本發(fā)明屬于醫(yī)藥與化妝品領域，特別涉及一種從植物中制備蛇床子素的方法及在制備化妝品中的應用。
背景技術：
：蛇床子素又名甲氧基歐芹酚，或歐芹酚甲醚，或喔斯腦(osthole，ost)，主要存在于傘形科和蕓香科植物中，是傘形科植物蛇床cnidiummonnieri(l.)cuss.或cnidiumformosanumyabe的干燥成熟果實中的主要活性成分，其化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素(7-methoxy-8-[3-methylpent-2-eny1]coumarin)，是蛇床子中含量最高的一種烴基香豆素類有效化學成分，為無色柱狀結(jié)晶，分子式:c15h16o3，相對分子質(zhì)量為244.29，熔點為82～84℃。蛇床子素的藥理實驗研究表明：蛇床子素具有抗高血壓、抗心律失常、抗衰老、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松癥、抗炎及抗變態(tài)、增強免疫功能等作用。在日化外用方面，蛇床子素有抗變態(tài)反應作用，有較強的抗組胺作用，能明顯拮抗組胺、慢性反應物質(zhì)，有較強的抗過敏作用；對各種變態(tài)反應、皮膚瘙癢、牛皮癬、帶狀瘡疹、濕疹具有較好的治療和保健效果；此外，蛇床子素有較強的抗病原微生物作用，對絮狀表皮癬菌、石膏樣小芽胞菌、羊毛狀小芽胞菌及廣譜菌均有抑制作用，對陰道滴蟲有較強的殺滅作用，能抑制各種炎癥因子的形成，具有很好地抑菌抗炎、殺蟲止癢，去粉刺作用。為了適應蛇床子素日益增長的需要，蛇床子素的制備研究有了較快的發(fā)展，但均有明顯的不足。如發(fā)明專利cn201110151743.5公開了一種從蛇床子中制備蛇床子素和異茴芹內(nèi)酯的工藝方法；方法是蛇床子粉末先經(jīng)超臨界co2萃取，得到蛇床子提取物，然后經(jīng)聚酰胺樹脂分離純化，得粗品，最后經(jīng)高速逆流色譜進一步提純，得蛇床子素和異茴芹內(nèi)酯純品；該工藝設備費用大、生產(chǎn)成本高，不適宜進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。又如發(fā)明專利cn201010182729.7公開了“一種提取蛇床子素的工藝”方法，該工藝方法中采用了微濾、超濾、納濾石油醚結(jié)晶、無水乙醇多次重結(jié)晶的方法，該工藝方法不僅相對復雜、成本高，而且石油醚用于大工業(yè)生產(chǎn)易產(chǎn)生安全隱患。再又如發(fā)明專利cn201010531931.6公開了“一種蛇床子素的制備方法”，該工藝方法中使用了naoh、koh等強堿處理，強堿易改變其蛇床子素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生副反應。還又如發(fā)明專利cn201010527673.4公開了“一種從中藥蛇床子中提取蛇床子素的方法”，該工藝方法方法雖簡單，也適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；但工藝方法中使用了濃度大于90％的乙醇溶液進行結(jié)晶與重結(jié)晶，由于90％的乙醇溶液對蛇床子素與雜質(zhì)的溶解性都很強，所以，不僅需要重結(jié)晶的次數(shù)多，而且對產(chǎn)品的得率的影響也較大。本發(fā)明提取分離蛇床子素的方法可克服上述不足，采用該方法生產(chǎn)，收率高，操作簡單，能耗低，易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化放大，目前還未見有報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種從植物中制備蛇床子素的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述方法制備得到的蛇床子素。本發(fā)明的再一目的在于提供上述方法和蛇床子素在制備化妝品中的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種從植物中制備蛇床子素的方法，包括如下步驟：(1)蛇床子素的提取：以傘形科植物的果實為原料，進行凈選、干燥、粉碎，得到粗粉；用體積百分比65％～95％的乙醇溶液加熱提取或加熱溫浸超聲提?。惶崛⊥旰?，固液分離，得到含蛇床子素的提取液；(2)蛇床子素粗體的分離：取含蛇床子素的提取液，回收乙醇至完全，得到濃縮液；在濃縮液中加入溫度為40～80℃的熱水進行溶解，接著冷卻，再于1～25℃靜置24小時以上，固液分離，棄去液體，收集固體，得到含蛇床子素的粗提物；(3)蛇床子素單體成分的精制純化：通過步驟①或步驟①和②進行精制純化；①第一次結(jié)晶：在蛇床子素粗提物中加入濃度為體積百分比50～60％的乙醇水溶液，加熱溶解，冷卻至室溫，第一次靜置，固液分離，取液體，棄去固體；固液分離所得液體于0～10℃環(huán)境中第二次靜置靜置至晶體充分析出，再固液分離，棄去液體，收集結(jié)晶；②重結(jié)晶；將得到的結(jié)晶再按照步驟①重結(jié)晶，得到蛇床子素的精制純化結(jié)晶。步驟(1)中所述的傘形科植物優(yōu)選為蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.或cnidiumformosanumyabe。步驟(1)中所述的粗粉優(yōu)選為15～20目的粗粉。步驟(1)中所述的乙醇溶液優(yōu)選濃度為體積百分比85～90％的乙醇溶液。步驟(1)中所述的加熱提取的次數(shù)優(yōu)選為2～3次；具體步驟優(yōu)選如下：提取次數(shù)為2次時：第一次加入相當于粗粉質(zhì)量(kg)10倍體積量(l)的乙醇溶液，充分攪拌混勻，于70～100℃回流提取1～3小時；第二次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于70～100℃回流提取0.5～2小時；提取次數(shù)為3次時：前兩次同提取次數(shù)為2次時的步驟，第三次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于70～100℃回流提取0.5～2小時；提取完后，固液分離，合并2～3次分離得到的液體，得到含蛇床子素的提取液；具體步驟更優(yōu)選如下：提取次數(shù)為2次時：第一次加入相當于粗粉質(zhì)量(kg)10倍體積量(l)的乙醇溶液，充分攪拌混勻，于80℃回流提取2小時；第二次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于80℃回流提取1.5小時；提取次數(shù)為3次時：前兩次同提取次數(shù)為2次時的步驟，第三次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于80℃回流提取1.5小時；提取完后，固液分離，合并2～3次分離得到的液體，得到含蛇床子素的提取液。步驟(1)中所述的加熱溫浸超聲提取中的超聲條件優(yōu)選為200～300hz；更優(yōu)選為250hz。步驟(1)中所述的加熱溫浸超聲提取的次數(shù)優(yōu)選為2～3次；具體步驟優(yōu)選如下：提取次數(shù)為2次時：第一次加入相當于粗粉質(zhì)量(kg)10倍體積量(l)的乙醇溶液，充分攪拌混勻，于60～80℃溫浸超聲提取0.5～2小時；第二次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于60～80℃溫浸超聲提取0.5～1.5小時；提取次數(shù)為3次時：前兩次同提取次數(shù)為2次時的步驟，第三次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于60～80℃溫浸超聲提取0.5～1.5小時；提取完后，固液分離，合并2～3次分離得到的液體，得到含蛇床子素的提取液；具體步驟更優(yōu)選如下：提取次數(shù)為2次時：第一次加入相當于粗粉質(zhì)量(kg)10倍體積量(l)的乙醇溶液，充分攪拌混勻，于60℃溫浸超聲提取1.5小時；第二次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于60℃溫浸超聲提取1小時；提取次數(shù)為3次時：前兩次同提取次數(shù)為2次時的步驟，第三次加入相當于粗粉質(zhì)量8倍體積量的乙醇溶液，于60℃溫浸超聲提取1小時；提取完后，固液分離，合并2～3次分離得到的液體，得到含蛇床子素的提取液。步驟(2)中所述的熱水優(yōu)選溫度為50～70℃的熱水；更優(yōu)選為60℃的熱水。步驟(2)中所述的熱水的添加量優(yōu)選為按1kg原料(傘形科植物的果實)得到的提取濃縮液加入熱水后的體積為1～2l計算；更優(yōu)選為加入熱水后的體積為1.5～1.8l計算。步驟(2)中所述的冷卻優(yōu)選為自然冷卻。步驟(2)中所述的冷卻的程度優(yōu)選為冷卻至30℃以下；更優(yōu)選為冷卻至25℃以下。步驟(2)中所述的靜置的條件優(yōu)選為于2～8℃靜置24～30h；更優(yōu)選為3～6℃靜置26～28h。步驟(3)①中所述的乙醇水溶液的濃度優(yōu)選為體積百分比53～57％；更優(yōu)選為體積百分比55～56％。步驟(3)①中所述的乙醇水溶液的添加量優(yōu)選為按1kg原料(傘形科植物的果實)得到的粗提物配比1～3l乙醇水溶液計算；更優(yōu)選為配比2l乙醇水溶液計算。步驟(3)①中所述的室溫指的是5～35℃；優(yōu)選為10～30℃；更優(yōu)選為20～28℃；最優(yōu)選為25℃。步驟(3)①中所述的第一次靜置的時間優(yōu)選為7～8小時。步驟(3)①中所述的第二次靜置的時間優(yōu)選為48小時以上；更優(yōu)選為72小時。步驟(3)①中所述的第二次靜置的溫度優(yōu)選為0～8℃；更優(yōu)選為1～2℃。步驟(3)②中所述的重結(jié)晶的次數(shù)優(yōu)選為1次，得到的蛇床子素的精制純化結(jié)晶的純度含量≥98％(w/w)。本發(fā)明中所述的固液分離可通過離心方式進行分離或是通過過濾方式進行分離。所述的方法在制備化妝品中的應用。一種精制的蛇床子素，通過上述方法制備得到，純度含量≥98％(w/w)。所述的精制的蛇床子素在制備化妝品中的應用。所述的化妝品為具有抗過敏、抑菌抗炎、去粉刺作用的化妝品。抗過敏是指蛇床子素制備的化妝品可抑制組胺的釋放，能較強地抑制被動皮膚過敏反應，能明顯抑制遲發(fā)性超敏反應，具有抗變態(tài)反應、止癢作用；抑菌抗炎、去粉刺是指蛇床子素制備的化妝品有較強的抗菌消炎作用，能抑制金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌等細菌；能顯著抑制各種急性和慢性炎癥，具有很好地抑菌抗炎、去粉刺作用。所述的精制的蛇床子素在制備化妝品中的應用，包括如下步驟：將所述的蛇床子素先溶解或加熱溶解于制備化妝品允許的藥物賦形劑或載體中，再與其他成分混合。所述的精制的蛇床子素在所述的化妝品中的含量是治療有效量。所述的制備化妝品允許的藥物賦形劑或載體可以選自：溶劑、增溶劑、防腐劑、抗氧劑、ph調(diào)節(jié)劑、促滲劑、脂質(zhì)體、保濕劑、增稠劑、螯合劑、膚感調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、乳化劑、推進/拋射劑、香精、色素，以及其他功效添加劑。所述的化妝品的形式是乳化體系、表面活性劑體系、外用搽劑、軟膏劑。為了說明從植物中制備蛇床子素及其在化妝品中的應用的有益效果，本發(fā)明以金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌為研究對象，通過藥敏紙片法、二倍稀釋法實驗證明本發(fā)明的制備的蛇床子素具有顯著的抗菌消炎作用；以雄性小鼠為研究對象，通過小鼠耳殼致炎法實驗，證明本發(fā)明的蛇床子素具有顯著的消炎止痛作用；以小鼠及大鼠為研究對象，通過抑制小鼠被動皮膚過敏(pca)反應，證明本發(fā)明的蛇床子素具有顯著的抗過敏作用；本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明從植物蛇床子中制備蛇床子素的方法，克服了蛇床子素制備的現(xiàn)已有co2超臨界流體萃取法、酸堿處理法、石油醚處理結(jié)晶法、高濃度醇處理結(jié)晶法等方法的缺點，根據(jù)蛇床子素的性質(zhì)與特點，發(fā)明了50～60％中等濃度醇處理去雜結(jié)晶的新方法，最大限度地保留了蛇床子素的含量與活性。(2)本發(fā)明從植物蛇床子中制備蛇床子素的方法中，蛇床子素單體成分的精制純化，首次發(fā)明了通過加入中等濃度乙醇水溶液熱溶、室溫除雜、冷藏析晶的方法，不僅可將雜質(zhì)有效祛除，而且蛇床子素的轉(zhuǎn)移率高(約88％)。(3)由于蛇床子素水溶性差，不利于直接應用于化妝品，常采用包合的方式對其進行處理，否則其制備的化妝品易產(chǎn)生撮泥感及活性成分難被皮膚吸收。本發(fā)明巧妙利用了蛇床子素的特性及化妝品制備的多相組成，將蛇床子素先溶解或加熱溶解于制備化妝品允許的脂溶性的賦形劑或載體中，其蛇床子素無需包合，即能達到克服上述不足，大大地節(jié)約了成本。(4)采用本發(fā)明所提供的方法，工藝流程簡單，操作方便，產(chǎn)品質(zhì)量控制方便，有可操作性，是適合于工業(yè)生產(chǎn)的安全可靠的制備方法。附圖說明圖1是實施例1從蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中制備的蛇床子素照片圖。圖2是實施例1從蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中制備得到的蛇床子素hplc色譜圖；其中，圖a為蛇床子素對照品，圖b為蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中制備的蛇床子素樣品。圖3是實施例2從蛇床cnidiumformosanumyabe中制備得到的蛇床子素照片圖。圖4是實施例2從蛇床cnidiumformosanumyabe中制備得到的蛇床子素hplc色譜圖；其中，圖a為蛇床子素對照品，圖b為蛇床cnidiumformosanumyabe中制備的蛇床子素樣品。圖5是實施例1從蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中制備的蛇床子素照片圖。圖6是實施例1從蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中制備得到的蛇床子素hplc色譜圖；其中，圖a為蛇床子素對照品，圖b為蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中制備的蛇床子素樣品。具體實施方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1從植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中提取制備蛇床子素一(1)蛇床子素的提取以植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實為原料，進行凈選，經(jīng)過干燥，粉碎成約20目的粗粉。取蛇床子粗粉1000g，加入10倍量(10l)的濃度為體積百分比為85％的乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至80℃回流提取2小時，過濾，濾液待用；濾渣繼續(xù)加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至80℃回流提取1.5小時，過濾，濾液待用；濾渣繼續(xù)加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至80℃回流提取1.5小時，過濾，濾液與前二次的濾液合并得蛇床子素的提取液，待用；濾渣棄去。(2)蛇床子素粗體的分離取上述蛇床子素的提取液，減壓回收乙醇至盡，得濃縮液(約800ml)，加60℃的熱水調(diào)整至1500ml的溶液，充分攪拌混勻，放冷至室溫，置約5℃冷藏室中，靜置28小時，4000r/min離心分離20min，棄去上清液，收集沉淀，得蛇床子素的粗提物沉淀約185g。(3)蛇床子素單體成分的精制純化取上述蛇床子素的粗提物沉淀，加入濃度為55％(v/v)的乙醇水溶液2000ml，60℃加熱，攪拌溶解后，過濾，棄去沉淀，濾液放至室溫(約25℃)，靜置8小時，過濾，棄去沉淀；濾液置2℃冷藏室中，靜置72小時析晶，再過濾分離，棄去濾液，收集結(jié)晶得蛇床子素粗晶22.8g；所得結(jié)晶按上述方法再處理重結(jié)晶一次，得蛇床子素的精制純化結(jié)晶20.3g。按藥典蛇床子中蛇床子素的含量測定方法測定，測得蛇床子素的純度含量為98.9％，其蛇床子素照片圖及測定色譜圖分別見圖1與圖2。原料蛇床子(果)中蛇床子素含量為2.31％，蛇床子素轉(zhuǎn)移率為87.9％。對比例1以植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實為原料，按發(fā)明專利cn201010527673.4“一種從中藥蛇床子中提取蛇床子素的方法”的實施例3的方法，取蛇床子粗粉1000g，提取制備蛇床子素，得蛇床子素的精制純化結(jié)晶10.2g，測得蛇床子素的純度含量為99.1％，蛇床子素轉(zhuǎn)移率為44.2％。實施例2從蛇床cnidiumformosanumyabe的果實中提取制備蛇床子素(1)蛇床子素的提取以植物蛇床cnidiumformosanumyabe的果實為原料，進行凈選，經(jīng)過干燥，粉碎成約18目的粗粉。取蛇床子粗粉1000g，加入10倍量(10l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至80℃回流提取2小時，過濾，濾液待用；濾渣繼續(xù)加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至80℃回流提取1.5小時，過濾，濾液待用；濾渣繼續(xù)加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至80℃回流提取1.5小時，過濾，濾液與前二次的濾液合并得蛇床子素的提取液，待用；濾渣棄去。(2)蛇床子素粗體的分離取上述蛇床子素的提取液，減壓回收乙醇至盡，得濃縮液(約750ml)，加60℃熱水調(diào)整至1500ml的溶液，充分攪拌混勻，放冷至室溫，置約5℃冷藏室中，靜置26小時，4000r/min離心分離20min，棄去上清液，收集沉淀，得蛇床子素的粗提物沉淀約181g。(3)蛇床子素單體成分的精制純化取上述蛇床子素的粗提物沉淀，加入濃度為55％(v/v)的乙醇水溶液2000ml，60℃加熱，攪拌溶解后，過濾，棄去沉淀，濾液放至室溫(約25℃)，靜置7小時，過濾，棄去沉淀；濾液置1℃冷藏室中，靜置72小時析晶，再過濾分離，棄去濾液，收集結(jié)晶得蛇床子素粗晶21.3g；所得結(jié)晶按上述方法再處理重結(jié)晶一次，得蛇床子素的精制純化結(jié)晶19.7g。按藥典蛇床子中蛇床子素的含量測定方法測定，測得蛇床子素的純度含量為99.1％，其蛇床子素照片圖及測定色譜圖分別見圖3與圖4。原料蛇床子(果)中蛇床子素含量為2.27％，蛇床子素轉(zhuǎn)移率為86.8％。其蛇床子素照片圖及測定色譜圖分別見圖3與圖4。對比例2以植物蛇床cnidiumformosanumyabe的果實為原料，按發(fā)明專利cn201010527673.4“一種從中藥蛇床子中提取蛇床子素的方法”的實施例3的方法，取蛇床子粗粉1000g，提取制備蛇床子素，得蛇床子素的精制純化結(jié)晶10.8g，測得蛇床子素的純度含量為98.8％，蛇床子素轉(zhuǎn)移率為47.6％。實施例3從植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實中提取制備蛇床子素二(1)蛇床子素的提取以植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果實為原料，進行凈選，經(jīng)過干燥，粉碎成約15目的粗粉。取蛇床子粗粉1000g，加入10倍量(10l)的90％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至60℃超聲(250hz)提取1.5小時，過濾，濾液待用；濾渣繼續(xù)加入8倍量(8l)的90％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至60℃超聲(250hz)提取1.0小時，過濾，濾液待用；濾渣繼續(xù)加入8倍量(8l)的90％(v/v)乙醇水溶液，充分攪拌混勻，加熱至60℃超聲(250hz)提取1.0小時，過濾，濾液與前二次的濾液合并得蛇床子素的提取液，待用；濾渣棄去。(2)蛇床子素粗體的分離取上述蛇床子素的提取液，減壓回收乙醇至盡，得濃縮液(約700ml)，加60℃熱水調(diào)整至1800ml的溶液，充分攪拌混勻，放冷至室溫，置約5℃冷藏室中，靜置28小時，4000r/min離心20min分離，棄去上清液，收集沉淀，得蛇床子素的粗提物沉淀約173g。(3)蛇床子素單體成分的精制純化取上述蛇床子素的粗提物沉淀，加入濃度為56％(v/v)的乙醇水溶液2000ml，60℃加熱，攪拌溶解后，過濾，棄去沉淀，濾液放至室溫(約25℃)，靜置8小時，過濾，棄去沉淀；濾液置1℃冷藏室中，靜置72小時析晶，再過濾分離，棄去濾液，收集結(jié)晶得蛇床子素粗晶22.4g；所得結(jié)晶按上述方法再處理重結(jié)晶一次，得蛇床子素的精制純化結(jié)晶20.1g。按藥典蛇床子中蛇床子素的含量測定方法測定，測得蛇床子素的純度含量為99.4％，其蛇床子素照片圖及測定色譜圖分別見圖5與圖6。原料蛇床子(果)中蛇床子素含量為2.31％，蛇床子素轉(zhuǎn)移率為87.0％。實施例4：本發(fā)明方法提取分離的蛇床子素體外抑菌作用研究蛇床子系傘形科蛇床屬植物蛇床(cnidiummonnieric(l.)cusson.)的果實，中藥蛇床子常常指的就是這一種。另一種為cnidiumformosanumyabe。兩種蛇床子在我國各地均有生長，但以前一種居多。江蘇、安徽兩省是蛇床子的主產(chǎn)地。蛇床子自古以來多作為外用藥使用.我國古代醫(yī)藥著作中有關它的用途記載很少，主要外用于治療皮膚病.如《神農(nóng)本草經(jīng)》中有“主治濕癬，惡瘡”；《集簡方》有“婦人陰癢，以蛇床子許末和豬油涂之”的記載；《本草綱目》記載有去陰汗、濕癬等作用，主治陰道滴蟲、皮膚濕疹等作用。蛇床子素有較好的抗菌消炎作用，能抑制金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌等細菌，抗菌譜廣，實驗方法和結(jié)果如下:1材料與方法1.1儀器dy6000ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)；ht-20-5mt雙人超凈臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；微量移液器(上海熱電儀器有限公司)；ldzx-50k高壓滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)。1.2試藥蛇床子素按本發(fā)明方法由實施例1從植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cus-son.的果實中提取制備而得，經(jīng)蛇床子素對照品的hplc對照，并按藥典蛇床子中蛇床子素的含量測定方法測定，測得蛇床子素的純度含量為98.9％，其蛇床子素照片圖及測定色譜圖分別見圖1與圖2。1.3菌種金黃色葡萄球菌(cmcc26003)、金黃色葡萄球菌耐藥菌(s4050)、大腸桿菌(jm110)、痢疾志賀氏菌(cmcc51252)、鼠傷寒沙門氏菌(cmcc50115)、綠膿桿菌(cmcc10104)均從廣東省微生物菌種保藏中心購買。2方法與結(jié)果2.1蛇床子素脂肪乳溶液及空白脂肪乳溶液的制備2.1.1蛇床子素脂肪乳溶液的制備將實施例1制備的蛇床子素1.5g加入15ml的大豆油，60℃水浴中加熱至蛇床子素完全容解，在通氮氣的條件下，將大豆磷脂1.5g加入到大豆油中，高速搗碎至大豆磷脂完全溶解，保持溫度60℃得油相；取純化水50ml置容器中，攪拌狀態(tài)下緩緩加入甘油15g，加熱升溫至60℃，攪拌均勻制得水相；在60℃恒溫和高速分散乳化12000rpm的條件下，將油相緩緩加入水相中，至混合均勻，加純化水調(diào)整至100ml，投入勻質(zhì)機中，調(diào)節(jié)均質(zhì)壓力60mpa、均質(zhì)溫度60℃、均質(zhì)10次，350目濾器過濾，得15mg·ml-1蛇床子素脂肪乳溶液，備用。2.1.2空白脂肪乳溶液的制備取15ml的大豆油，在通氮氣的條件下，將大豆磷脂1.5g加入到大豆油中，高速12000rpm搗碎至大豆磷脂完全溶解，保持溫度60℃得油相；取純化水50ml置容器中，攪拌狀態(tài)下緩緩加入甘油15g，加熱升溫至60℃，攪拌均勻制得水相；在60℃恒溫和高速分散乳化12000rpm的條件下，將油相緩緩加入水相中，至混合均勻，加純化水調(diào)整至100ml，投入勻質(zhì)機中，調(diào)節(jié)均質(zhì)壓力60mpa、均質(zhì)溫度60℃、均質(zhì)10次，350目濾器過濾，得空白脂肪乳溶液，備用。2.2菌液的制備將不同菌種的單個菌落分別接種于lb培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床增菌培養(yǎng)18～24h。再取出少量菌液，用滅菌0.9％氯化鈉溶液稀釋至107～108cfu·ml-12.3抑菌實驗2.3.1藥敏紙片法制作含有不同濃度蛇床子素且直徑為5mm的藥敏紙片。將不同的菌種100μl涂布于lb培養(yǎng)基上，當培養(yǎng)基表面干燥后，將紙片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h后，觀察并測定抑菌環(huán)直徑，重復3次，陰性對照組用空白脂肪乳溶液紙片。2.3.2二倍稀釋法在5ml帶塞滅菌試管中分別加入各菌種所需培養(yǎng)基2.0ml，每種菌種各8管。按1～8編號，分別在第1管中加入蛇床子素脂肪乳溶液2ml，混勻后取出2.0ml放入第2管，采用二倍稀釋法，依次將藥液吸收成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64系列溶液，即含藥量分別為7.50，3.75，1.88，0.94，0.47，0.24mg·ml－1。各管均加入濃度約為5×105cfu·ml－1的各病原指示菌菌液0.2ml，同時分別設陰性對照管(含藥液不含菌液)，陽性對照管(含菌液不含藥物)。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察菌種生長情況。病原菌濃度計算方法:觀察平板上的菌落形成的單位(cfu)。cfu≤5的濃度為抑菌濃度，標記“-”號，cfu≥5的濃度為無抑菌濃度，標記“+”，產(chǎn)生抑菌作用的最小濃度表示該管藥量即是受試藥的最低抑菌濃度(mic)。2.4結(jié)果與討論2.4.1結(jié)果紙片法測定蛇床子素對6種菌的抑菌活性見表1；二倍稀釋法測定蛇床子素對6種菌的mic值見表2。表1蛇床子素對6種菌的平均抑菌環(huán)直徑mm表2蛇床子素對6種菌的mic值n＝3，mg·ml-1由表1，2可知，蛇床子素對6種菌均有明顯的抑菌作用，并隨著濃度的增加抑菌作用增強。其中對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、綠膿桿菌和大腸桿菌的抑菌作用最強，mic均為0.94mg·ml-1；對鼠傷寒沙門氏菌抑菌作用其次，mic為1.88mg·ml-1；對痢疾志賀氏菌抑菌作用最弱，mic為3.75mg·ml-1。2.4.2討論本發(fā)明用藥敏紙片法和試管二倍稀釋法考察了蛇床子素對黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌抑菌作用。研結(jié)果顯示蛇床子素對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、綠膿桿菌和大腸桿菌抑菌作用最強，其次是鼠傷寒沙門氏菌，對痢疾志賀氏菌作用較弱。結(jié)果提示：蛇床子素及其化妝品制劑在臨床有較強的抗菌消炎作用，能抑制黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌等細菌；有顯著的抗菌消炎，去粉刺作用。實施例5：本發(fā)明方法提取分離的蛇床子素消炎止痛作用實驗蛇床子素脂肪乳溶液有較好的抗菌作用，能抑制黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌等細菌；此外，蛇床子素具有消炎止痛作用，實驗方法和結(jié)果如下:1試藥1.1蛇床子素脂肪乳溶液及空白脂肪乳溶液的制備:如上實施例4中2.1所制，供腹腔注射用。1.2消炎痛:上海醫(yī)藥公司產(chǎn)品，臨用前，制成5mg/ml，供腹腔注射用。2實驗動物與環(huán)境昆明小鼠，雄性，體重20±2g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證明編號：no.44411600000901。實驗動物使用許可證號：syxk(粵)2013-0002。實驗環(huán)境條件:溫度23℃±2℃，相對濕度60％±10％，室內(nèi)以自然光照明為主，通風良好，且環(huán)境保持安靜，spf級實驗動物環(huán)境設施。將120只小鼠分為2個大組，每個大組60只；每個大組又分為空白脂肪乳溶液對照組、消炎痛作陽性對照組、蛇床子素脂肪乳溶液小、中、大三個劑量給藥組，各組12只。3實驗方法參照中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局主編《新藥臨床前研究指導原則匯編》的方法二3.1小鼠扭體實驗小鼠分組后，以空白脂肪乳溶液作陰性對照，消炎痛作陽性對照，腹腔注射給藥，40～60分鐘后，腹腔注射0.6％醋酸0.2m1，在其后15分鐘內(nèi)觀察小鼠扭體次數(shù)。比較組間顯著性差異(說明:小鼠扭體反應指小鼠因受到疼痛刺徽而產(chǎn)生的腹部內(nèi)凹，軀干與后腿伸張，臀部高起的現(xiàn)象)。3.2小鼠耳殼致炎法小鼠分組后，用空白脂肪乳溶液作陰性對照，消炎痛作陽性對照，藥物注射劑腹腔注射，給藥30分鐘后，二甲苯0.03-0.05ml清抹在小鼠右耳耳殼內(nèi)外。3小時后處死小鼠并取下右耳殼，同時取下左耳殼對照，8mm的打孔器分別在左、右耳打下圓耳片后，于分析天平上稱量，計算出腫脹度。(腫脹度＝右耳耳殼重量-左耳耳殼重量)。比較組間顯著性差異。4實驗結(jié)果表3蛇床子素對醋酸誘導小民扭體的抑制作用(n＝12)*p<0.05，**p<0.o1與空白脂肪乳溶液組相比。表4蛇床子素對二甲苯誘導的小鼠耳殼腫脹的抑制作用(n＝12)*p<0.05，**p<0.01與空白脂肪乳溶液組相比。實驗結(jié)果表明，蛇床子素對醋酸誘導的小鼠扭體有顯著的抑制作用，且作用強度與劑量相關。且大、中2個劑量組優(yōu)于消炎痛。結(jié)果見表3。實驗結(jié)果又表明：蛇床子素對小鼠耳殼腫脹有顯著的抑制作用，抑制作用隨劑量的增加而增加.且大、中2個劑量作用強度強于消炎痛組。結(jié)果見表4。5結(jié)論本實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的蛇床子素具有顯著的消炎止痛作用。作用強于消炎痛?？梢杂糜谥苽涮烊换瘖y品或消炎止痛藥物。實施例6：本發(fā)明方法提取分離的蛇床子素抗變態(tài)反應作用實驗蛇床子素可用于化妝品的另一重要作用是其抗變態(tài)反應，本文以小鼠及大鼠為研究對象，通過抑制小鼠被動皮膚過敏(pca)反應、抑制大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒，證明本發(fā)明的蛇床子素具有顯著的抗過敏作用，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下：1試藥1.1蛇床子素脂肪乳溶液及空白脂肪乳溶液的制備:如上實施例4中2.1所制，供口服及腹腔注射用。1.2天花粉注射液：上海生化制藥廠產(chǎn)品，用0.5％伊文思藍、生理鹽水配成1.00mg/ml、1.25mg/ml，供注射用；氫氧化鋁凝膠為市場購買。1.3抗血清：按徐叔云等主編《藥理實驗方法學》(第1版，北京:人民衛(wèi)生出版社，1982:923)的方法制取。1.4色甘酸鈉注射液：上海生化制藥廠產(chǎn)品，用生理鹽水配成5.8mg/ml，供注射用。2實驗動物昆明小鼠(體重20±2g)、wister大鼠(體重200g±20g)，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證明編號：no.44411600000901。實驗動物使用許可證號：syxk(粵)2013-0002。3實驗方法3.1小鼠被動皮膚過敏(pca)試驗取健康小鼠，將腹部脫毛后于皮內(nèi)注射抗血清0.03ml(血清稀釋10倍)，48h后尾靜脈注射天花粉注射液(1.25mg/ml)0.2ml，進行攻擊30min后斷頭處死動物，翻轉(zhuǎn)腹部皮膚，測量藍斑直徑并剪下色斑皮片，分別浸于5ml丙酮生理鹽水(7:3)，24h后洗脫，用分光光度計在610nm波長比色，讀出光密度。3.2大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒試驗取健康大鼠，腳掌注射天花粉-氫氧化鋁凝膠混懸液，4個腳掌共注射0.4ml，即每鼠注射天花粉1mg，注射后15d，腹腔注射被試藥物，0.5h后乙醚麻醉，股動脈放血處死動物，剪開腹部皮膚，向腹腔內(nèi)注入ph6.9的hank氏液(不含酚紅)10ml，內(nèi)含肝素0.005％，輕輕按摩腹部2min，然后打開腹腔，以滴管將腹腔液收集于試管中，放冰浴冷卻后以1000r/min離心15min，棄上清液，將沉淀物懸于2mlhank氏液中，放冰箱備用。取上述肥大細胞懸液0.5ml，加人等量抗原液(含天花粉1mg/ml)，37℃保溫15min，0.125％中性紅染色，高倍鏡下觀察100個肥大細胞，按(1-a/q)×100％公式計算藥物對肥大細胞脫顆粒的抑制百分率。式中a和q分別表示給藥組和對照組脫顆粒細胞數(shù)。4實驗結(jié)果4.1蛇床子素對小鼠pca反應的抑制作用取小鼠30只，腹部皮內(nèi)注射抗血清后均分為三組，對照組灌服空白脂肪乳溶液，另兩組分別一次灌服蛇床子素100mg/kg和200mg/kg的脂肪乳溶液。三組動物的藍斑直徑及光密度見表5。結(jié)果表明蛇床子素對小鼠pca反應有較強抑制作用。表5蛇床子素對小鼠被動皮膚過敏(pca)抑制率的影響(n＝10)蛇床子素mg/kg藍斑直徑(mm)光密度01.21±0.230.167±0.071000.51±0.25*0.074±0.04*2000.43±0.28**0.051±0.02***p<0.05，**p<0.01與空白脂肪乳溶液組相比。4.2蛇床子素對肥大細胞脫顆粒的抑制作用取大鼠40只，均分為四組，對照組分別腹腔注射生理鹽水0.7ml/只和色甘酸鈉0.7ml/只，給藥組分別腹腔注射蛇床子素脂肪乳溶液0.7ml/只和1.4ml/只。對天花粉抗原所引起的大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒，色甘酸鈉的抑制率為64.0％，蛇床子素的抑制率分別為57.7％和79.1％，與對照組比較均有顯著差異，表明蛇床子素對大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒有較顯著的抑制作用。其實驗結(jié)果見表6。表6蛇床子素對肥大細胞脫顆粒的抑制作用(n＝10)5討論實驗證明：蛇床子素對小鼠48h的pca反應有較強的抑制作用，表明其能明顯抑制ige抗體的形成，對變態(tài)反應中的肥大細胞脫顆粒有抑制作用。蛇床子素用于制備抗變態(tài)反應的化妝品具有重要作用。實施例7：蛇床子素化妝品制備實例⑴面霜的制備組方：制備工藝:取蛇床子素、鯨蠟硬脂基葡糖苷、十六-十八醇、辛酸/癸酸三甘油酯、霍霍巴油、棕櫚酸異丙酯、甘油混合加熱至60℃，作為a相，保溫備用；取甘草酸二鉀、加入漢生膠、卡波940、透明質(zhì)酸鈉、去離子水，混合加熱至60℃，分散均勻，作為b相，保溫備用；將a相在均質(zhì)下慢慢加入到預先分散均勻并加熱至80℃的b相中，加入環(huán)二甲基硅油345均質(zhì)3分鐘，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph6-7，攪拌冷卻到50℃，加入香精，攪拌、冷卻到35℃即得。⑵乳液的制備組方：制備工藝:取蛇床子素、環(huán)戊硅氧烷995、凡士林、吐溫-80、維生素e醋酸酯、甘油混合加熱至60℃，作為a相，保溫備用；取甘草酸二鉀，加入漢生膠、carbopolultrez10、1,3-丁二醇、去離子水，混合加熱至60℃，分散均勻，作為b相，保溫備用；將a相在均質(zhì)下慢慢加入到預先分散均勻并加熱至80℃的b相中，均質(zhì)3分鐘，加入三乙醇胺調(diào)節(jié)ph6-7，攪拌冷卻到50℃，加入香精、防腐劑，攪拌、冷卻到35℃即得。⑶眼霜的制備組方：制備工藝:取甘草酸二鉀，加入1,3-丁二醇、綠茶提取物、乙二胺四乙酸二鈉、去離子水，分散均勻，加熱至50℃，攪拌直至清澈；在攪拌下緩慢加入有機硅彈性體，作為a相，備用；取蛇床子素、dc245、霍霍巴油、維生素e醋酸酯、維生素a棕櫚酸酯混合加熱至60℃，作為b相，保溫備用；將a相在均質(zhì)下慢慢加入到預先分散均勻并加熱至60℃的b相中，均質(zhì)3分鐘，冷卻到35℃即得。⑷啫喱的制備組方：制備工藝:取蛇床子素、甘草酸二鉀，加入聚丙烯酸、甘油、1,3-丁二醇、巖藻聚糖硫酸酯、透明質(zhì)酸鈉，攪拌分散均勻，作為a相，備用；取去離子水加入a相、分散均勻，加熱至60℃，加入三乙醇胺調(diào)節(jié)ph6-7，攪拌，冷卻到50℃加入香精、甲基異噻唑琳酮，攪拌、冷卻到35℃即得。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12