯著性;本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分濃度為2%時花藥萌發(fā)率顯著低于對照組,但未達(dá)到極顯著性水平;當(dāng)本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分濃度達(dá)3%時,花藥萌發(fā)率與低濃度(1%、2%)呈現(xiàn)顯著差異,而與高濃度(4%、5%)處理的差異達(dá)極顯著水平,因此選擇3%的濃度作為篩選hkdn-2抗黑脛病突變體的最適選擇壓。

第二,1%和2%及4%和5%原液濃度處理的與3%處理的之間達(dá)到了5%水平的差異,因此確定3%作為黑脛病菌原液的最適選擇壓。

第三,不同濃度原液處理的平均萌發(fā)出苗數(shù)為41.4株,萌發(fā)率為55.2%;而不同濃度本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分處理的平均萌發(fā)出苗數(shù)為5.2株,萌發(fā)率為6.93%。

表3不同選擇壓濃度下hkdn-2花藥抗黑脛病突變體的萌發(fā)率

②煙草高鉀品系hkdn-5

第一,從圖8和表4可知:當(dāng)花藥培養(yǎng)基中本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分濃度為1%時,其萌發(fā)率與對照組(0%)相比有極顯著差異;當(dāng)本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分濃度為2%時,其萌發(fā)率為12.0%,與低濃度處理(1%)的萌發(fā)率相比未產(chǎn)生顯著性差異,而與高濃度處理(3%、4%、5%)的萌發(fā)率相比達(dá)極顯著水平,說明2%為烤煙hkdn-5進(jìn)行花藥培養(yǎng)所能耐受的極限致病因子濃度,所以初步認(rèn)為篩選hkdn-5的抗黑脛病病突變體的最適選擇壓為2%。

第二,1%、2%和3%及5%原液濃度處理的與4%處理的之間達(dá)到了5%水平的差異,因此確定4%作為黑脛病菌原液的最適選擇壓。

第三,不同濃度原液處理的平均萌發(fā)出苗數(shù)為40.0株,萌發(fā)率為53.3%;而不同濃度本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分處理的平均萌發(fā)出苗數(shù)為8.6株,萌發(fā)率為11.46%。

表4不同選擇壓濃度下hkdn-5花藥抗黑脛病突變體的萌發(fā)率

(2)盆栽和大田的驗(yàn)證結(jié)果

分別將經(jīng)過上述已確定的最適選擇壓,2-3%本發(fā)明的黑脛病菌發(fā)酵液活性成分和4%黑脛病菌原液培養(yǎng)下的成活花藥進(jìn)行分化、生根、加倍、煉苗后,通過莖接種進(jìn)行抗黑脛病性鑒定,結(jié)果表明:前者處理的,煙草植株表現(xiàn)了不同程度的抗性,發(fā)病率僅僅為3.6%(圖9);而后者處理的,煙草植株的發(fā)病率較高,發(fā)病率高達(dá)45.3%(圖10)。

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