本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種大鼠纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
胺碘酮又稱乙胺碘呋酮，是含碘苯丙呋喃衍生物，作為ⅲ類抗心律失常藥物廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于治療室性心律失常和心房顫動(dòng)。其副作用主要表現(xiàn)為肺毒性、甲狀腺毒性、心臟毒性、消化系統(tǒng)毒性等，其中肺毒性反應(yīng)最為嚴(yán)重，其發(fā)生率在1％-10％，肺毒性主要表現(xiàn)為肺纖維化，因發(fā)病機(jī)制不明，臨床缺乏有效治療措施，其死亡率高達(dá)33％，嚴(yán)重影響人民生命健康。但胺碘酮在抗心律失常方面療效確切、穩(wěn)定，目前尚無(wú)其他類似藥物替代，在臨床上應(yīng)用仍十分廣泛。因此，闡明胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化機(jī)制對(duì)降低其藥物毒副作用，逆轉(zhuǎn)或延緩肺纖維化進(jìn)程、改善患者預(yù)后、提高生存率有重要的臨床意義。
肺纖維化的病理生理過(guò)程與機(jī)制非常復(fù)雜，發(fā)病過(guò)程主要為組織損傷、新組織生成、組織重塑，最后肺內(nèi)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞灶和細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積為主要特征的肺纖維化。成纖維細(xì)胞灶的形成是肺纖維化的重要病理特征，其中以肌成纖維細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞。目前emt被認(rèn)為可能是肌成纖維細(xì)胞形成的主要途徑之一，由于正常肺內(nèi)肌成纖維細(xì)胞數(shù)量不多，肺纖維化中約33％的肌成纖維細(xì)胞是由ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞通過(guò)emt途徑轉(zhuǎn)化而來(lái)。因此，深入研究ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化調(diào)控及機(jī)制對(duì)延緩乃至逆轉(zhuǎn)胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維化來(lái)說(shuō)意義重大。因此制備體外細(xì)胞模型，從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探索胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化機(jī)制的發(fā)病機(jī)制，對(duì)其治療的突破至關(guān)重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其檢測(cè)方法，從分子水平制備胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化細(xì)胞，其能夠準(zhǔn)確反映體內(nèi)胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化情況。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種大鼠纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其檢測(cè)方法，包括以下步驟：
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉藥進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉2800-3000u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育10-30min，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成1-3mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入3-6ml小牛血清滅活酶，將樣品離心5-10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置5-8min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心5-10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40-60min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心5-10min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)3-4次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-2h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心5-10min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔0.6-1ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為10-180umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為5-10μm的1-磷酸鞘氨醇，1-磷酸鞘氨醇對(duì)肺組織無(wú)毒副作用，于4-6℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的培養(yǎng)板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2小時(shí)；取出培養(yǎng)板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為1-5μm的激動(dòng)劑sew2871，激動(dòng)劑sew2871對(duì)肺組織無(wú)毒副作用。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1-0.5μm的二氫辣椒堿，二氫辣椒堿對(duì)肺組織無(wú)毒副作用。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟二中通過(guò)注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟二中重懸的沉淀物和紅細(xì)胞裂解液的體積比為1∶8。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟二中用灌注液灌注肺泡腔后，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過(guò)程中用手不斷按摩肺臟。
本發(fā)明大鼠纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)大鼠ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)行分離、純化和原代培養(yǎng)，然后用胺碘酮刺激ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞得到纖維化肺細(xì)胞，能夠增加胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維的發(fā)生率，能在短時(shí)間內(nèi)獲取大量纖維化肺細(xì)胞，能夠準(zhǔn)確反映體內(nèi)胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化情況，深入研究ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化調(diào)控及機(jī)制對(duì)延緩乃至逆轉(zhuǎn)胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維化來(lái)說(shuō)意義重大，為從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探索胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化機(jī)制的發(fā)病機(jī)制提供研究客體。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳述。
實(shí)施例1
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過(guò)注射3％戊巴比妥0.2ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉2800u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過(guò)程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成1mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入3ml小牛血清滅活酶，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置5min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)3次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心5min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔0.6ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為20umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為5μm的1-磷酸鞘氨醇，于4℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的24孔板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)；取出24孔板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
實(shí)施例2
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過(guò)注射3％戊巴比妥0.3ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過(guò)程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成3mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入6ml小牛血清滅活酶，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置8min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育50min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心10min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)4次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔0.8ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為50umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為8μm的1-磷酸鞘氨醇，于6℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的24孔板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)；取出24孔板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
實(shí)施例3
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過(guò)注射3％戊巴比妥0.3ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育30min，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成3mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入5ml小牛血清滅活酶，將樣品離心6min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置7min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)4次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔0.8ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為80umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為8μm的1-磷酸鞘氨醇，于6℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的24孔板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)；取出24孔板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
實(shí)施例4
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過(guò)注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育20min，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成2mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入6ml小牛血清滅活酶，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置8min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心10min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)4次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心5min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔0.6ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為110umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為9μm的1-磷酸鞘氨醇，于6℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的24孔板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)；取出24孔板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
實(shí)施例5
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過(guò)注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉2800-3000u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過(guò)程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成1mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入3ml小牛血清滅活酶，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置5min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)4次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔0.8ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為150umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為8μm的1-磷酸鞘氨醇，于4℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的24孔板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)；取出24孔板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
實(shí)施例6
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02％的edta，然后過(guò)濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過(guò)注射3％戊巴比妥0.3ml/100g對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開(kāi)胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動(dòng)脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動(dòng)水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過(guò)程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成2mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入4ml小牛血清滅活酶，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，室溫放置8min，使紅細(xì)胞完全裂解，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計(jì)數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細(xì)胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育55min，將未貼壁的細(xì)胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復(fù)3次，吸出未貼壁細(xì)胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，收集未黏附游離細(xì)胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細(xì)胞種植于24孔板中，每孔1ml，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無(wú)血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為160umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為5μm的1-磷酸鞘氨醇，于4℃儲(chǔ)存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
步驟五、檢測(cè)：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測(cè)液；將加入cck8檢測(cè)液的24孔板再次置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)；取出24孔板，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm的條件下測(cè)定吸光度。
實(shí)施例7
其它實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)施例6相同，但是在步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為1、2、3、4或5μm的激動(dòng)劑sew2871。
實(shí)施例8
實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)施例6相同，但是加入3μm的激動(dòng)劑sew2871，在所述步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μm的二氫辣椒堿。
cck8檢測(cè)結(jié)果：
實(shí)施例7中添加不同濃度激動(dòng)劑sew2871后，得到的成纖維細(xì)胞的增值情況，從表中可以看出，激動(dòng)劑sew2871對(duì)成纖維細(xì)胞的增值具有促進(jìn)作用，隨著激動(dòng)劑sew2871濃度的增高，成纖維細(xì)胞的增值加快。
*p<0.05；**p<0.01
實(shí)施例8中添加不同濃度二氫辣椒堿濃度后，得到的成纖維細(xì)胞的增值情況，從表中可以看出，二氫辣椒堿濃度對(duì)成纖維細(xì)胞的增值具有促進(jìn)作用，隨著二氫辣椒堿濃度的增高，成纖維細(xì)胞的增值加快。
*p<0.05；**p<0.01
羥脯氨酸含量測(cè)定
羥脯氨酸是膠原纖維中特有的一類氨基酸，測(cè)定肺部羥脯氨酸含量可以換算出膠原蛋白的含量，以判斷肺纖維化程度，按羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定培養(yǎng)基中羥脯氨酸含量，在酶標(biāo)儀540nm處測(cè)定a值，樣品中羥脯氨酸質(zhì)量濃度(mg/l培養(yǎng)基)＝測(cè)定管a值×標(biāo)準(zhǔn)管濃度/標(biāo)準(zhǔn)液a值。測(cè)定胺碘酮致纖維化肺細(xì)胞中羥脯氨酸含量，結(jié)果如下：對(duì)照組為原代培養(yǎng)得到的ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。