本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，主要涉及一種大豆蛋白及其編碼基因的應用及引物、表達載體和制備方法。

背景技術(shù)：

鹽堿、干旱等非生物脅迫是限制植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子。這些環(huán)境因子導致植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理代謝反應，表現(xiàn)為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引起不可逆?zhèn)Γ瑢е抡麄€植株死亡。因此，如何提高植物的抗逆功能，一直是人們研究的課題。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大豆蛋白及其編碼基因的應用及引物、表達載體和制備方法，該大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，本發(fā)明中旨在提供一種該大豆蛋白在提高植物耐鹽性中應用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種大豆蛋白的應用，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，將所述大豆蛋白用于提高植物或大腸桿菌的耐鹽性。

一種大豆蛋白的編碼基因的應用，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，將所述大豆蛋白的編碼基因用于提高植物或大腸桿菌的耐鹽性。

一種用于制備大豆蛋白或其編碼基因的引物，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

一種用于提高耐鹽性的表達載體，其中，所述表達載體為攜帶有seqidno.4所示的大豆蛋白基因，用于表達基因編碼為glyma06g25310.1的大豆蛋白。

所述的用于提高耐鹽性的表達載體，其中，所述表達載體用pet-28a蛋白表達載體重組得到，該大豆蛋白基因通過酶切位點ndei和xhoi連接在表達載體上。

一種用于提高耐鹽性的表達載體的制備方法，其中，其制備方法包括以下步驟：

擴增目的基因：以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進行pcr擴增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如seqidno.4所示；

構(gòu)建重組質(zhì)粒：將目的基因片段與經(jīng)ndei和xhoi雙酶切的蛋白表達載體pet-28a，通過t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pet-28a重組質(zhì)粒。

所述的用于提高耐鹽性的表達載體的制備方法，其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中，包括以下步驟：

將目的基因片段和經(jīng)過雙酶切的pet-28a蛋白表達載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補齊至10μl，16℃連接過夜。

有益效果：本發(fā)明中首次發(fā)現(xiàn)該蛋白可以提高大腸桿菌的耐鹽性，對于其在植物抗逆工程上的應用具有指導意義。該大豆蛋白可增強大腸桿菌的耐鹽性，由于很多抗逆基因在大腸桿菌和植物體系具有相似的抗逆功能，因此，該基因在植物抗逆領域具有潛在的應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中利用pcr擴增大豆基因片段的電泳結(jié)果圖(m為dl2000marker)。

圖2為本發(fā)明實施例1中利用菌落pcr驗證重組菌的電泳結(jié)果圖(m為dl2000marker)。

圖3為本發(fā)明實施例5中17號蛋白的誘導表達的電泳結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明實施例6中空載體轉(zhuǎn)化菌在不同濃度的高鹽lb固體培養(yǎng)基和正常固體培養(yǎng)基的生長結(jié)果圖。

圖5本發(fā)明實施例6中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在不同濃度的高鹽lb固體培養(yǎng)基和正常固體培養(yǎng)基的生長結(jié)果圖。

圖6本發(fā)明實施例6中空載體轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的存活率柱形圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種大豆蛋白及其編碼基因的應用及引物、表達載體和制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所提供的一種大豆蛋白及其編碼基因的應用，是將所述大豆蛋白或其編碼基因用于提高植物或大腸桿菌的耐鹽性。其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1。該大豆蛋白可增強大腸桿菌的耐鹽性，由于很多抗逆基因在大腸桿菌和植物體系具有相似的抗逆功能，因此，該大豆蛋白及其編碼基因在植物抗逆領域具有潛在的應用前景。

所述大豆蛋白的基因序列(seqidno.1)如下所示：

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtcctaactctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaacaccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacacataacaaaaaaaaaaagtgaaaaatggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctgaactggtgaggtcaaaagcctggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttagatctgtttgaaatgactgtagtttttgttaatgttatttctctgattgtttattgaaataacaatatacaattatagagcatagccgtatcatgtaccacccttgggtgtattggacagacgtgtagcttctagttgcttttgtaacattatgttgtaagatgtgatatggacctgtaatcatatatgtaaggaagtgatcctatata。

本發(fā)明中，以r0期和r15期大豆胚根作為實驗材料，采用100℃熱處理10min后離心獲得上清，富集得到的可溶性蛋白即為熱穩(wěn)定蛋白。根據(jù)蛋白組學和結(jié)構(gòu)預測結(jié)果，在r0期高表達蛋白中挑選了1個蛋白進行結(jié)構(gòu)和功能分析，該蛋白即本發(fā)明所述大豆蛋白。本發(fā)明中還提供用于擴增該大豆蛋白基因序列的引物，根據(jù)pmd19-t載體和基因的序列特點引入相應酶切位點的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內(nèi)切酶(ndei)和(xhoi)兩端的同源序列。引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’(seqidno.2)；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’(seqidno.3)。

本發(fā)明中還提供一種用于提高耐鹽性的表達載體，所述表達載體用pet-28a蛋白表達載體重組得到，該大豆蛋白基因通過酶切位點ndei和xhoi連接在表達載體上。

本發(fā)明中還提供一種用于提高耐鹽性的表達載體的制備方法，其制備方法包括以下步驟：

擴增目的基因：根據(jù)pmd19-t載體和基因的序列特點引入相應酶切位點的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內(nèi)切酶(ndei)和(xhoi)，以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進行pcr擴增，得到目的基因片段；目的基因片段的基因序列(seqidno.4)如下所示：

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctga。

構(gòu)件重組質(zhì)粒：將目的基因片段與經(jīng)ndei和xhoi雙酶切的蛋白表達載體pet-28a，通過t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pet-28a重組質(zhì)粒。pet-28a重組質(zhì)粒的基因序列(seqidno.5)如下所示：

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgaggcttcggccttgtttatctcatcaagcttgtgatgttcttcaccgttcacttttgttccttctatttccccaacttcaaattcatgagtacttttgacgtgatcctctttattcactccttccacttcaaccgttttgtctgcagtagtgcatgtttccaatttctctggctccccaaatccactatattcttttgtctcttcctgtggttgctcaatcttttcttcatcctttctcagaaaaacttcagagccctcagttactttgtcatcagctttatcttttaatgcaggtagttctccatcagcagcattggatttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacgagtggatttgttgacatctgtatcttccacactcttgtcatgattttcgtttacaacaaccttttccttctctatatcattatcacccttagtggtgtcatcagcttcttgcatctctgcttccttggtctcctcttctttttcttcctgggaaatttccttttgtgaagctgatgatcttttagtacgcttctttgggggctccctctgtgttggaggagctgccttggccttctcactgattcttgtagatcttcttggggtctcaccagtgccccagtcaaattctgatacagctgggcctccagggtgtgctttcaaatatttttccagctgcttcctgttattgatctcctctcctgttggtgcagtgaacacaatctcgtttttctttggggtaccagctttctttggaatgaactgcttcttccaaccaggtggagcaggaagctccaaagacaaagtttcctcgctcgcgccaccctccttctccactgcgctcgccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgca601ccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctg651cttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccag1051cgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaa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構(gòu)件重組質(zhì)粒過程中，可以包括以下步驟：

將目的基因片段和經(jīng)過雙酶切的pet-28a蛋白表達載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補齊至10μl，16℃連接過夜。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：基因的克隆

根據(jù)pmd19-t載體和基因的序列特點引入相應酶切位點的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內(nèi)切酶(ndei)和(xhoi)兩端的同源序列。

引物：f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

以基因的f和r作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進行pcr擴增。反應體系為5×phusionhfbuffer4μl，2.5mmdntp1.6μl，上下游引物各10mm，cdna模板1μl，dmso0.6μl，用水補齊至20μl。在pcr儀上98℃預反應30s，98℃反應5s，退火溫度依據(jù)引物tm值而定，72℃延伸反應時間依據(jù)基因長度而定，72℃10min，將反應產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上分離pcr產(chǎn)物，用紫外燈檢測，并按照核酸回收試劑盒的說明書操作收集特異性擴增產(chǎn)物。將擴增回收產(chǎn)物與takara的pmd19-tsimple載體按照摩爾比10:1的比例混合，加入等體積的solutionⅰ反應緩沖液，混勻后，輕微離心，置于16℃下水浴連接過夜。

本實施例中，是根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫中的核酸序列設計引物，以大豆胚根總cdna為模板，利用pcr方法擴增挑選出來的基因的序列，pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，擬擴增基因得到有效擴增，基因的分子量大小與預期分子量大小相近(如圖1所示)，連接t載后進行測序。將測序成功的克隆載體與蛋白表達載體pet-28a經(jīng)雙酶切后，通過t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pet-28a/重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21star，利用菌落pcr法對重組菌進行驗證(如圖2所示)。結(jié)果顯示構(gòu)建成功的重組菌能擴增到目的片段，表明成功構(gòu)建含目的基因的原核表達載體。

實施例2：超級感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

按照上海生工提供的超級感受態(tài)試劑盒提供的方法制備大腸桿菌top10和bl21star感受態(tài)，在超凈工作臺中挑取劃線培養(yǎng)的大腸桿菌單克隆菌株于5ml的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃，180rmp恒溫搖床中培養(yǎng)12h后，按照1:50比例接種到50ml新鮮配制的lb培養(yǎng)基中，至od600值約為0.6。將用50ml離心管收集菌體，8,000g離心3min。棄上清后將菌體冰上放置10min，4℃，5,000rmp離心5min，用試劑盒提供的buffera將菌體重懸后于冰上放置30min，4℃，5,000rmp離心5min，棄上清液，用試劑盒提供的bufferb(用前-20℃預冷)重懸菌體，用滅菌的1.5mlep管分裝，每管100μl。在-80℃冰箱中備用。

將10μl連接產(chǎn)物加入到含有100μl大腸桿菌感受態(tài)中，輕微混勻。將大腸桿菌感受態(tài)細胞放置于冰上30min，42℃熱激90s，冰上5min，加入900μl新鮮配制的lb液體培養(yǎng)基。在37℃，180rmp恒溫搖床中培養(yǎng)1h，取300μl菌液涂布于含有相應抗生素的lb固體培養(yǎng)基中，37℃下倒置培養(yǎng)15h。

實施例3：質(zhì)粒提取

利用omega公司提供的質(zhì)粒提取試劑盒操作，取1ml菌液于1.5ml的ep管中，8,000rmp，離心1min，重復3次，棄上清。向裝有菌體的ep管中加入bufferi200μl，用移液器充分吹打混勻后加入200μlbufferii，輕微顛倒混勻2次，室溫靜置1min，加入bufferiii300μl，顛倒混勻3次，整個過程不要超過5min。室溫，12,000rmp離心15min，吸取上清500μl，加入平衡好的核酸收集柱中，室溫，12,000rmp離心1min，棄廢液后向核酸收集柱中加入500μlhbbuffer，室溫12,000rmp離心1min，棄廢液，加入試劑盒中的600μlwbbuffer(預先加入800ml無水乙醇)，室溫12,000rmp離心1min重復2次，將核酸收集柱空轉(zhuǎn)，15,000rmp離心2min除去殘留的wbbuffer。向核酸收集柱內(nèi)加入30μl無菌水，用一個新ep管收集質(zhì)粒，室溫12,000rmp離心2min。

實施例4：蛋白表達載體的構(gòu)建

將含目的基因的pmd19-t載體按照基因引物設計的酶切位點做雙酶切反應，反應體系為限制性內(nèi)切酶各1μl，質(zhì)粒1μg，反應buffer2μl，用水補齊至10μl，反應5h，將反應產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切產(chǎn)物，在紫外燈下檢測?；厥漳康幕蚱危瑢⒛康幕蚱魏徒?jīng)過雙酶切的pet-28a蛋白表達載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補齊至10μl，16℃連接過夜。

實施例5：重組子的菌落pcr驗證

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21star感受態(tài)細胞，挑取少量長有轉(zhuǎn)化子的菌斑為模板，以引物來驗證重組子，pcr反應體系與過程同基因克隆。

在本實施例中，將構(gòu)建成功的pet-28a/蛋白重組菌擴大培養(yǎng)，加入0.1mmiptg在16℃下誘導12小時，離心收集菌并用balancebuffer重懸菌體，通過超聲破碎重組菌的細胞膜離心取上清液即為重組菌的總可溶性蛋白，以pet-28a空載體誘導前后為對照，如圖3所示，其中，1-4分別為bl21誘導前，bl21誘導后，17號蛋白誘導前，17號蛋白誘導后(理論分子量為12.3kda)。從結(jié)果可以看出經(jīng)過sds-page電泳檢測重組菌得到表達。

實施例6：500mm鹽脅迫下重組菌的存活率的測定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體轉(zhuǎn)化菌接入含1‰卡鈉(10mg/ml)的5mllb液體培養(yǎng)基中，在200rpm/min37℃的搖床中過夜培養(yǎng)；第二天轉(zhuǎn)接至含1‰卡鈉(10mg/ml)的5mllb液體培養(yǎng)基中，在200r/min37℃的搖床中擴培；將菌液濃度擴培至od600＝0.6—0.8之間后(重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體轉(zhuǎn)化菌的od600需調(diào)至一致)，以1‰的比例加入濃度為4.8mg/mliptg，在200r/min30℃的搖床中誘導4h，再測其od600(將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體轉(zhuǎn)化菌的od600需調(diào)至一致)并記錄。

將誘導后的菌液稀釋10、100、1000倍后，分別取100ul涂布在有500mmnacl的高鹽lb固體培養(yǎng)基(含1‰的卡納(10μg/ml，1‰的比例)，含iptg(4.8mg/ml，1‰的比例))和正常lb固體培養(yǎng)基(含1‰的卡納(10μg/ml)和iptg(4.8mg/ml))；正常lb固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h后，記錄能夠進行計數(shù)的平板上的菌斑數(shù)目(平板菌落數(shù)在30-300個之間為有效數(shù)據(jù))，高鹽培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后記錄菌斑數(shù)目(平板菌落數(shù)在30-300個之間為有效數(shù)據(jù))，最后計算存活率，繪制存活率柱形圖。

圖4和圖5分別為空載體轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在不同濃度的高鹽lb固體培養(yǎng)基和正常固體培養(yǎng)基的生長結(jié)果圖，其中，10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4分別表示稀釋倍數(shù)1、10、100、1000。圖6為空載體轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的存活率柱形圖，其中，p值為為0.0261、glyma06g25310.1蛋白的標準差為0.1961、空載的標準差為0.0143。

本實施例中將重組菌誘導后稀釋分別涂布在正常和高鹽的平板上，對菌斑數(shù)目進行計數(shù)(平板菌落數(shù)在30-300個之間為有效數(shù)據(jù))；以空載重組菌作為對照，計算重組菌的存活率。結(jié)果顯示，與空載重組菌的存活率對比，可證明重組菌中的對應蛋白是否具有耐鹽性。表達glyma06g25310.1蛋白的重組菌的存活率明顯高于空載重組菌(如圖6)，另外還進行了點板，更直觀的顯示了glyma06g25310.1蛋白的重組菌的存活率比空載重組菌的存活率更高(如圖4和5)，證明該蛋白是具有一定的耐鹽性。

應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。

sequencelisting

<110>深圳大學

<120>大豆蛋白及其編碼基因的應用及引物、表達載體和制備方法

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1408

<212>dna

<213>大豆（glycinemax(linn.)merr.）

<223>基因編碼為glyma06g25310.1的大豆蛋白基因序列

<400>1

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtccta60

actctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaa120

caccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacac180

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tggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttag1200

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<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>引物序列

<400>2

atggcgagcgcagtggagaag21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>引物序列

<400>3

tcagctctcgtgagtgccattc22

<210>4

<211>918

<212>dna

<213>人工序列

<223>目的基因片段的基因序列

<400>4

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagctt60

cctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaa120

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ggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaat900

ggcactcacgagagctga918

<210>5

<211>6177

<212>dna

<213>人工序列

<223>pet-28a重組質(zhì)?；蛐蛄?/p>

<400>5

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaa60

ggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctt120

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tttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacg540

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gtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca6177