本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過植物組織培養(yǎng)的方法，獲得茶樹葉片的愈傷組織后，對愈傷組織進(jìn)行單細(xì)胞分離獲得茶葉懸浮單細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

茶樹，拉丁文名：camelliasinensis(l.)o.ktze，山茶科、山茶屬灌木或小喬木，嫩枝無毛。葉革質(zhì)，長圓形或橢圓形。茶樹的葉子可制茶(有別于油茶樹)，種子可以榨油，茶樹材質(zhì)細(xì)密，其木可用于雕刻。

我國是茶葉傳統(tǒng)出口大國，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)前全球各個產(chǎn)茶國家中，我國的茶葉年產(chǎn)量居于第一位，出口總量居于第二位，僅僅低于肯尼亞。茶葉中含有對人體有益的茶多酚、氨基酸、咖啡堿等物質(zhì)，具有提神醒腦、解毒利尿、“三抗三降”等功效，是世界三大無酒精飲料之一。茶樹其高度的自交不親和性、自交衰退、結(jié)實率低等限制了遺傳改良工作的進(jìn)行；另外細(xì)胞學(xué)平臺的缺乏也阻礙了茶葉中主要內(nèi)含健康功能成分的代謝機(jī)理的研究。利用茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)及單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以加快茶樹育種、縮短育種周期，并可利用組織培養(yǎng)進(jìn)行茶樹次生代謝產(chǎn)物可以開展細(xì)胞學(xué)和遺傳轉(zhuǎn)化研究，包括：次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、代謝物細(xì)胞定位及代謝機(jī)理研究、并為外源化合物脅迫條件下茶樹細(xì)胞代謝物變化及機(jī)制研究提供了很好的技術(shù)平臺。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，建立一個快速生長的茶葉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系并且分離出茶葉單細(xì)胞，維持其可持續(xù)開發(fā)和利用，也為茶葉細(xì)胞學(xué)和次級代謝機(jī)理的研究與遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

茶葉懸浮單細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，通過外植體組織培養(yǎng)，獲得愈傷組織，然后對愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)后經(jīng)分離獲得茶葉懸浮單細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述外植體為茶樹新稍上部幼嫩葉片。

進(jìn)一步，對外植體進(jìn)行進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：ms+2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+蔗糖30g/l，+瓊脂6.5-7.0g/l，ph5.8。

進(jìn)一步，懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基為b5+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+蔗糖20g/l。

進(jìn)一步，懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基為b5+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+蔗糖20g/l。

進(jìn)一步，愈傷組織經(jīng)25℃恒溫?fù)u床中，避光懸浮培養(yǎng)5-10天后，將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入新配制的懸浮培養(yǎng)基中再繼代培養(yǎng)培養(yǎng)21-28天；制備懸浮初代細(xì)胞時添加果膠酶，再經(jīng)2-3次懸浮繼代培養(yǎng)后，得到茶葉懸浮單細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述果膠酶需經(jīng)過0.22um無菌濾膜處理，所述果膠酶添加量為懸浮培養(yǎng)基體積的3％-5％。

進(jìn)一步，所述愈傷組織培養(yǎng)后還包括繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基為ms+1.0mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+蔗糖30g/l+瓊脂6.5-7.0g/l，ph5.8。

進(jìn)一步，所述外植體包括預(yù)處理，具體是指將采摘后幼嫩葉片流水沖洗1h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％多菌靈溶液沖洗浸泡4h，2.0g/l的pvpp溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，然后將漂洗干凈的葉片用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75％乙醇消毒10秒，無菌水沖洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗3次后用無菌吸水紙吸干葉表水。

與已有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點體現(xiàn)在：

首先，本發(fā)明通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將生長旺盛的茶樹外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后，對其愈傷組織接種于特定激素和培養(yǎng)基的組合進(jìn)行擴(kuò)大再培養(yǎng)、在特定激素和培養(yǎng)基的懸浮體系中通過不斷繼代和振蕩，將團(tuán)簇愈傷組織不斷分離，最終獲得單細(xì)胞；同時，對初代懸浮培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行不斷的擴(kuò)大再培養(yǎng)，即可獲得大量、充足的懸浮茶樹單細(xì)胞；并且在懸浮培養(yǎng)過程中添加適量果膠酶，促進(jìn)細(xì)胞的分離；其次，對不同季節(jié)采摘的外植體誘導(dǎo)愈傷組織的激素略有不同，以及懸浮培養(yǎng)嚴(yán)格控制每瓶的裝液量(150ml錐形瓶裝液40ml)，使懸浮細(xì)胞保持最適生長活力。其技術(shù)難點在于①秋冬季茶樹愈傷誘導(dǎo)率較春夏季較低，因此采用不同激素誘導(dǎo)；②根據(jù)愈傷的生長變化情況及時更換新鮮培養(yǎng)基以及激素配比的調(diào)整；本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)不同的兩點在于，對于不同季節(jié)采摘的外植體采用不同激素配比；懸浮培養(yǎng)過程中添加果膠酶促進(jìn)細(xì)胞分離；在適宜環(huán)境下，對初次懸浮愈傷的不斷培養(yǎng)和繼代，即可不斷獲得茶樹單細(xì)胞。

附圖說明

圖1是不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)結(jié)果。圖中(a)、(b)、(c)分別對應(yīng)表3中組別1、2、3不同激素組合的愈傷組織。

圖2.為不同kt激素濃度下組織繼代培養(yǎng)的結(jié)果。圖中，(a)、(b)、(c)分別為0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/lkt濃度下愈傷組織繼代培養(yǎng)結(jié)果。

圖3為愈傷組織生長狀況隨繼代次數(shù)的增加而變化結(jié)果。圖中(a)、(b)、(c)、(d)分別為繼代培養(yǎng)2-5次的結(jié)果。

圖4.為液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程，圖中a.為固體愈傷經(jīng)過無菌刀片切碎后；b.為經(jīng)過5-10天，上清懸浮添加新配置b5培養(yǎng)基；c.為經(jīng)過一次繼代后懸浮細(xì)胞生長狀況；d.為經(jīng)過2-3次繼代后懸浮細(xì)胞生長到旺盛時期。

圖5.為茶葉懸浮細(xì)胞經(jīng)過2-3次繼代分離后，400倍顯微鏡下狀況。

圖6為秋冬季采摘外植體在添加2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再經(jīng)繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)28d后生長狀況，圖6中，(a)為初代誘導(dǎo)結(jié)果，(b)為繼代一次結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。實施例中所述的培養(yǎng)方法均在干凈的工作臺進(jìn)行，ms和b5培養(yǎng)基為自行配置的母液(配方表參見表1，表2)，冷藏保存，實施例中所述的室溫為20～25℃。

表1.ms培養(yǎng)基母液配置表

表2.b5液體培養(yǎng)基母液配置及取用量(單位：mg/l)

實施例

(1)固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和固體愈傷組織繼代培養(yǎng)基的配制：

以配置1l培養(yǎng)基為例，將先配置好的ms培養(yǎng)基母液按照比例稱取，放于5l燒杯中，按2.0mg/l的比例添加2,4-d，0.5mg/l的比例添加kt，30g/l的比例添加蔗糖，7g/l的比例添加瓊脂，加入至煮沸純水中攪拌均勻后，倒入5l燒杯中至刻度1l，并攪拌均勻后，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)整ph至5.8，然后分裝在組培瓶中，121℃高壓滅菌15min后，充分冷卻凝固，備用，得到固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

以配置1l培養(yǎng)基為例，將先配置好的ms培養(yǎng)基母液按照比例稱取，放于5l燒杯中，按1.0mg/l的比例添加2,4-d，0.1mg/l的比例添加kt，30g/l的比例添加蔗糖，7g/l的比例添加瓊脂，加入至煮沸純水中攪拌均勻后，倒入5l燒杯中至刻度1l，并攪拌均勻后，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)整ph至5.8，然后分裝在組培瓶中，121℃高壓滅菌15min后，充分冷卻凝固，備用，得到固體愈傷組織繼代培養(yǎng)基。

(2)液體懸浮培養(yǎng)基的配制

以配置1l培養(yǎng)基為例，將先配置好的b5培養(yǎng)基母液按照比例稱取，至5l燒杯中，按1.0mg/l的量添加2,4-d，0.1mg/l的量添加kt，20g/l的量添加蔗糖，然后加入純水至1l體積，分裝與150ml錐形瓶40ml，封口，121℃高壓滅菌15min后，冷卻備用，得到液體培養(yǎng)基。

(2)茶葉懸浮單細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

以茶樹品種“龍井43”為例，春季龍井43新稍上部幼嫩葉片，采摘后流水沖洗1h，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％多菌靈溶液沖洗浸泡4h，2.0g/l的pvpp溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，將漂洗干凈的葉片作為外植體，在無菌接種室工作臺上用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75％乙醇消毒10秒，無菌水沖洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗3次后用無菌吸水紙吸干葉表水。

在超凈工作臺上將消毒處理后的葉片用無菌剪刀沿中間葉脈剪開，再細(xì)分成0.3×0.3cm左右的小塊外植體，接種在固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上面，每瓶接種8-10塊外植體，避光培養(yǎng)，溫度25±2℃，培養(yǎng)20-50天，得到葉片愈傷組織。

表3為不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)結(jié)果

由表3可知，組別2為最適選擇，最終確定為激素組合2即2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt為最佳誘導(dǎo)組合。

在無菌環(huán)境下，將初代培養(yǎng)出的愈傷組織用無菌鑷子轉(zhuǎn)移至固體繼代培養(yǎng)基上，同時剔除未出愈外植體，繼續(xù)培養(yǎng)21-28天。

茶葉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是由原來繼代培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基更換為液體培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑和ph對愈傷組織細(xì)胞的生長于繼代培養(yǎng)時的影響基本一致，因此植物生長調(diào)節(jié)劑仍然采用2,4-d+kt的組合，ph為5.8。

在繼代培養(yǎng)中，繼代培養(yǎng)基中kt激素選擇3個濃度水平，分別為0.05mg/l，0.1mg/l和0.5mg/l(2，4-d濃度選擇0.5mg/l，ms為基本培養(yǎng)基)，具體培養(yǎng)結(jié)果如圖1、表4所示，0.05mg/lkt濃度下愈傷組織顏色泛白，生長速度慢，質(zhì)地較緊實；kt濃度為0.1mg/l的愈傷呈嫩黃色，生長旺盛且質(zhì)地疏松；kt濃度為0.5mg/l的愈傷出芽現(xiàn)象嚴(yán)重，質(zhì)地緊實；最終確定為kt為0.1mg/l愈傷生長最佳。

表4不同kt濃度下繼代愈傷組織生長情況

在確定kt最佳濃度時，2,4-d激素選擇10個濃度水平，進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，具體培養(yǎng)結(jié)果如表5所示。

由表5可知，在確定了kt最適濃度后，當(dāng)2,4-d為1.0mg/l時，愈傷組織生長率達(dá)到最大值為46.94％，最終確定為1.0mg/l為最佳濃度。

表5不同2,4-d激素濃度下繼代愈傷組織生長情況

液體培養(yǎng)時不同的基本培養(yǎng)基對愈傷組織、細(xì)胞的生長狀況也會產(chǎn)生影響，因此分別以ms、b5為基本培養(yǎng)基，添加2,4-d1.0mg/l+kt0.1mg/l的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，14d后稱重的方法確定兩種基本培養(yǎng)基對細(xì)胞生長量的影響(表6)由此可知，b5培養(yǎng)基更適合愈傷組織液體培養(yǎng)，且褐化率低。

表6不同培養(yǎng)基種類對愈傷生長的影響

經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后，在無菌環(huán)境下，將繼代培養(yǎng)基中大塊愈傷組織用無菌剪刀剪切成小塊后，繼續(xù)轉(zhuǎn)移至新配置繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時剔除生長狀況較差的愈傷組織，繼續(xù)繼代2-3次。

表7為固體繼代次數(shù)的生長情況

如圖3、表7所示，當(dāng)繼代次數(shù)為2-4次時，除生長量不同，愈傷均生長旺盛，質(zhì)地疏松；而當(dāng)繼代次數(shù)為5次時，愈傷組織開始發(fā)生褐變，因此選擇繼代次數(shù)2-3次最佳。

在無菌環(huán)境下，將經(jīng)過2-3次繼代培養(yǎng)的愈傷組織，用無菌刀片進(jìn)行切割處理，使其成細(xì)小顆粒后，稱取2g放入液體培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速120r/min，避光培養(yǎng)，如圖4中a所示。

培養(yǎng)5-10天后，在無菌環(huán)境下，將液體懸浮上清分成20ml與新配制裝液量20ml液體培養(yǎng)基中，未分散的愈傷組織塊再倒入新配制液體培養(yǎng)基40ml繼續(xù)培養(yǎng)21-28天，如圖4中b所示。

然后向培養(yǎng)基中添加3％-5％裝液量(體積)的果膠酶，再經(jīng)2-3次懸浮繼代培養(yǎng)后，即可得到生長良好的茶葉懸浮單細(xì)胞，如圖4中c，d、圖5所示。

對于從秋冬季采摘的外植體葉片進(jìn)行誘導(dǎo)時，對其初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素進(jìn)行調(diào)整，在原有的激素配比上添加0.5mg/l6-ba，使最終初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素濃度為2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba，繼代培養(yǎng)條件與前文相同。圖6為冬季葉片愈傷組織初代培養(yǎng)激素調(diào)整前后生長狀況對比，激素調(diào)整后相對于激素調(diào)整前愈傷組織生長量平均增加20％左右(表8為激素調(diào)整前后愈傷誘導(dǎo)及生長率對比結(jié)果，每瓶接種葉片10片，重復(fù)3組平行)

表8激素調(diào)整前后對比結(jié)果

激素組合1:2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt

激素組合2：2.0mg/l2,4-d+0.5mg/lkt+0.5mg/l6-ba。