本發(fā)明涉及藥物化學領域。具體涉及他克林類似基團和硫辛酸-他克林類似基團異二聯(lián)體及其藥物用途。

背景技術：

阿爾茲海默癥(alzheimer’sdisease，ad)是一種復雜的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是最常見與年齡相關的神經(jīng)衰退癥。臨床上ad經(jīng)常導致記憶減退、認知功能障礙，并伴隨侵略和抑郁等行為，重度ad患者可導致死亡。2016年全球ad報告中顯示：目前，全世界約有4700萬ad患者，比西班牙的全部人口還多，預計到2050年全球ad患者人數(shù)將達到1.31億人。2016年全球用于ad花費為8180億美元，預計到2018年花費將達到1萬億美元。隨著全球人口老齡化到來，ad患者的增長速率還將繼續(xù)增加。ad不僅對老年人身心健康產(chǎn)生嚴重的影響，還給家庭和社會帶來沉重的負擔。

ad患者的主要病理特征為神經(jīng)細胞外老年斑(senileplaques，sp)、神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillarytangle，nft)，突觸和樹突棘的喪失以及神經(jīng)元的丟失。ad的發(fā)病機制涉及多通路，多環(huán)節(jié)的異常，不同機制之間相互作用、相互影響。目前其發(fā)病機制還未完全闡明，僅存在多種假說，包括膽堿能假說、淀粉樣蛋白級聯(lián)假說、氧化應激假說、tau蛋白假說，金屬離子假說，以及炎癥和線粒體功能障礙假說等。

目前臨床上用于治療ad的藥物多為針對某一假說設計單靶點藥物，如針對膽堿能假說設計的乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitors，acheis)，針對淀粉樣蛋白假說設計的抑制β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，aβ)聚集的藥物和β-分泌酶(β-siteappcleavingenzyme，bace)抑制劑。此類化合物雖然能夠一定程度上緩解ad的發(fā)病進程，但不能完全治愈ad。以目前ad研究進展，ad的發(fā)病機制短期內(nèi)難以完全研究清楚，單靶點藥物又不能很好的治愈ad，因此多靶點藥物研究成為趨勢。

膽堿能假說是ad發(fā)病假說中重要假說。膽堿能系統(tǒng)在認知功能中起到重要作用，特別是在與大腦學習記憶相關的區(qū)域內(nèi)，如海馬和皮質(zhì)區(qū)?！澳憠A能假說”認為，認知功能的喪失與海馬和皮質(zhì)區(qū)的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的下降有關。在ad患者腦內(nèi)大量膽堿能神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，致使釋放到突觸間隙的乙酰膽堿(acetylcholine，ach)水平下降，進而影響腦內(nèi)神經(jīng)信號的傳導，導致認知和記憶功能障礙。通過抑制乙酰膽堿酯酶，可以減少ach的水解，增加突觸間隙中ach的水平，進而對抗膽堿能神經(jīng)元損傷和丟失引起的ach水平下降，增加信號傳導能力，從而改善ad患者的認知和記憶功能。目前上市的治療ad的藥物大多數(shù)都是根據(jù)這一假說開發(fā)出來的乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitors，acheis)。

他克林(tacrine，ta)是1993年被fda批準的第一個用于臨床治療ad的achei。然而，由于該藥臨床上引起患者體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平升高，很多患者不能耐受，因此ta使用很快受到限制，并于1998年被撤回并退出市場。但是，較強的抑制ache活性，分子量低(m.w.：198，低于其它被批準的ache抑制劑)，潛在抑制aβ毒性以及合成簡單的特點，使得ta再次成為研究的熱點。因此，怎樣對ta進行結構改造或修飾以降低其肝毒性被研究。

老年斑是ad的主要病理特征之一，其主要成分為β-淀粉樣蛋白(aβ)。老年斑的ad患者死后尸檢分析表明，ad患者腦內(nèi)的銅、鐵和鋅的含量大約是正常腦中含量的5.7、2.9和2.8倍。ad患者腦內(nèi)過量的金屬離子能促進氧化應激的產(chǎn)生，導致氧化性損傷。銅離子能抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體n-甲基-d-天冬氨酸(n-methyl-d-asparticacid，nmda)的過度激活，能促進aβ聚集和淀粉樣斑塊的形成。8-氨基喹啉衍生物bis(8-aminoquinolines)ligands是一種四配位銅離子螯合劑，通過與cu螯合產(chǎn)生cu-bis(8-aminoquinolines)絡合物。它們還可以減少由cu-aβ誘導的氧化損傷。其中，pa1637能夠高選擇性的螯合cu和對鋅離子幾乎沒有螯合能力，并且它幾乎可以完全逆轉(zhuǎn)注射aβ1-42的小鼠的記憶缺陷。以8-氨基喹啉為基礎開發(fā)治療ad的金屬離子螯合劑是一種切實可行策略。

氧化應激是指體內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的生成超過內(nèi)源性ros清除而引起的組織分子氧化，造成組織氧化性的損傷。氧化應激在ad的發(fā)病機理中起著重要的作用。氧化應激可以導致神經(jīng)元和線粒體功能障礙，并參與ad多個發(fā)病假說，共同引發(fā)并加重ad。目前，針對氧化應激假說治療ad的方法是通過抗氧化作用分子清除ros，來預防和治療ad。

α-硫辛酸(alphalipoicacid)，也稱為硫辛酸(la)，是幾乎存在于所有類型的原核和真核細胞中的天然存在的物質(zhì)，最初于1950年由美國reed等人從豬肝中分離提取得到。硫辛酸同時存在二硫戊環(huán)和終端羧基，因而它能夠具有親水性和疏水性的兩親性特點，在植物和動物中廣泛分布在細胞膜和細胞質(zhì)中。硫辛酸是目前已知唯一的同時在脂溶性和水溶性環(huán)境中都能發(fā)揮抗氧化性能的物質(zhì)，被醫(yī)學界譽為“萬能抗氧化劑”。

技術實現(xiàn)要素：

金屬離子在ad發(fā)生和發(fā)展中具有關鍵作用，金屬離子螯合劑特別是銅離子螯合劑是研發(fā)ad藥物的重要策略之一。8-氨基喹啉是良好的選擇性銅離子螯合劑。基于他克林和8-氨基喹啉結構的相似性，我們將他克林和8-氨基喹啉糅合到一個分子中，發(fā)明了他克林類似基團pz008(圖1式(i))。他克林類似基團pz008具有選擇性銅離子螯合和抑制乙酰膽堿酯酶的多靶點作用。

硫辛酸具有強大的抗氧化作用，基于氧化應激假說和多靶點治療ad的策略，我們將硫辛酸和他克林類似基團以連接鏈連接，發(fā)明了硫辛酸-他克林類似基團異二聯(lián)體(圖2式(ii))。此類化合物具有抗氧化、神經(jīng)保護、選擇性銅離子螯合以及抑制乙酰膽堿酯酶的多靶點作用。

本發(fā)明涉及圖1式(i)和圖2式(ii)中的化合物和其立體異構體，互變異構體，氮氧化物，溶劑化物，代謝產(chǎn)物，藥學上可接受的鹽和前藥，還包括藥用載體、輔劑、賦形劑、稀釋劑、媒介物，或它們的組合。

其中，圖2式(ii)中r為h，f，cl或br；

n＝2-7；y為c或n。

除非另外指明，本發(fā)明的化合物還意欲包括區(qū)別僅在于存在一個或多個同位素富集的原子的化合物。例如，具有本結構的除了用氘或氚替換氫，或者用¹³c或¹⁴c-富集的碳原子替換碳原子，或¹⁵n-富集的氮以為的化合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物或藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和預防阿爾茲海默癥的作用。

本發(fā)明另一方面涉及式(i)和式(ii)所示的化合物的制備、分離和純化的方法。

生物實驗結果表明，本發(fā)明提供的化合物是一類具有乙酰膽堿酯酶抑制作用，選擇性螯合銅離子作用以及抗氧化和神經(jīng)保護作用的多靶點小分子化合物。前面所述內(nèi)容只概述了本發(fā)明的某些方面，但并不限于這些方面。這些方面及其他方面的內(nèi)容將在下面作更加具體完整的描述。

反應路線列舉了制備本發(fā)明的化合物的方法。

稱取3-氨基吡啶-2-羧酸(5g，36mmol)加入100ml燒瓶，加入環(huán)己酮(4.2ml，40mmol)，氮氣保護，冷卻至0℃，緩慢加入32ml三氯氧磷，恢復至室溫，加熱到110℃，反應4h。反應結束后，加入100ml乙酸乙酯稀釋反應液，緩慢滴加入500g冰中，再加入200ml乙酸乙酯，用濃氨水調(diào)ph＝8-9，分離得有機相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑。粗品用硅膠柱層析純化，以石油醚∶乙酸乙酯(5∶1-3∶1)為洗脫劑得到橘紅色固體1(3.2g，40％)。

稱取1(100mg，0.46mmol)和苯酚(1g，10.6mmol)加入15ml封管中，加入1ml氨水，關閉封管，升溫至140℃，反應16h。tlc檢測反應結束后，反應液中加入2ml水，用二氯甲烷(10ml×3)萃取，得有機相。減壓蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，以乙酸乙酯(100％，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得淡黃色固體產(chǎn)物pz008(30mg，33％)。

稱取1(200mg，0.92mmol)加入10ml燒瓶中，加入5ml正戊醇溶解，加入1，3-丙二胺(0.23ml，2.76mmol)，加熱至155℃，回流反應18h。tlc檢測反應結束后，反應液用乙醚/hcl溶液調(diào)ph＝2，產(chǎn)生渾濁，用水(5ml×3)萃取，水相用飽和碳酸鈉溶液調(diào)ph＝10，用二氯甲烷(10ml×6)，得橙色液體，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，以乙酸乙酯(100％，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得棕色油狀產(chǎn)物2a(47mg，20％)。

稱取2a(30mg，0.12mmol)加入10ml燒瓶，加入3ml二氯甲烷溶解，加入hobt(20mg，0.15mmol)和三乙胺(50μl，0.36mmol)，然后攪拌下加入硫辛酸(24mg，0.12mmol)，然后再緩慢加入edci(28mg，0.15mmol)，室溫反應過夜。tlc檢測反應結束后，減壓蒸除溶劑，得粗品。粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得淡黃色固體pz010(27mg，50％)。

稱取1(200mg，0.92mmol)加入10ml燒瓶中，加入5ml正戊醇溶解，加入4-氨基哌啶(0.29ml，2.76mmol)，加熱至155℃，回流反應18h。tlc檢測反應結束后，反應液用乙醚/hcl溶液調(diào)ph＝2，產(chǎn)生渾濁，用水(5ml×3)萃取，水相用飽和碳酸鈉溶液調(diào)ph＝10，用二氯甲烷(10ml×6)，得橙色液體，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得棕色油狀產(chǎn)物2b(65mg，25％)。

稱取2b(50mg，0.18mmol)加入10ml燒瓶，加入3ml二氯甲烷溶解，加入hobt(30mg，0.22mmol)和三乙胺(75μl，0.54mmol)，然后攪拌下加入硫辛酸(37mg，0.18mmol)，然后再緩慢加入edci(42mg，0.22mmol)，室溫反應過夜。tlc檢測反應結束后，減壓蒸除溶劑，得粗品。粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得淡黃色固體pz013(34mg，41％)。

稱取1(200mg，0.92mmol)加入10ml燒瓶中，加入5ml正戊醇溶解，加入n-氨乙基哌嗪(0.36ml，2.76mmol)，加熱至155℃，回流反應18h。tlc檢測反應結束后，反應液用乙醚/hcl溶液調(diào)ph＝2，產(chǎn)生渾濁，用水(5ml×3)萃取，水相用飽和碳酸鈉溶液調(diào)ph＝10，用二氯甲烷(10ml×6)，得橙色液體，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得棕色油狀產(chǎn)物2c(89mg，31％)。

稱取2c(70mg，0.22mmol)加入10ml燒瓶，加入3ml二氯甲烷溶解，加入hobt(36mg，0.27mmol)和三乙胺(92μl，0.66mmol)，然后攪拌下加入硫辛酸(46mg，0.22mmol)，然后再緩慢加入edci(52mg，0.27mmol)，室溫反應過夜。tlc檢測反應結束后，減壓蒸除溶劑，得粗品。粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1-80∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得淡黃色固體pz020(52mg，46％)。

稱取1(200mg，0.92mmol)加入10ml燒瓶中，加入5ml正戊醇溶解，加入4-氨甲基哌啶(315mg，2.76mmol)，加熱至155℃，回流反應18h。tlc檢測反應結束后，反應液用乙醚/hcl溶液調(diào)ph＝2，產(chǎn)生渾濁，用水(5ml×3)萃取，水相用飽和碳酸鈉溶液調(diào)ph＝10，用二氯甲烷(10ml×6)，得橙紅色液體，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得棕色油狀產(chǎn)物2d(76mg，28％)。

稱取2d(60mg，0.20mmol)加入10ml燒瓶，加入3ml二氯甲烷溶解，加入hobt(32mg，0.24mmol)和三乙胺(84μl，0.6mmol)，然后攪拌下加入硫辛酸(41mg，0.20mmol)，然后再緩慢加入edci(46mg，0.24mmol)，室溫反應過夜。tlc檢測反應結束后，減壓蒸除溶劑，得粗品。粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1-70∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得淡黃色固體pz038(48mg，50％)。

稱取1(200mg，0.92mmol)加入10ml燒瓶中，加入5ml正戊醇溶解，加入1，3-二氨基-2-羥基丙烷(248mg，2.76mmol)，加熱至155℃，回流反應18h。tlc檢測反應結束后，反應液用乙醚/hcl溶液調(diào)ph＝2，產(chǎn)生渾濁，用水(5ml×3)萃取，水相用飽和碳酸鈉溶液調(diào)ph＝10，用二氯甲烷(10ml×6)，得橙色液體，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得棕色油狀產(chǎn)物2e(113mg，45％)。

稱取2e(100mg，0.37mmol)加入10ml燒瓶，加入3ml二氯甲烷溶解，加入hobt(60mg，0.44mmol)和三乙胺(155μl，1.11mmol)，然后攪拌下加入硫辛酸(76mg，0.37mmol)，然后再緩慢加入edci(84mg，0.44mmol)，室溫反應過夜。tlc檢測反應結束后，減壓蒸除溶劑，得粗品。粗品用硅膠柱層析純化，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1，氨水1ml/100ml)為洗脫劑得淡黃色固體pz062(85mg，50％)。

提供下列實施例進一步舉例說明本發(fā)明，它們不應當認為是對本發(fā)明范圍的限定。

附圖說明

圖1他克林類似基團結構式(i)

圖2硫辛酸-他克林類似基團異二聯(lián)體結構通式(ii)

圖3化合物與生物體內(nèi)常見金屬離子的相互作用的紫外-可見光吸收光譜圖

圖4化合物對谷氨酸誘導ht22細胞死亡的保護作用

實施例

實施例1：化合物pz008

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.63(dd，j＝4.1，1.5hz，1h)，8.20-8.04(m，1h)，7.58-7.37(m，1h)，5.41(s，2h)3.14-2.91(m，2h)，2.59(d，j＝6.3hz，2h)，2.07-1.81(m，4h)；

¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ158.56，146.43，145.49，140.14，134.96，132.68，122.80，111.09，33.12，22.8，21.82，21.41；

esi-msm/z：200.1[m+h]⁺。

實施例2：化合物pz010

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.65(s，1h)，8.14(d，j＝6.3hz，1h)，7.48(s，1h)，6.31(s，1h)，6.04(s，1h)，3.77(s，2h)，3.54(d，j＝5.3hz，1h)，3.41(s，2h)，3.25-2.95(m，4h)，2.86(d，j＝3.5hz，2h)，2.54-2.35(m，1h)，2.16(s，3h)，1.87(s，7h)，1.66(s，4h)，1.44(s，2h)；

¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ173.00，160.31，149.34，146.19，141.47，136.15，135.63，123.62，115.78，56.40，44.18，40.23，38.45，37.14，36.46，34.58，34.29，31.13，28.89，26.45，25.42，22.96，22.68；

esi-msm/z：445.2[m+h]⁺。

實施例3：化合物pz013

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.65(dd，j＝4.1，1.6hz，1h)，8.14(dd，j＝8.5，1.6hz，1h)，7.48(dd，j＝8.5，4.1hz，1h)，6.24(d，j＝10.1hz，1h)，4.41(d，j＝13.5hz，1h)，4.26-4.06(m，1h)，3.81(d，j＝13.4hz，1h)，3.57(dt，j＝12.7，6.4hz，1h)，3.20-3.09(m，2h)，3.07(t，j＝6.5hz，2h)，2.98-2.87(m，1h)，2.80(t，j＝5.4hz，2h)，2.50-2.40(m，1h)，2.32(q，j＝7.8hz，2h)，2.00(dd，j＝10.2，6.4hz，2h)，1.96-1.86(m，6h)，1.76-1.61(m，4h)，1.56-1.38(m，4h)；

¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ171.11，160.35，148.40，146.70，141.32，136.11，123.75，116.75，56.45，51.80，44.05，40.25，38.49，34.75，34.24，34.09，33.23，33.04，29.10，26.84，25.04，22.89，22.72；

esi-msm/z：471.2[m+h]⁺。

實施例4：化合物pz020

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.65(dd，j＝4.0，1.4hz，1h)，8.16(d，j＝8.0hz，1h)，7.47(dd，j＝8.5，4.1hz，1h)，6.77(s，1h)，3.84(s，2h)，3.66(s，2h)，3.58(dt，j＝12.8，6.5hz，1h)，3.49(d，j＝4.9hz，2h)，3.22-3.09(m，2h)，3.06(t，j＝6.5hz，2h)，2.86(t，j＝6.1hz，2h)，2.71(t，j＝6.0hz，2h)，2.45(dd，j＝15.4，9.4hz，4h)，2.33(t，j＝7.5hz，2h)，1.95-1.86(m，4h)，1.74-1.64(m，6h)，1.53-1.46(m，2h)；

¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ170.28，157.89，149.76，145.47，139.11，134.05，133.44，123.24，113.57，76.34，76.02，75.71，56.32，55.47，51.93，51.44，44.68，42.14，40.69，39.26，37.50，33.75，31.95，28.68，28.08，24.99，24.00，21.78，21.30；

esi-msm/z：500.2[m+h]⁺。

實施例5：化合物pz038

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.64(dd，j＝4.1，1.4hz，1h)，8.13(dd，j＝8.5，1.4hz，1h)，7.48(dd，j＝8.5，4.1hz，1h)，6.58(t，j＝6.5hz，1h)，4.64(d，j＝13.1hz，1h)，3.85(d，j＝13.5hz，1h)，3.53(ddd，j＝29.1，15.1，7.3hz，3h)，3.21-3.09(m，2h)，3.06(t，j＝6.4hz，2h)，2.97(t，j＝12.4hz，1h)，2.87(t，j＝6.2hz，2h)，2.58-2.41(m，2h)，2.32(t，j＝7.5hz，2h)，1.98-1.83(m，8h)，1.75-1.60(m，4h)，1.55-1.42(m，2h)，1.29-1.16(m，2h)；

¹³cnmr(101mhz，cdcl3)δ171.04，160.62，149.53，146.43，141.20，136.11，135.60，123.75，115.65，56.48，52.05，45.58，41.65，40.25，38.50，37.90，34.77，34.31，33.12，30.67，29.68，29.12，27.13，25.07，23.01，22.70；

esi-msm/z：485.2[m+h]⁺。

實施例6：化合物pz062

¹hnmr(400mhz，dmso)δ8.66(d，j＝3.1hz，1h)，8.05(d，j＝8.3hz，1h)，7.88(s，1h)，7.57(dd，j＝8.3，3.9hz，1h)，6.68(s，1h)，5.23(d，j＝4.7hz，1h)，3.78(dd，j＝10.6，5.9hz，1h)，3.71(d，j＝4.8hz，1h)，3.66-3.52(m，2h)，3.22-3.03(m，4h)，2.90(s，2h)，2.81(s，2h)，2.38(rd，j＝12.3，6.1hz，1h)，2.10(t，j＝7.2hz，2h)，1.85(dd，j＝16.5，9.6hz，5h)，1.64(dt，j＝13.5，6.7hz，1h)，1.54(dd，j＝17.9，8.0hz，3h)，1.34(dd，j＝15.0，7.5hz，2h)；

¹³cnmr(101mhz，dmso)δ172.95，159.59，149.30，146.36，141.57，136.29，135.32，124.13，114.71，69.78，56.57，49.66，43.15，40.36，38.55，35.65，34.59，34.25，28.80，26.17，25.55，23.11，22.75；

esi-msm/z：461.2[m+h]⁺。

實施例7：生物學評估

與生物體內(nèi)常見金屬離子的相互作用

化合物與金屬離子(銅離子、鋅離子)的相互作用通過紫外-可見光分光光度計進行測定研究。實驗操作：反應體系總體積1ml，用無水乙醇將化合物和金屬離子稀釋成所需濃度，其中待測化合物的終濃度為20μm，cucl2、zncl2、fecl2、fecl3溶液終濃度為20μm，同時設立單獨待測化合物組，單獨金屬離子組和溶劑對照組。室溫孵育30min。

首先在1cm石英比色皿中加入1ml乙醇掃描基線，再掃描無水乙醇為溶劑對照組，依次放入單獨金屬離子組溶液，待測化合物溶液以及化合物加金屬離子組溶液，用紫外-可見分光光度計掃描各實驗組在波長200nm到500nm的吸光度，波長間隔1nm。重復三次實驗。

實施例8：生物學評估

抑制谷氨酸誘導細胞毒性作用

小鼠海馬神經(jīng)元細胞株ht22，用含10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基，在37℃，飽和濕度，含體積分數(shù)為5％co2、95％空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用0.25％胰酶溶液消化，加入完全培養(yǎng)基使細胞懸浮，顯微鏡下細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×10⁵個/ml，接種96孔細胞培養(yǎng)板，100μl/孔，培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。實驗設置待測樣品組、空白組及溶劑對照組，棄去96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加入待測樣品組溶液，空白組加入不含化合物的完全培養(yǎng)基，溶劑對照組加入同濃度的dmso。預孵育30min后，加入5μl100mm谷氨酸。模型組不加待測化合物，直接加入5μl100mm谷氨酸。孵育24h后，培養(yǎng)完畢后，避光，每孔加入10μl5mg/mlmtt儲備液，培養(yǎng)2h。棄去96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，每孔加入100μldmso，振蕩使甲瓚完全溶于dmso，用酶標儀在570nm波長處測定每孔的吸光度值。采用公式化合物促進細胞的存活率(％)＝100％*(a待測化合物-a模型組)/(a模型組-a空白)計算細胞存活率。

實施例9：生物學評估

膽堿酯酶活性抑制

ellman(ellman，g.l.；etal.biochem.pharmacol.1961.)報道的比色法在37℃評估ache抑制活性。實驗設待測化合物組，對照組(0.1mph8.0pbs代替待測化合物)和空白組(酶稀釋液代替酶溶液)。96孔板中每孔分別加入酶溶液[2μl，終濃度分別為0.03u/ml(ache)和0.05u/ml(buche)]，dtnb(40μl，終濃度為500μm)，ph8.0pbs(118μl)和待測化合物(20μl，10×)，共200μl。37℃孵育20min，最后加入20μl底物。用酶標儀在412nm波長處測定反應體系0-5min的吸光度(1min/次，共6次)。每個濃度至少設2個復孔，重復三次實驗。

附表1化合物抑制乙酰膽堿酯酶(ache)和丁酰膽堿酯酶(buche)的活性

^amean±sdofatleastthreeindependentmeasurements.

^bselectivityforache＝ic50(buche)/ic50(ache).

^cnotavailable。