本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域和煙草陳化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及利用一種人工分離的菌株，及其在煙絲陳化過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

晾曬煙是最早傳入我國(guó)的煙草品種，不同地區(qū)的具體栽培措施、自然條件和調(diào)制細(xì)節(jié)的不同決定了晾曬煙具有更為獨(dú)特的品質(zhì)與風(fēng)味。晾曬煙葉的調(diào)制方式是自然晾制，調(diào)制環(huán)境較溫和使得原煙不同程度地帶有多種品質(zhì)缺陷，例如煙葉生青且雜氣較重、刺激性較大導(dǎo)致煙氣不柔和、香氣質(zhì)單調(diào)和香氣量不足等還達(dá)不到直接用于工業(yè)加工的品質(zhì)要求，因此需要進(jìn)行發(fā)酵處理來改善這些品質(zhì)缺陷。

在發(fā)酵過程中，煙葉中的淀粉及細(xì)胞壁物質(zhì)(蛋白質(zhì)、纖維素、果膠等)在微生物、酶的共同作用下，逐漸得以消耗和分解轉(zhuǎn)化，從而降低煙葉細(xì)胞壁物質(zhì)對(duì)煙葉品質(zhì)的不良影響。國(guó)內(nèi)很多研究者將煙葉表面分離出有益菌株制備成生物制劑或復(fù)合酶制劑等噴灑至煙葉中達(dá)到提高煙葉品質(zhì)的目的。黃靜文等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能有效提高煙葉品質(zhì)；楊培香等將分離得到的枯草芽孢桿菌添加到煙絲上明顯增強(qiáng)了煙香，降低了雜氣和刺激性；許國(guó)旺等通過添加復(fù)合酶制劑到煙葉上進(jìn)行陳化，亦能有效提高煙葉品質(zhì)。目前，生物制劑在煙葉發(fā)酵上的應(yīng)用的時(shí)間還不長(zhǎng)，范圍也不廣，且?guī)缀醵际菓?yīng)用于烤煙上，而本發(fā)明旨在尋找到一種能夠提高晾曬煙品質(zhì)的可添加作為生物制劑的優(yōu)勢(shì)菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述技術(shù)的不足之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可提高晾曬煙陳化速度并且提升其吸食品質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌株，即一株芽孢桿菌ba-01，并將其制備成生物制劑添加到煙絲中進(jìn)行陳化應(yīng)用。所述的生物制劑能加速煙絲陳化、增加香氣質(zhì)、減少刺激性、減弱雜氣、顯著提高煙絲的吸食品質(zhì)。

本發(fā)明提供從江西特色“黑老虎”烤煙煙葉表面篩選在煙葉增香方面具有工業(yè)化應(yīng)用前景的芽孢桿菌菌株ba-01，經(jīng)培養(yǎng)基富集后涂布于肉湯固體培養(yǎng)基分離得來，并通過木聚糖酶、果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶篩選培養(yǎng)基測(cè)定其產(chǎn)酶能力大小，結(jié)果表明該菌株具備產(chǎn)多種酶的能力，是一種潛在的晾曬煙葉增香提質(zhì)菌，對(duì)晾曬煙葉的人工陳化有促進(jìn)作用。

所述江西特色“黑老虎”烤煙煙葉是產(chǎn)自江西省撫州市的廣昌烤煙品種。

一種提高晾曬煙品質(zhì)的芽孢桿菌菌株ba-01，其特征在于，革蘭氏染色呈陽性，桿狀，大小為0.5-0.6μm×2.0-2.5μm，芽胞中間生或端生，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。

上述芽孢桿菌ba-01的生理生化特性，其特征在于，nacl耐受性2％-7％；過氧化氫酶、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、v.p試驗(yàn)，均為陽性；ph5.7下生長(zhǎng)試驗(yàn)為陰性。

所述的芽孢桿菌ba-01(bacillusamyloliquefaciens)，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，地址為廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，保藏時(shí)間為2017年4月26日，保藏編號(hào)為gdmccno.60171。

本發(fā)明的芽孢桿菌ba-01的應(yīng)用方法，其特征在于，主要流程為發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體，制備菌懸液，添加海藻糖保護(hù)劑，真空冷凍干燥成粉劑，噴灑于晾曬煙絲，進(jìn)行人工陳化。

芽孢桿菌ba-01的發(fā)酵培養(yǎng)基組成：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化鈉0.5％，葡萄糖2％，ph7.2。最佳發(fā)酵條件：42℃，200rpm，24h。

芽孢桿菌菌株ba-01的發(fā)酵菌體的收集在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，7000rpm-10000rpm離心7min-15min使菌體沉淀，采用無菌生理鹽水洗滌1-5次菌體后得到菌懸液，向上述菌懸液中加入海藻糖使其在菌懸液的最終質(zhì)量濃度為0.5％-2％，將其置于-80℃冰箱中凍干，使其無流動(dòng)液體，再放置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，冷凍干燥8-15h，保藏于4℃冰箱備用，即得生物制劑。

短小芽孢桿菌ba-01的生物制劑活菌數(shù)達(dá)到10⁹-10¹¹cfu/g，使用時(shí)取0.001g-0.015g生物制劑溶于1ml-10ml無菌水中，將其均勻噴灑于10g-40g晾曬煙絲。人工陳化晾曬煙葉的條件為處理溫度20℃-50℃、相對(duì)濕度40％-70％，處理時(shí)間8-12天。

本發(fā)明涉及的菌株分類地位的鑒定，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的內(nèi)容。根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特征，以及16srrna基因序列比對(duì)結(jié)果，經(jīng)多項(xiàng)分類鑒定本發(fā)明所分離的菌株是一株芽胞桿菌ba-01(bacillusamyloliquefaciens)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提供的芽孢桿菌ba-01是一種優(yōu)良的煙用增香微生物，能顯著提高晾曬煙的人工陳化效果，特別是在香氣上更加充足了，減少了刺激性，在雜氣上也得到了減弱，同時(shí)縮短了晾曬煙陳化周期，降低了晾曬煙的生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1：芽孢桿菌ba-01的革蘭氏染色的顯微照片(×100)。

圖2：芽孢桿菌菌株ba-01在產(chǎn)木聚糖酶平板上的透明圈。

圖3：芽孢桿菌菌株ba-01在產(chǎn)纖維素酶平板上的透明圈。

圖4：芽孢桿菌菌株ba-01在產(chǎn)果膠酶平板上的透明圈。

圖5：芽孢桿菌菌株ba-01在產(chǎn)蛋白酶平板上的透明圈。

圖6：芽孢桿菌菌株ba-01在產(chǎn)淀粉酶平板上的透明圈。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過實(shí)施例及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1:芽孢桿菌ba-01的分離及產(chǎn)酶分析。

將10-40g江西特色“黑老虎”烤煙煙葉用已滅菌的剪刀剪碎，浸泡在50ml-200ml無菌水中，于100rpm-300rpm搖床上震蕩30min，震蕩均勻后取0.1ml該烤煙煙葉混懸液，稀釋涂布于lb平板(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l)。分離的細(xì)菌接種至產(chǎn)酶分析培養(yǎng)基。包括產(chǎn)木聚糖酶的固體培養(yǎng)基：木聚糖1g，肉湯1.8g，瓊脂2g，自然ph；產(chǎn)果膠酶的固體培養(yǎng)基：果膠0.4g，蛋白胨1g，nacl0.05g，瓊脂2g，ph7.2-7.4；產(chǎn)纖維酶的固體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉0.8g，肉湯1.8g，瓊脂2g，自然ph；產(chǎn)蛋白酶的固體培養(yǎng)基：蛋白胨1g，牛肉膏1g，nacl0.5g，干酪素1g，瓊脂2g，調(diào)節(jié)ph7.2-7.4；產(chǎn)淀粉酶的固體培養(yǎng)基：蛋白胨1g，牛肉膏0.3g，nacl0.5g，可溶性淀粉0.2g，瓊脂2g，調(diào)節(jié)ph7.2-7.4。

培養(yǎng)10h-40h后利用剛果紅測(cè)定木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶平板上透明圈與菌落直徑比，碘液測(cè)定淀粉平板上透明圈與菌落直徑比，直接觀察蛋白酶平板上透明圈與菌落直徑比(hc值)。如表1所示，分離得到的菌株具有同時(shí)產(chǎn)木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶的能力。

表1：菌株產(chǎn)酶情況分析

實(shí)施例2:芽孢桿菌ba-01的形態(tài)和生理生化特征的鑒定。

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，檢測(cè)其革蘭氏染色情況，菌體大小和形態(tài)，有無鞭毛和芽孢，nacl耐受性，過氧化氫酶試驗(yàn)，淀粉水解，纖維素水解,木聚糖水解，果膠酶水解，酪素降解，v-p試驗(yàn)，檸檬酸鹽試驗(yàn)，吲哚產(chǎn)生，ph5.7下生長(zhǎng)試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：革蘭氏染色呈陽性，桿狀，大小為0.5-0.6μm×2.0-2.5μm，芽胞中間生或端生，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。其生理生化特征為：naci耐受性2％-7％、過氧化氫酶、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、纖維素水解、木聚糖水解、果膠酶水解、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、v.p試驗(yàn)、均為陽性。ph5.7下生長(zhǎng)試驗(yàn)為陰性。

實(shí)施例3:芽孢桿菌的16srdna的擴(kuò)增及序列測(cè)定。

將芽孢桿菌菌株ba-01接種于肉湯培養(yǎng)基，100rpm-300rpm，20℃-40℃震蕩培養(yǎng)10-30小時(shí)，離心收集菌體。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組dna，用16srdna通用引物正向引物27f(5`-agagtttgatcctggctcag-3`)和反向引物1492r(5`-ggttaccttgttacgactt-3`)，對(duì)其16srdna進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。pc擴(kuò)增條件為:94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度為1484bp，與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的bacillusamyloliquefacienssqr9(芽孢桿菌sqr9)相似性為99％。

實(shí)施例4:芽孢桿菌的發(fā)酵。

將本發(fā)明的芽孢桿菌菌株接種在肉湯固體平板上，于20℃-40℃活化10-20h，然后將活化的芽孢桿菌菌株ba-01轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，最佳發(fā)酵條件為：溫度為42℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵時(shí)間為24h。

實(shí)施例5:芽孢桿菌ba-01生物制劑添對(duì)宣威片選晾曬煙絲的人工陳化。

取芽孢桿菌菌株ba-01的發(fā)酵液，離心，取沉淀制備成生物制劑，稱取0.001g-0.015g的生物制劑溶于1ml-10ml無菌水，設(shè)置蒸餾水作對(duì)照,將芽孢桿菌菌株生物制劑噴施到10-40g宣威片選晾曬煙絲上，噴灑之前煙絲經(jīng)紫外照射10min-40min，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中將溫度設(shè)定為20℃-50℃，相對(duì)濕度40％-70％，人工陳化8-12天。陳化結(jié)束后再經(jīng)紫外照射10min-40min，以中止添加微生物的作用，送樣進(jìn)行專家感官評(píng)吸，評(píng)吸結(jié)果見表2和表3，從表中可以看出經(jīng)本發(fā)明分離的菌株人工陳化晾曬煙絲后，其煙葉評(píng)吸香氣更加充足、更細(xì)膩，刺激性減少，雜氣減弱，余味更凈更舒適。

表2：芽孢桿菌ba-01對(duì)宣威片選煙絲人工陳化感官評(píng)吸結(jié)果

表3：芽孢桿菌ba-01對(duì)宣威片選煙絲人工陳化感官評(píng)吸描述

實(shí)施例6:芽孢桿菌ba-01生物制劑對(duì)郴州把選晾曬煙絲的人工陳化。

取芽孢桿菌菌株ba-01的發(fā)酵液，離心，取沉淀制備成生物制劑，稱取0.001g-0.015g的生物制劑溶于1ml-10ml無菌水，設(shè)置蒸餾水作對(duì)照，將芽孢桿菌菌株生物制劑噴施到10-40g郴州把選晾曬煙絲上，噴灑之前煙絲經(jīng)紫外照射10min-40min，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中將溫度設(shè)定為20℃-50℃，相對(duì)濕度40-70％，人工陳化8-12天。陳化結(jié)束后再經(jīng)紫外照射10min-30min，以中止添加微生物的作用，送樣進(jìn)行專家感官評(píng)吸，評(píng)吸結(jié)果見表4和表5，從表中可以看出經(jīng)本發(fā)明分離的菌株人工陳化晾曬煙絲后，其煙葉評(píng)吸香氣更加充足、更細(xì)膩，刺激性減少，雜氣減弱，余味更凈更舒適。

表4本發(fā)明的芽孢桿菌ba-01對(duì)郴州把選煙絲人工陳化感官評(píng)吸結(jié)果

表5本發(fā)明的芽孢桿菌ba-01對(duì)郴州把選煙煙絲人工陳化感官評(píng)吸描述

煙葉進(jìn)行普通人工陳化的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，研究結(jié)果表明本發(fā)明所述生物制劑的陳化效果優(yōu)于對(duì)照組，能夠明顯縮短晾曬煙的陳化周期。具體表現(xiàn)為能夠增加并細(xì)膩煙絲的香氣、減少刺激性、減弱雜氣、凈化余味；同時(shí)，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)芽孢桿菌ba-01添加至兩種煙絲上陳化后的物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)陳化后產(chǎn)生了香味物質(zhì)包括5-羥甲基糠醛、羥基麥芽酚、5-甲基糠醛、糠醇、糠醛、2(5h)-呋喃酮、4-環(huán)戊烯-1,3-二酮較對(duì)照組顯著提高，并減少了有害物質(zhì)煙堿、甲酸、乙酸、丙酸、苯酚的含量，有效改善晾曬煙葉的吸食性。

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