本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和疾病基因研究和診斷領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明涉及在多囊卵巢綜合征(pcos)的基因表達(dá)分析的研究中采用的內(nèi)參基因組合和檢測(cè)多囊卵巢綜合征的內(nèi)參基因組合。

背景技術(shù)：

多囊卵巢綜合征(pcos)，癥狀包括排卵功能障礙、多囊卵巢、雄激素過(guò)多，是常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病，并且是女性生殖失敗的主要原因(kovacsandwood，2001；wild，etal.，2000)。根據(jù)不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其患病率的估計(jì)是6％～18％(azziz，etal.，2004；christian，etal.，2003；march，etal.，2010)。多囊卵巢綜合征患者易發(fā)生多種代謝紊亂包括胰島素抵抗、2型糖尿病(t2dm)、肥胖、血脂異常、慢性低水平炎癥和心血管疾病(cvd)以及心理障礙(azziz，etal.，2004；ehrmann，2005；jayasenaandfranks，2014；kovacsandwood，2001；orio，etal.，2004；ozcandag，etal.，2015；spritzer，etal.，2015；stepto，etal.，2013；wild，etal.，2000)。

盡管pcos的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但經(jīng)推斷其機(jī)制可能涉及到卵泡發(fā)育過(guò)程中卵巢顆粒細(xì)胞(gcs)介導(dǎo)的異常的激素反應(yīng)。已有的研究表明，pcos的發(fā)生與pcos患者的顆粒細(xì)胞中促黃體生成激素(lh)相對(duì)于lh的升高以及高表達(dá)和過(guò)度激活的促黃體激素/絨毛膜促性腺激素受體相關(guān)，阻礙了卵泡的成熟和排卵過(guò)程(ehrmann，etal.，1995；jakimiuk，etal.，2001；kanamarlapudi，etal.，2016；willis，etal.，1998；yong，etal.，1992)。此外，顆粒細(xì)胞功能受損還會(huì)導(dǎo)致卵巢內(nèi)雄激素和體

正常和疾病樣本中基因表達(dá)譜的比較為pcos發(fā)病機(jī)制的研究提供了寶貴的資料。實(shí)時(shí)定量pcr(qrt-pcr)現(xiàn)已被大量、廣泛的用于檢測(cè)器官和組織甚至單細(xì)胞中的基因表達(dá)差異，常被用來(lái)去尋找pcos的調(diào)控基因、相關(guān)的信號(hào)通路以及非侵入性的生物標(biāo)志物(adams，etal.，2016；chazenbalk，etal.，2012；deresende，etal.，2012；lemieux，etal.，1999；long，etal.，2014；salilew-wondim，etal.，2015；schmidt，etal.，2014；wissing，etal.，2014)。

在基因表達(dá)研究中的各種方法，包括測(cè)序法、qrt-pcr和microarray(基因芯片)中，均需要使用內(nèi)參基因。內(nèi)參基因通常在所有樣本和實(shí)驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定地表達(dá)，而且具有與研究對(duì)象相似的屬性，例如rna穩(wěn)定性和大小等，由此表達(dá)量可以與研究對(duì)象進(jìn)行比較。內(nèi)參基因在很大程度上能夠影響測(cè)序法、qrt-pcr和microarray(基因芯片)的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)在的多數(shù)研究只是選擇一個(gè)內(nèi)參基因，如β-肌動(dòng)蛋白(actb)、18s核糖體rna、肽基脯氨酸異構(gòu)酶b(peptidylprolylisomeraseb，ppib)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等。越來(lái)越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)這些原來(lái)被認(rèn)為是能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)嶋H上在不同生理或病理?xiàng)l件下的表達(dá)是有變化的(meller，etal.，2005；patel，etal.，2002)。采用不恰當(dāng)?shù)目醇一?housekeepinggene)可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)曲解引起基因表達(dá)的低估或高估(dheda，etal.，2005；murphyandbustin，2009；nestorov，etal.，2013)。

因此本領(lǐng)域還需要在患者或正常人的樣品中對(duì)多囊卵巢綜合征(pcos)通過(guò)基因表達(dá)分析進(jìn)行研究和檢測(cè)，特別是尋找在顆粒細(xì)胞樣品中進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)的更可靠的內(nèi)參基因或基因組合。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了對(duì)健康人群和多囊卵巢綜合征(pcos)患者的樣本進(jìn)行有關(guān)的研究，特別是在顆粒細(xì)胞樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)作為內(nèi)參基因的基因組合。本發(fā)明也提供了對(duì)多囊卵巢綜合征(pcos)患者的樣本進(jìn)行研究或檢測(cè)，特別是在顆粒細(xì)胞樣本中通過(guò)分析基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征時(shí)作為內(nèi)參基因的基因組合。

具體的，本發(fā)明提供了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因的組合在研究多囊卵巢綜合征中作為內(nèi)參基因的用途，特別是在人的顆粒細(xì)胞樣品中研究多囊卵巢綜合征時(shí)作為內(nèi)參基因。該研究通常是通過(guò)細(xì)胞中的基因表達(dá)譜分析來(lái)進(jìn)行。

顆粒細(xì)胞是卵泡(follicle)中卵母細(xì)胞四周一層扁平或立方形細(xì)胞。在卵泡開(kāi)始發(fā)育、卵細(xì)胞成長(zhǎng)的同時(shí)，這些顆粒細(xì)胞由扁平變?yōu)榱⒎叫?，并由單層增生成?fù)層。

內(nèi)參基因是用于檢測(cè)基因表達(dá)水平變化時(shí)用于參照物的基因。內(nèi)參基因需要選擇在研究對(duì)象(組織和細(xì)胞等)中表達(dá)相對(duì)恒定的基因。內(nèi)參基因可以在例如實(shí)時(shí)熒光定量pcr、northernblot等方法中用作校正例如上樣量誤差或上樣過(guò)程中的操作誤差等差異，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常采用看家基因(house-keepinggenes)作為內(nèi)參基因。在測(cè)試中，可以采用一個(gè)或多個(gè)基因作為內(nèi)參基因。

次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase)，即hprt1，是一種人類(lèi)蛋白，其作用是將5-磷酸核糖-1-焦磷酸鹽中的5-磷酸核苷基團(tuán)轉(zhuǎn)移至嘌呤上，可催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷酸也可催化鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷。hprt1在核苷酸再利用合成途徑中扮演重要角色。編碼hprt的基因?yàn)閔prt1(ensemb1：ensg00000165704)。

核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0)，即rplp0，是一種人類(lèi)蛋白，是組成核糖體60s亞基的一個(gè)核糖體蛋白，屬于l10p核糖體蛋白家族。它是一種帶有一個(gè)羧基末端的中性磷蛋白，與同樣帶有羧基末端的酸性核糖體磷酸蛋白p1和p2非常相似。p0蛋白可以與2個(gè)p1及p2形成的二聚體共同組成一個(gè)五聚體。p0蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。作為一個(gè)典型的基因編碼的核糖體蛋白，它有許多個(gè)已加工假基因分散在基因組中。編碼rplp0的基因?yàn)閞plp0(ensemb1：ensg00000089157)。

羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase)，即hmbs，是一種人類(lèi)蛋白，是羥甲基膽素合成酶超家族中的一員。這個(gè)蛋白是膽素從頭到尾合成途徑的第三個(gè)酶，可催化四個(gè)膽色素原分子合成線(xiàn)性的羥甲基膽素。編碼hmbs的基因?yàn)閔mbs(ensemb1：ensg00000256269)。

本發(fā)明提供了采用hprt1，rplp0和hmbs這三個(gè)基因的組合在用于制備研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征的試劑盒或裝置中作為內(nèi)參基因的用途。優(yōu)選的，所述試劑盒或裝置用于在受試者的顆粒細(xì)胞樣品中進(jìn)行研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征。對(duì)多囊卵巢綜合征的檢測(cè)也包括對(duì)多囊卵巢綜合征的診斷。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述試劑盒為用于通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征的試劑盒。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述裝置為用于研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征的基因芯片。

本發(fā)明還提供了用于研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征的試劑盒或裝置，其中采用hprt1，rplp0和hmbs的組合作為內(nèi)參基因。優(yōu)選的，所述試劑盒或裝置用于在顆粒細(xì)胞樣品中研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述試劑盒為用于通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征的試劑盒。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述有時(shí)裝置為用于研究或檢測(cè)多囊卵巢綜合征的基因芯片。

在本文中，蛋白符號(hào)不用斜體，并全部大寫(xiě)；基因符號(hào)使用斜體。例如蛋白核糖體磷酸化蛋白大亞基p0寫(xiě)為rplp0，編碼該蛋白的基因?qū)憺閞plp0。但有時(shí)在本文中基因符號(hào)也不使用斜體。例如有時(shí)本文中“rplp0”或“rplp0基因”表示編碼蛋白rplp0的基因rplp0。

附圖說(shuō)明

圖1為測(cè)試人員的顆粒細(xì)胞樣品的qrt-pcr的循環(huán)閾值(ct)。

圖2為測(cè)試人員的顆粒細(xì)胞樣品的基因表達(dá)穩(wěn)定性的genorm算法測(cè)試結(jié)果。

圖3為測(cè)試人員的顆粒細(xì)胞樣品的內(nèi)參基因組合中基因個(gè)數(shù)的genorm算法。

圖4為測(cè)試人員的顆粒細(xì)胞樣品的基因表達(dá)穩(wěn)定性的normfinder算法測(cè)試結(jié)果。

圖5為測(cè)試人員的顆粒細(xì)胞樣品的基因表達(dá)穩(wěn)定性的bestkeeper算法測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容和有益效果，該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

研究人員征集

本研究從2015年1月到2016年6月，涉及89個(gè)中國(guó)籍漢族婦女，年齡為29.12±3.01歲，來(lái)自山東大學(xué)附屬醫(yī)院。其中包括44個(gè)多囊卵巢綜合征(pcos)女性患者和正在接受輸卵管和/或男性不育治療的45個(gè)具有正常排卵功能的婦女?；颊呋蚣覍偃刻峁┝藭?shū)面同意通知書(shū)。本研究得到了道德委員會(huì)的同意。

實(shí)施例2

臨床和生化檢測(cè)

多囊卵巢綜合征(pcos)根據(jù)2003鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)診斷(chang，etal.，2004；fauser，etal.，2004)，包括以下三個(gè)臨床特征中的任何兩個(gè)：1.少/無(wú)排卵；2.臨床和/或生化高雄激素血癥；3.超聲檢查多囊卵巢，以及排除其它高雄性激素血癥相關(guān)的病理生理狀態(tài)，包括先天性腎上腺增生，cushing’s綜合征，和分泌雄激素的腫瘤。

所有相關(guān)被研究者到門(mén)診初診時(shí)測(cè)量人體參數(shù)，如腰圍、臀圍、身高和體重等。身體質(zhì)量指數(shù)(bmi)的計(jì)算為重量(公斤)除以高度的平方(m²)，或bmi＝kg/m²。靜脈血標(biāo)本在經(jīng)過(guò)12小時(shí)的禁食后于上午8點(diǎn)到10點(diǎn)之間采集。多囊卵巢綜合征婦女的所有血液樣本在卵泡期早期即月經(jīng)周期第3天-5獲得。血清卵泡刺激素(fsh)、黃體生成素(lh)、睪酮(t)、雌激素(e2)、孕酮(p)和催乳素(prl)使用自動(dòng)生化分析儀(奧林巴斯600生化分析儀，olympusdiagnosticagmbh，co.，愛(ài)爾蘭)測(cè)量。

下面的表1給出44個(gè)pcos患者及45例正常婦女的臨床和生化指標(biāo)。

表1多囊卵巢綜合征與正常女性測(cè)試者人體臨床數(shù)據(jù)

bmi：身體質(zhì)量指數(shù)；e2：雌激素；p：孕酮；prl：催乳素；t：睪酮；fsh：促卵泡激素；lh：促黃體生成素。

p值＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

本研究中的多囊卵巢綜合征患者及對(duì)照組婦女的臨床研究血清中雌激素(e2)、孕酮(p)、催乳素(prl)、卵泡刺激素(fsh)都沒(méi)有顯著性差異。正如預(yù)期的那樣，pcos組bmi顯著高于對(duì)照組7.8％(多囊卵巢綜合征24.20±4.73公斤/平方米，對(duì)照22.45±2.99公斤/平方米，95％ci：-1.771to9.411，t＝1.358，df＝87，p＜0.05)。除此之外，與對(duì)照組相比，pcos組表現(xiàn)出高水平的睪酮(t)33.9％(多囊卵巢綜合征：36.12±17.6ng/dl，對(duì)照：23.87±7.77，95％ci：6.540to17.96，t＝4.264df＝87，p＜0.0001)。盡管fsh水平在兩組沒(méi)有區(qū)別，但pcos患者的促黃體生成激素(lh)和lh/fsh明顯升高，分別為36.4％和39.8％(pcoslh：8.10±3.87iu/l，lh：對(duì)照5.1±1.84iu/l，95％ci：1.688to4.232，t＝4.624df＝87，p＜0.0001；pcoslh/fsh：1.33±0.74，對(duì)照0.80±lh/fsh比值：0.29，95％ci：0.2942to0.7658，t＝4.467df＝87，p＜0.0001)。

實(shí)施例3

顆粒細(xì)胞分離

從44個(gè)多囊卵巢綜合征(pcos)女性患者和對(duì)照組的正在接受輸卵管和/或男性不育治療的45個(gè)具有正常排卵功能的婦女分離得到顆粒細(xì)胞。排除有其它婦科或內(nèi)科疾病史的志愿者。所有的婦女在黃體中期開(kāi)始注射促性腺激素釋放激素(gnrh)激動(dòng)劑，通過(guò)超聲波掃描和血清雌二醇測(cè)定監(jiān)測(cè)卵泡大小。當(dāng)檢測(cè)到三個(gè)或更多的卵泡平均直徑達(dá)到r1.8cm時(shí)，超聲引導(dǎo)下取卵手術(shù)36小時(shí)前，iu給藥8000-10000人絨毛膜促性腺激素(profasi，serono)。麻醉后，通過(guò)17號(hào)雙腔穿刺針(k-ops-wood-1235，cook澳大利亞)取卵。在卵母細(xì)胞周?chē)占w粒細(xì)胞(gcs)，用pasteurpipette抽吸去除卵母細(xì)胞后，用dulbecco′smodifiedeaglemedium(dmem)培養(yǎng)基洗滌兩次，以作后續(xù)分析。用裂解液去除紅細(xì)胞。

實(shí)施例4

rna提取和cdna合成

采用trizolplusrnapurificationkit(lifetechnologies)從分離得到的顆粒細(xì)胞中提取總rna。采用nanodrop2000(thermoscientific)檢測(cè)rna純度，以a260：a280比值為1.9-2.1為合格標(biāo)準(zhǔn)?？俽na用reverse-transcribekit(takara)試劑盒轉(zhuǎn)錄為cdna，然后用無(wú)核酸酶水稀釋到20μl。得到的cdna經(jīng)1∶20稀釋后作為qrt-pcr的模板。

實(shí)施例5

實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)

本發(fā)明采用次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因的組合作為在待測(cè)者的顆粒細(xì)胞中進(jìn)行多囊卵巢綜合征(pcos)檢測(cè)時(shí)作為qpcr分析的內(nèi)參基因。為此，對(duì)實(shí)施例1-4所述的健康對(duì)照組和多囊卵巢綜合征(pcos)患者的顆粒細(xì)胞中的hprt1，rplp0和hmbs的表達(dá)進(jìn)行測(cè)量。

另外，作為比較，對(duì)其它以下12個(gè)基因在上述測(cè)試樣品中的表達(dá)也進(jìn)行了測(cè)試：

18s核糖體rna(18srrna)，β-肌動(dòng)蛋白(actb)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)、泛素c(ubc)，β-2-微球蛋白(b2m)，rna聚合酶ii亞基(polr2a)、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白z(ζ-tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenaseactivationprotein，ywhaz)，β-葡萄糖醛酸酶(gusb)，輸入蛋白8(importin8，ipo8)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglyceratekinase1，pgk1)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfrc)和核糖體蛋白l13a(rpl13a)。

qrt-pcr采用自動(dòng)工作站epmotion5075lh(eppendorf，germany)來(lái)對(duì)pcr試劑進(jìn)行精確加樣。擴(kuò)增反應(yīng)采用quantstudio^tm7flexreal-timepcrsystems(appliedbiosystem，usa)進(jìn)行，以及使用powerup^tmgreenmastermix(thermofisher)。擴(kuò)增條件如下：udg活化，50℃，2分鐘；dna聚合酶激活，95℃，2分鐘；40個(gè)循環(huán)包括變性，95℃，15秒和退火/延長(zhǎng)，55℃，30秒。采用熔解曲線(xiàn)確定擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。

qpcr中針對(duì)本發(fā)明的hprt1、rplp0和hmbs基因使用的引物序列為：

hprt1-fwd：tgacactggcaaaacaatgca(5′→3′)(seqidno.1)

hprt1-rev：ggtccttttcaccagcaagct(5′→3′)(seqidno.2)

rplp0-fwd：agcccagaacactggtctc(5′→3′)(seqidno.3)

rplp0-rev：actcaggatttcaatggtgcc(5′→3′)(seqidno.4)

hmbs-fwd：ggcaatgcggctgcaa(5′→3′)(seqidno.5)

hmbs-rev：gggtacccacgcgaatcac(5′→3′)(seqidno.6)

qpcr中檢測(cè)前述待測(cè)看家基因使用的引物序列如表2所示：

表2引物序列

采用qrt-pcr對(duì)44例pcos患者和45例對(duì)照婦女的上述15個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平測(cè)定其循環(huán)閾值(ct)，結(jié)果如圖1所示，其ct值表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的表達(dá)，范圍從最低的18srna的13.81±0.54到最高的hmbs的28.25±1.13，平均ct值為21.35±1.12。18srna和β肌動(dòng)蛋白是最豐富的基因，其次是gapdh，而表達(dá)最少的基因是hmbs。對(duì)這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)的測(cè)量發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)具有明顯的個(gè)體間差異，標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍從18srna的0.54到ubc的1.26。可見(jiàn)，還需要選擇更可靠的內(nèi)參基因或內(nèi)參基因組合才能夠在對(duì)多囊卵巢綜合征(pcos)，特別是在顆粒細(xì)胞樣品中進(jìn)行比較性基因表達(dá)研究作為基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部控制的內(nèi)參基因。

實(shí)施例6內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

(1)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估方法

本領(lǐng)域采用的評(píng)估待測(cè)基因組合作為內(nèi)參基因的使用的穩(wěn)定性的評(píng)估方法(chen，etal.，2011；zhang，etal.，2012)采取以下公式進(jìn)行綜合分析：

n＝幾何平均數(shù)(n1，n2，n3)(1)

即n＝(n1xn2xn3)^1/3

其中n為進(jìn)行分析的基因組群中各基因的表達(dá)的穩(wěn)定性數(shù)值，數(shù)值越小，表示穩(wěn)定性越好；n1為根據(jù)genorm算法得到的排名；n2為根據(jù)normfinder算法得到的排名；n3為根據(jù)bestkeeper算法得到的排名。即先采用genorm算法、normfinder算法和bestkeeper算法等三種算法測(cè)試得到各基因表達(dá)的穩(wěn)定性，然后計(jì)算這三種算法的排名的幾何平均數(shù)。通過(guò)公式(1)對(duì)genorm算法、normfinder算法和bestkeeper算法的排名進(jìn)行綜合排名，可以消除只用單一方法可能造成的誤差。

genorm算法(vandesompele，etal.，2002)可選擇一個(gè)理想的內(nèi)參基因組合，其中的內(nèi)參基因的表達(dá)比率受不同的實(shí)驗(yàn)條件和樣品等外部因素影響最小。穩(wěn)定性m值是基于一個(gè)待測(cè)內(nèi)參基因和所有其他待測(cè)內(nèi)參基因的成對(duì)變異分析(pair-wisevariationanalysis)，其值表示該內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。在算法中，最高m值的基因被逐一淘汰，重復(fù)這個(gè)選擇和排除過(guò)程，最后選擇兩個(gè)最穩(wěn)定表達(dá)的基因。最低m值的基因被認(rèn)為是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

normfinder算法(andersen，etal.，2004)的原理和genorm算法類(lèi)似，產(chǎn)生基因表達(dá)穩(wěn)定值，然后根據(jù)穩(wěn)定值排序，以表達(dá)穩(wěn)定值最小的基因作為最穩(wěn)定的基因。

bestkeeper算法(pfaffl，etal.，2004)是根據(jù)與bestkeeper指數(shù)相關(guān)的系數(shù)，即被測(cè)基因組合的ct值的幾何平均數(shù)，來(lái)測(cè)定基因表達(dá)的穩(wěn)定性。其中測(cè)算出變異系數(shù)(cv)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。具有最低cv和sd值的內(nèi)參基因則為表達(dá)最穩(wěn)定的基因。具有sd＞1的基因被排除。此算法考慮了bestkeeper指數(shù)和內(nèi)參基因間的pearson相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)系數(shù)(coefficientofdetermination，r²)和p值。

被測(cè)多囊卵巢綜合征患者和對(duì)照組的臨床特點(diǎn)的數(shù)值變量被表示為平均值±sd。使用spssv.19.0(spss公司，芝加哥，il，美國(guó))進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。p值小于0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(2)genorm算法測(cè)試結(jié)果

如圖2所示，本發(fā)明測(cè)試的3個(gè)基因(hprt1、rplp0和hmbs)以及其它12個(gè)內(nèi)參基因(18srrna、actb、gapdh、ubc、b2m、polr2a、ywhaz、gusb、ipo8、pgk1、tfrc和rpl13a)，在顆粒細(xì)胞中，其表達(dá)值m的平均數(shù)都低于genorm算法設(shè)定的閾值1.5。rpl13a和rlpp0具有最低的m值0.27，屬于此算法算出的表達(dá)最穩(wěn)定的基因，接著是β-actin(0.41)，hprt1(0.45)，ywhaz(0.46)，gapdh(0.49)，pgk1(0.52)，hmbs(0.53)，ubc(0.55)，ipo8(0.56)，b2m(0.58)，polr2a(0.60)，gusb(0.62)，trfc(0.64)，而18srna是表達(dá)最不穩(wěn)定的，m值為0.67。

(3)normfinder算法測(cè)試結(jié)果

如圖4所示，根據(jù)normfinder算法，在顆粒細(xì)胞樣品中，hprt1具有最低的m值0.07，屬于此算法算出的表達(dá)最穩(wěn)定的基因，接著是ywhaz(0.09)，actb(0.42)，hmbs(0.11)，pgk1(0.11)，ubc(0.12)，gapdh(0.19)，gusb(0.2)，ipo8(0.21)，polr2a(0.22)，rplp0(0.24)，18srna(0.24)，tfrc(0.25)，rpl13a(0.25)，而b2m是表達(dá)最不穩(wěn)定的，m值為0.28。

(4)bestkeeper算法測(cè)試結(jié)果

如圖5所示，根據(jù)bestkeeper算法，在顆粒細(xì)胞樣品中，gusb的sd(±ct)和cv(％ct)的值分別為0.70和2.67，屬于此算法算出的表達(dá)最穩(wěn)定的基因，接著是18srna(sd：0.40，cv：2.87)，hmbs(sd：0.90，cv：3.19)，ipo8(sd：0.88，cv：3.38)，tfrc(sd：0.85，cv：3.45)，polr2a(sd：0.88，cv：3.58)，hprt1(sd：0.88，cv：3.59)，rplp0(sd：0.75，cv：3.77)，rpl13a(sd：0.75，cv：3.97)，ywhaz(sd：0.88，cv：4.12)，pgk1(sd：0.95，cv：4.30)，actb(sd：0.76，cv：4.36)，ubc(sd：1.00，cv：4.72)，b2m(sd：0.93，cv：4.73)，而gapdh(sd：0.94，cv：5.02)是表達(dá)最不穩(wěn)定的。

(5)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估

根據(jù)(2)-(4)中根據(jù)genorm算法、normfinder算法和bestkeeper算法得到的待測(cè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性的排名，根據(jù)(1)中的公式，可得到表3：

表3內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名

可見(jiàn)，本發(fā)明采用的內(nèi)參基因組合中的三個(gè)基因的穩(wěn)定性在所測(cè)的15個(gè)基因中是最穩(wěn)定的。

實(shí)施例7內(nèi)參基因組合中采用基因個(gè)數(shù)的優(yōu)劣比較

genorm算法可通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化因子進(jìn)行成對(duì)差異分析(pair-wisevariationanalysis)來(lái)評(píng)估用于基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因的合適的個(gè)數(shù)(vandesompele，eta1.，2002)。在成對(duì)差異分析中，對(duì)于任何具有(vn/n+1)的值低于閾值0.15的n個(gè)內(nèi)參基因的組合，多一個(gè)(即n+1個(gè))的內(nèi)參基因不會(huì)顯著提高歸一化的效果，從而是不需要再多一個(gè)內(nèi)參基因的。

根據(jù)實(shí)施例5的44例pcos患者和45例對(duì)照婦女的上述15個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平的循環(huán)閾值(ct)的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)genorm算法進(jìn)行分析。

結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)v2/3值(r²of0.978)超過(guò)了閾值0.15，而v3/4值(r²of0.986)正好低于閾值0.15，這表明在顆粒細(xì)胞樣本中進(jìn)行多囊卵巢綜合征(pcos)的基因表達(dá)譜研究時(shí)用3個(gè)看家基因作為內(nèi)參基因是最合適的。

越來(lái)越多的證據(jù)證明，原來(lái)被認(rèn)為是在不同樣品中穩(wěn)定表達(dá)，差異最小的看家基因，在不同的生理或病理情況下在不同樣本(組織或細(xì)胞)中的表達(dá)也存在很大差異(meller，etal.，2005；patel，etal.，2002)。本發(fā)明在多囊卵巢綜合征(pcos)女性患者和具有正常排卵功能的婦女中，在通過(guò)顆粒細(xì)胞中的基因表達(dá)譜分析來(lái)研究多囊卵巢綜合征時(shí)，出乎意料地發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因在綜合評(píng)估(chen，etal.，2011；zhang，etal.，2012)中是表達(dá)最穩(wěn)定的看家基因。并且，在基因表達(dá)譜分析中，采用這三個(gè)基因的組合比其它采用一個(gè)、兩個(gè)或四個(gè)看家基因作為內(nèi)參基因更加適合。

由此，本發(fā)明提供了在通過(guò)細(xì)胞中的基因表達(dá)譜分析來(lái)研究多囊卵巢綜合征中，特別是在人的顆粒細(xì)胞樣品中，采用次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)、核糖體磷酸化蛋白大亞基p0(ribosomalproteinlateralstalksubunitp0，rplp0)和羥甲基膽素合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，hmbs)的基因的組合作為內(nèi)參基因的方法。這幾個(gè)內(nèi)參基因的組合能夠在基因表達(dá)譜分析，例如在實(shí)時(shí)熒光定量pcr、northernblot和基因芯片等應(yīng)用中，用作校正上樣量誤差或上樣過(guò)程中的操作誤差等差異，進(jìn)一步保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)多囊卵巢綜合征進(jìn)行研究或檢測(cè)(診斷)。

以下論文的全文引入到本申請(qǐng)，作為本發(fā)明的說(shuō)明的一部分。

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上面是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的說(shuō)明，不能將其看成是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的限制。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐將使用有機(jī)化學(xué)、聚合物化學(xué)、生物技術(shù)等的常規(guī)技術(shù)，顯然除在上述說(shuō)明和實(shí)施例中所特別描述之外，還可以別的方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。其它在本發(fā)明范圍內(nèi)的方面與改進(jìn)將對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，許多改變和變化是可行的，因此其在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

如無(wú)特別表示，本文中出現(xiàn)的溫度的單位“度”是指攝氏度，即℃。