本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地說，本發(fā)明涉及具有高活性的賴氨酸脫羧酶、包含該賴氨酸脫羧酶編碼基因的表達(dá)載體和能夠表達(dá)該賴氨酸脫羧酶的基因工程菌，以及所述賴氨酸脫羧酶、表達(dá)載體和基因工程菌在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺和尸毒素，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，是賴氨酸在賴氨酸脫羧酶(e.c.4.1.1.18)的作用下脫羧產(chǎn)生的，反應(yīng)為l-lysine+h+→co2+cadaverine。1,5-戊二胺具有各種各樣的功能及用途。例如，在農(nóng)業(yè)上，1,5-戊二胺可用于調(diào)控植物衰老過程、促進(jìn)雌雄蕊的發(fā)育、改善植物果實(shí)發(fā)育、提高果實(shí)產(chǎn)量。在醫(yī)學(xué)上，它可作為一種有效治療痢疾的藥物，也是一種重要的藥物中間體。在工業(yè)上，1,5-戊二胺是一種重要的化工原料；將1,5-戊二胺與二元酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料-新型尼龍，1,5-戊二胺基不依賴于石油原料的生物制造工藝可能對(duì)尼龍工業(yè)產(chǎn)生顛覆性的影響。尼龍66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，與尼龍6同為尼龍兩大品種之一。目前，己二胺或其合成前體己二腈國(guó)內(nèi)主要依賴進(jìn)口。1,5-戊二胺與己二胺互為同系物，在結(jié)構(gòu)上與己二胺非常相似，可以替代己二胺，和二元酸共聚合成具有實(shí)用性的尼龍5x(4、6、10等)。尼龍56性能媲美經(jīng)典的尼龍66，而吸濕排干率、透氣性、柔軟度等性能更佳，可廣泛應(yīng)用作纖維(服裝、輪胎、地毯等)和工程塑料(電子產(chǎn)品、汽車部件等)。尼龍54和尼龍510等其它以1,5-戊二胺為單體制成的尼龍產(chǎn)品具有特殊的材料性能，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺合成途徑中的關(guān)鍵酶。賴氨酸脫羧酶存在于各種微生物中。目前，已經(jīng)分別從大腸桿菌(e.coli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、反芻動(dòng)物月形單胞菌(selenomonasruminantium)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)和鮰愛德華氏菌(edwardsiellaictaluri)等細(xì)菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因。最新的研究普遍采用過表達(dá)大腸桿菌的cada來(lái)生產(chǎn)1,5-戊二胺。日本味之素公司的us7189543專利中保護(hù)了以二羧酸調(diào)節(jié)ph并通過細(xì)胞過表達(dá)大腸桿菌的野生型cada酶轉(zhuǎn)化賴氨酸產(chǎn)生1,5-戊二胺，產(chǎn)量達(dá)69g/l。上海凱賽在其專利cn102851307a中通過在蜂房哈夫尼菌中過量表達(dá)大腸桿菌野生型cada酶來(lái)轉(zhuǎn)化賴氨酸，從而實(shí)現(xiàn)戊二胺和下游聚合物的制備。日本味之素公司的ep3118312專利中公開了熱穩(wěn)定性提高的大腸桿菌cada突變位點(diǎn)val3、ala590和glu690。日本三井化學(xué)公司的us2015132808專利保護(hù)了多個(gè)活性增加的大腸桿菌cada突變體，然而，這些cada突變體的活性提高程度均低于20％，甚至大多數(shù)cada突變體的活性提高程度不到10％，因此這些cada突變體在實(shí)際生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值非常有限。賴氨酸脫羧酶作為催化賴氨酸生產(chǎn)1,5-戊二胺的催化劑，提升賴氨酸脫羧酶的活性可以減少催化劑的用量或縮短反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本，對(duì)1,5-戊二胺的工業(yè)化有重要的影響，因此本領(lǐng)域急需提升賴氨酸脫羧酶的性能，實(shí)現(xiàn)1,5-戊二胺的工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種性能提升的賴氨酸脫羧酶，以便實(shí)現(xiàn)1,5-戊二胺的工業(yè)化生產(chǎn)。在第一方面，本發(fā)明提供一種賴氨酸脫羧酶，所述賴氨酸脫羧酶是：(a)其氨基酸序列由seqidno:1所示序列突變而來(lái)，在選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)發(fā)生突變：9位、44位、88位、111位、176位和230位；其中，9位、111位、176位和230位突變可以選自其他19種氨基酸，44位的氨基酸殘基突變是arg，88位的氨基酸殘基突變是ser；或(b)所述賴氨酸脫羧酶與(a)所述的氨基酸序列具有95％，優(yōu)選98％，更優(yōu)選99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中對(duì)應(yīng)于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基殘基與(a)所述的氨基酸序列中的相同；或(c)所述賴氨酸脫羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30個(gè)，更優(yōu)選1-10個(gè)，還要優(yōu)選1-6個(gè)，最優(yōu)選1-3個(gè)氨基酸殘基而形成，并且具有(a)所述賴氨酸脫羧酶的功能，其中對(duì)應(yīng)于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基殘基與(a)所述的氨基酸序列中的相同。在具體的實(shí)施方式中，所述賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)橐韵滤镜陌被釟埢?位：arg、lys、gln、asn；44位：arg；88位：ser；111位：gly、pro、ala；176位：val、ile、leu、met、phe、ala；230位：his、asn、gln、lys、arg在具體的實(shí)施方式中，所述賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)具有以下所示的氨基酸殘基：9位：arg；44位：arg；88位：ser；111位：gly；176位：val；230位：his。在具體的實(shí)施方式中，所述賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列在9位為arg，或者在44位為arg，或者在88位為ser，或者在111位為gly，或者在176為val，或者在230位為his。在第二方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含本發(fā)明第一方面所述的賴氨酸脫羧酶的編碼序列。在第三方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)載體或者其基因組中整合有本發(fā)明第一方面所述的賴氨酸脫羧酶的編碼序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌；更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(e.coli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；最優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(e.coli)。在第四方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：(1)利用本發(fā)明第一方面所述的賴氨酸脫羧酶或者本發(fā)明的三方面所述的宿主細(xì)胞生產(chǎn)1,5-戊二胺；和(2)從(1)的體系中分離得到1,5-戊二胺。在第五方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：利用以下賴氨酸脫羧酶生產(chǎn)1,5-戊二胺，所述賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列與seqidno:1所示氨基酸序列具有95％，優(yōu)選98％，更優(yōu)選99％的序列相同性，并且具有seqidno:1所述蛋白的賴氨酸脫羧酶功能，而且在對(duì)應(yīng)于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基殘基發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基突變；其中，利用所述賴氨酸脫羧酶生產(chǎn)1,5-戊二胺的產(chǎn)量是利用氨基酸序列如seqidno:1所示的賴氨酸脫羧酶的1.7倍以上。在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的賴氨酸脫羧酶或者本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第三方面所述的宿主細(xì)胞在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的應(yīng)用。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具體實(shí)施方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)對(duì)野生型賴氨酸脫羧酶的特定位點(diǎn)進(jìn)行突變可以得到活性顯著提升的賴氨酸脫羧酶突變體，從而為開發(fā)優(yōu)異的賴氨酸脫羧酶，進(jìn)而用于1,5-戊二胺的生產(chǎn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。賴氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶是催化賴氨酸脫羧形成1,5-戊二胺的合成途徑中的關(guān)鍵酶。賴氨酸脫羧酶存在于各種各樣的微生物中，包括但不限于大腸桿菌(escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、耐堿芽孢桿菌(bacillushalodurans)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)、尸桿菌(bacteriumcadaveris)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiavietnamensia)、青紫色素桿菌(chromobacteriumviolaceum)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、毛鏈霉菌(streptomycespolosus)等。目前，已經(jīng)分別從大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌、反芻動(dòng)物月形單胞菌(selenomonasruminantium)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)和鮰愛德華氏菌(edwardsiellaictaluri)等細(xì)菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因。雖然可以從各種不同的微生物來(lái)源獲得賴氨酸脫羧酶，但各種賴氨酸脫羧酶的特性顯著不同。對(duì)這些不同來(lái)源的賴氨酸脫羧酶的不同位點(diǎn)進(jìn)行突變得到的突變體的活性也明顯不同。例如，日本三井化學(xué)公司的專利申請(qǐng)(us2015132808)公開了多個(gè)大腸桿菌cada突變體，然而，這些cada突變體的活性提高程度均低于20％，甚至大多數(shù)cada突變體的活性提高程度不到10％。因此，這些cada突變體在實(shí)際生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值非常有限。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，如果要對(duì)某種酶進(jìn)行突變，以便獲得活性改善的突變體，關(guān)鍵之處在于發(fā)現(xiàn)突變后可以改善活性的位點(diǎn)。在本發(fā)明中，對(duì)氨基酸序列如seqidno:1所示的大腸桿菌來(lái)源的野生型賴氨酸脫羧酶(cada)的特定位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到了活性顯著提高的賴氨酸脫羧酶突變體。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明人在seqidno:1所示氨基酸序列的以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變得到的賴氨酸脫羧酶突變體可以顯著提高1,5-戊二胺的產(chǎn)量：9位、44位、88位、111位、176位或/和230位。在本文中，所用的術(shù)語(yǔ)“賴氨酸脫羧酶”或“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”或“本發(fā)明的酶”具有相同的意義，在本文可以互換使用，均是指從氨基酸序列如seqidno:1所示的野生型賴氨酸脫羧酶出發(fā)，在上述一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變得到的具有催化賴氨酸產(chǎn)生1,5-戊二胺活性并且1,5-戊二胺產(chǎn)量顯著提高的賴氨酸脫羧酶。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)以及現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”還應(yīng)包括其變異形式，所述變異形式具有與“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列與本發(fā)明實(shí)施例中的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列有少量差異。這些變異形式包括(但不限于)：一個(gè)或多個(gè)(通常為1-30個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-6個(gè)，再佳地1-3個(gè)、最佳地1個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一個(gè)或多個(gè)(通常為30個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為6個(gè)或3個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時(shí)，不會(huì)改變所得蛋白質(zhì)的功能。再例如，在c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，例如為便于分離而添加的6-his標(biāo)簽通常不會(huì)改變所得蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，本文所述的“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的變異形式并不包括經(jīng)過突變回復(fù)成野生型賴氨酸脫羧酶的情況；換言之，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的變異形式是在本發(fā)明實(shí)施例所得的賴氨酸脫羧酶的基礎(chǔ)上作進(jìn)一步突變得到的，但對(duì)應(yīng)于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位或/和230位的氨基酸殘基與本發(fā)明實(shí)施例所得的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列中的相同。本文所用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義。具體地說，“對(duì)應(yīng)于”表示兩條序列經(jīng)同源性或序列相同性比對(duì)后，一條序列與另一條序列中的指定位置相對(duì)應(yīng)的位置。因此，如果在本發(fā)明實(shí)施例所得的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列的一端加上6-his標(biāo)簽，那么所得突變體中對(duì)應(yīng)于seqidno:1所示氨基酸序列的176位就可能是第182位。在具體的實(shí)施方式中，所述同源性或序列相同性可以是95％以上，優(yōu)選95％-98％，最優(yōu)選99％以上。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的測(cè)定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：計(jì)算機(jī)分子生物學(xué)(computationalmolecularbiology)，lesk，a.m.編，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988；生物計(jì)算：信息學(xué)和基因組項(xiàng)目(biocomputing:informaticsandgenomeprojects)，smith，d.w.編，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993；序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析(computeranalysisofsequencedata)，第一部分，griffin，a.m.和griffin，h.g.編，humanapress，新澤西，1994；分子生物學(xué)中的序列分析(sequenceanalysisinmolecularbiology)，vonheinje，g.，學(xué)術(shù)出版社，1987和序列分析引物(sequenceanalysisprimer)，gribskov，m.與devereux，j.編mstocktonpress，紐約，1991和carillo，h.與lipman，d.，siamj.appliedmath.，48:1073(1988)。測(cè)定相同性的優(yōu)選方法要在測(cè)試的序列之間得到最大的匹配。測(cè)定相同性的方法編譯在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的測(cè)定兩條序列之間相同性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于：gcg程序包(devereux，j.等，1984)、blastp、blastn和fasta(altschul，s，f.等，1990)。公眾可從ncbi和其它來(lái)源得到blastx程序(blast手冊(cè)，altschul，s.等，ncbinlmnihbethesda，md.20894；altschul，s.等，1990)。熟知的smithwaterman算法也可用于測(cè)定相同性。多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)格性條件下能與“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的編碼dna雜交的dna所編碼的蛋白。本發(fā)明還包括其他多肽，如包含“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還應(yīng)包括“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的活性片段。通常，該片段具有“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的氨基酸序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供“賴氨酸脫羧酶”的類似物。這些類似物與天然“本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶”的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然l-氨基酸的殘基(如d-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白并不限于上述例舉的代表性蛋白。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。在本發(fā)明中，“賴氨酸脫羧酶”的保守性變異多肽指與本發(fā)明實(shí)施例中的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列相比，有至多20個(gè)，較佳地至多10個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽，但所述保守性變異多肽依然具有與本發(fā)明實(shí)施例中的賴氨酸脫羧酶相同或相似的活性，即催化賴氨酸產(chǎn)生1,5-戊二胺活性，并且1,5-戊二胺產(chǎn)量顯著提高。因此，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)，例如下表所示進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生保守性變異的突變體。初始?xì)埢硇缘娜〈鷼埢鶅?yōu)選的取代殘基ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu有鑒于此，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)具有以下所示的氨基酸殘基：176位：val、ile、leu、met、phe、ala；111位：gly、pro、ala；9位：arg、lys、gln、asn；230位：his、asn、gln、lys、arg；44位：arg；88位：ser。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)具有以下所示的氨基酸殘基：176位：val；111位：gly；9位：arg；230位：his；44位：arg；88位：ser。本發(fā)明的蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本發(fā)明的蛋白可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，本發(fā)明的“賴氨酸脫羧酶”還包括“賴氨酸脫羧酶”的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的“賴氨酸脫羧酶”相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。鑒于本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難獲得本發(fā)明賴氨酸脫羧酶的活性片段。例如，在本文中，“賴氨酸脫羧酶”的生物活性片段是指“賴氨酸脫羧酶”的片段，但其仍然能保持全長(zhǎng)“賴氨酸脫羧酶”的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持全長(zhǎng)“賴氨酸脫羧酶”的50％的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)“賴氨酸脫羧酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性?；诒景l(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以明白，可以將本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶制成固定化酶等其它利用形式。在本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明“賴氨酸脫羧酶”的多核苷酸序列或其簡(jiǎn)并的變異體。本發(fā)明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。dna可以是單鏈的或是雙鏈的。dna可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與編碼本發(fā)明實(shí)施例中的賴氨酸脫羧酶的核苷酸序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼本發(fā)明權(quán)利要求中的賴氨酸脫羧酶，但與本發(fā)明實(shí)施例中的賴氨酸脫羧酶的編碼核苷酸序列有差別的核酸序列。本發(fā)明中，“賴氨酸脫羧酶”的編碼多核苷酸序列可插入重組表達(dá)載體或基因組。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可采用熟知的方法能用于構(gòu)建含“賴氨酸脫羧酶”編碼dna序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體，包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的dna序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mrna合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(gfp)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)dna序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。本文所述的宿主細(xì)胞包括包含上述表達(dá)載體或基因組上整合了本發(fā)明“賴氨酸脫羧酶”的編碼序列的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞或菌株能夠高效表達(dá)具有高催化性能的新型賴氨酸脫羧酶，從而提高生產(chǎn)1,5-戊二胺的水平。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，所述菌株包括但不限于：大腸桿菌(e.coli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述菌株為大腸桿菌(e.coli)。用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在上面的方法中的重組多肽可以組成型表達(dá)或條件表達(dá)，例如當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、高壓勻漿、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶及其編碼序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞可用于催化賴氨酸脫羧產(chǎn)生1,5-戊二胺。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞催化賴氨酸脫羧產(chǎn)生1,5-戊二胺的方法。例如，在具體的實(shí)施方式中，可通過培養(yǎng)包含本發(fā)明表達(dá)載體或其基因組上整合有本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶的編碼序列的宿主細(xì)胞或者利用本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸產(chǎn)生1,5-戊二胺；然后從催化體系中獲得產(chǎn)生的1,5-戊二胺。本發(fā)明所述的用于催化以產(chǎn)生1,5-戊二胺的賴氨酸，可以是宿主細(xì)胞自身產(chǎn)生的賴氨酸，也可以是外源添加的賴氨酸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：1.與現(xiàn)有技術(shù)中的賴氨酸脫羧酶相比，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸產(chǎn)生1,5-戊二胺的活性顯著提高，催化賴氨酸生產(chǎn)1,5-戊二胺時(shí)相同催化劑的生產(chǎn)強(qiáng)度比野生型賴氨酸脫羧酶高1.7倍以上；2.使用本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶進(jìn)行工業(yè)催化，可以有效降低催化劑用量或縮短催化反應(yīng)時(shí)間，從而減少催化劑成本、固定資產(chǎn)投入、操作成本或提高產(chǎn)能，具有成本優(yōu)勢(shì)；和3.本發(fā)明為進(jìn)一步優(yōu)化賴氨酸脫羧酶，提升其穩(wěn)定性，推動(dòng)生物法1,5-戊二胺的工業(yè)化提供了新的思路。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然可利用與本文所述相似或等價(jià)的任何方法和材料來(lái)實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但優(yōu)選本文所述的方法和材料。實(shí)施例1.cada野生型菌株的構(gòu)建將e.colimg1655(獲自atcc700926，可參考blattnerfr等,thecompletegenomesequenceofescherichiacolik-12.science277:1453-62(1997))在lb培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l，ph7.0)中，37℃，200rpm，培養(yǎng)12-16h后，收集細(xì)胞，采用biomiga基因組小提試劑盒提取基因組dna。以大腸桿菌基因組為模板，以cada-f(如seqidno:3所示)和cada-r(如seqidno:4所示)為引物，擴(kuò)增cada基因(序列如seqidno:2所示)，通過5‘ndei和3’xhoi克隆至載體pet-21a(+)(購(gòu)自novagen公司)，獲得pet21-cada表達(dá)質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)，獲得e.colibl21(de3)/pet21-cada野生型工程菌株。實(shí)施例2.cada突變菌株的獲得利用stratagene系列xl-ii定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，分別設(shè)計(jì)6對(duì)引物(見表1)，以已構(gòu)建的pet21-cada野生型質(zhì)粒為模板，分別采用6對(duì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別將cada第9位氨基酸的組氨酸突變?yōu)榫彼幔?4位的賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?8位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，111位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?76位的蛋氨酸突變?yōu)槔i氨酸，230位的酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，所得表達(dá)突變體的質(zhì)粒分別命名為pet21-h9r、pet21-k44r、pet21-t88s、pet21-e111g、pet21-m176v和pet21-y230h。pcr反應(yīng)條件為：95℃5min，25個(gè)循環(huán)(95℃30s，50℃30s，68℃9min)，68℃10min。pcr擴(kuò)增體系(50μl)：模板1μl，上下游引物各2μl，dntpmix1μl，10×pyrobestbuffer5μl，滅菌的雙蒸水38.5μl，pyrobestdna聚合酶0.5μl。采用膠回收試劑盒(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。轉(zhuǎn)化子由金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)，分別獲得cada突變體的工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-h9r、e.colibl21(de3)/pet21-k44r、e.colibl21(de3)/pet21-t88s、e.colibl21(de3)/pet21-e111g、e.colibl21(de3)/pet21-m176v和e.colibl21(de3)/pet21-y230h。表1.引物序列引物名稱序列編號(hào)引物序列(5’-3’)h9r-fseqidno:5gcaatattgaatcgcatgggggtttatttth9r-rseqidno:6aaaataaacccccatgcgattcaatattgck44r-fseqidno:7cgaccgtgacgacttattaagactgatcgaaaacaatgck44r-rseqidno:8gcattgttttcgatcagtcttaataagtcgtcacggtcgt88s-fseqidno:9cgtattcctctctcgatgtaagcctgaatgt88s-rseqidno:10catcgagagaggaatacgtattagcgaacgce111g-fseqidno:11gcgctgggtgctgctggagatattgctaataagatce111g-rseqidno:12gatcttattagcaatatctccagcagcacccagcgcm176v-fseqidno:13gatttctttggtccgaataccgtgaaatctgatatttcm176v-rseqidno:14gaaatatcagatttcacggtattcggaccaaagaaatcy230h-fseqidno:15ctgcgaacaaaattgttggtatgcactctgctccagcy230h-rseqidno:16gctggagcagagtgcataccaacaattttgttcgcagcada-r2seqidno:17ttacgccaagcttttttttgctttcttctttcaatacc實(shí)施例3.cada野生型及突變體工程菌株的戊二胺生產(chǎn)工程菌株的菌體培養(yǎng)及賴氨酸脫羧酶的表達(dá)：各工程菌的取適量平板活化的菌苔接種于裝有100ml液體lb培養(yǎng)基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化鈉1％，ph7.0)的500ml種子瓶?jī)?nèi)，添加0.1g/l氨芐青霉素，在37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；5％轉(zhuǎn)接裝2l菌體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖30g/l、酵母粉5g/l、氯化銨8g/l、磷酸二氫鉀5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.2g/l)的5l發(fā)酵罐中，添加0.1g/l氨芐青霉素，發(fā)酵溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm-900rpm，空氣流量為1-4vvm，發(fā)酵過程中用氨水溶液控制ph為7.0，流加葡萄糖控制在10g/l左右，od600生長(zhǎng)至30時(shí)補(bǔ)加0.1mmiptg誘導(dǎo)表達(dá)賴氨酸脫羧酶3h。戊二胺生產(chǎn)：在5l發(fā)酵罐中進(jìn)行全細(xì)胞催化，底物賴氨酸鹽酸鹽濃度約為450g/l，輔酶磷酸吡哆醛0.1mm，工程菌的用量約為3g/l細(xì)胞干重，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，反應(yīng)溫度為52℃，轉(zhuǎn)化4h后，溶液中戊二胺產(chǎn)量，殘留賴氨酸含量及最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率見表2所示。與野生型cada相比，h9r突變體的產(chǎn)量是野生型的2.80倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的2.90倍；k44r突變體的產(chǎn)量是野生型的3.04倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的3.74倍；t88s突變體的產(chǎn)量是野生型的2.27倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的1.99倍；m176v突變體的產(chǎn)量是野生型的2.89倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的3.86倍；y230h突變體的產(chǎn)量是野生型的2.54倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的2.43倍；e111g突變體的產(chǎn)量是野生型的2.85倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的3.20倍。同時(shí)所有突變體的賴氨酸殘留量顯著降低。表2.戊二胺產(chǎn)量及殘留賴氨酸含量討論:本發(fā)明對(duì)野生型賴氨酸脫羧酶的特定位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到賴氨酸脫羧酶突變體的活性顯著提升，其生產(chǎn)1,5-戊二胺的產(chǎn)量是利用野生型賴氨酸脫羧酶的2.2倍以上，甚至接近三倍?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然公開了一些野生型賴氨酸脫羧酶的突變體，例如us2015132808專利申請(qǐng)公開了將88位的蘇氨酸(t)突變成arg、lys和asn。但該文獻(xiàn)公開的賴氨酸脫羧酶生產(chǎn)1,5-戊二胺的產(chǎn)量相比于野生型賴氨酸脫羧酶，僅僅提高了不到20％，甚至大部分突變體對(duì)于生產(chǎn)1,5-戊二胺的提高程度小于10％。此外，arg、lys和asn都為堿性氨基酸，與野生型賴氨酸脫羧酶中的蘇氨酸并不屬于同類氨基酸，而本發(fā)明的突變體在88位進(jìn)行了同類氨基酸的替換，即蘇氨酸和絲氨酸均是側(cè)鏈帶羥基的氨基酸，但這種同類氨酸酸的替換卻生產(chǎn)了出乎意料的顯著技術(shù)效果，產(chǎn)量是野生型的2.27倍，最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的1.99倍。在韓國(guó)專利kr20170017341(a)中報(bào)道f14c和k44c雙突變導(dǎo)致形成一個(gè)二硫鍵，不能提高酶活；但是在可以提高活性24.4％的l7m/n8g雙突變體基礎(chǔ)上再同時(shí)突變f14c和k44c形成的l7m/n8g/f14c/k44c四個(gè)突變的組合突變體活性可以提高56.7％，也就是說k44c必須在與l7m/n8g/f14c三個(gè)突變體組合才有效果。而本發(fā)明的k44r單位點(diǎn)突變產(chǎn)量是野生型的3.04倍，單位菌體干重的最大的賴氨酸轉(zhuǎn)化速率是野生型的3.74倍，從而生產(chǎn)了出乎意料的技術(shù)效果。實(shí)施例4.表達(dá)帶有his標(biāo)簽賴氨酸酸脫羧酶的工程菌株生產(chǎn)戊二胺采用實(shí)施例1相同的方法，以大腸桿菌基因組為模板，以cada-f(如seqidno:3所示)和cada-r2(如seqidno:17所示)為引物，擴(kuò)增去除taa終止密碼子的cada基因，通過5‘ndei和3’xhoi克隆至載體pet-21a(+)(購(gòu)自novagen公司)，獲得pet21-cadahis表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)的cada在c端加上了6個(gè)his的標(biāo)簽，再將其轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)，獲得e.colibl21(de3)/pet21-cadahis野生型工程菌株。再采用實(shí)施例2相同的方法和引物，以pet21-cadahis質(zhì)粒為模板，分別構(gòu)建m176v和y230h的突變體質(zhì)粒，分別命名為pet21-m176vhis和pet21-y230hhis表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒由金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)，分別獲得cada突變體的工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-m176his和e.colibl21(de3)/pet21-y230hhis。工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-cadahis、e.colibl21(de3)/pet21-m176vhis和e.colibl21(de3)/pet21-y230hhis通過搖瓶表達(dá)酶及催化評(píng)價(jià)工程菌的性能。工程菌株的菌體培養(yǎng)及酶得表達(dá)如下：各工程菌取5微升甘油菌液接種于裝有5ml液體lb培養(yǎng)基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化鈉1％，ph7.0)的25ml黑蓋瓶?jī)?nèi)，添加0.1g/l氨芐青霉素，在37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；2％轉(zhuǎn)接裝30ml液體lb培養(yǎng)基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化鈉1％，ph7.0)的250ml搖瓶中，添加0.1g/l氨芐青霉素，發(fā)酵溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為220rpm，od600生長(zhǎng)至0.6時(shí)補(bǔ)加0.1mmiptg誘導(dǎo)表達(dá)4h。戊二胺生產(chǎn)條件如下：在250ml搖瓶中進(jìn)行全細(xì)胞催化，底物賴氨酸鹽酸鹽濃度約為25g/l，輔酶磷酸吡哆醛0.1mm，工程菌的用量約為0.2g/l細(xì)胞干重，控制攪拌轉(zhuǎn)速為220rpm，反應(yīng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)化4h后，溶液中戊二胺產(chǎn)量及殘留賴氨酸含量見表3所示。與帶his標(biāo)簽的野生型cada相比，帶his標(biāo)簽的m176v突變體的產(chǎn)量是野生型的2.67倍，帶his標(biāo)簽的y230h突變體的產(chǎn)量是野生型的2.00倍，同時(shí)帶his標(biāo)簽的突變體的賴氨酸殘留量顯著降低。表3.戊二胺產(chǎn)量及殘留賴氨酸含量以上結(jié)果表明，在賴氨酸脫羧酶cada的提高活性突變體基礎(chǔ)上進(jìn)行部分序列修飾，突變體依然能夠保持提高活性的性能。實(shí)施例5.賴氨酸酸脫羧酶cada的組合突變及其戊二胺生產(chǎn)采用實(shí)施例2相同的方法及引物，在單突變體基礎(chǔ)上逐一構(gòu)建雙突變及三突變體。在m176v突變體基礎(chǔ)上分別構(gòu)建m176v/t88s和m176v/y230h雙突變表達(dá)質(zhì)粒，命名為pet21-m176v/t88s和pet21-m176v/y230h。在m176v/y230h突變體基礎(chǔ)上分別構(gòu)建m176v/y230h/h9r、m176v/y230h/e111g和m176v/y230h/k44r三突變體，命名為pet21-m176v/y230h/h9r、pet21-m176v/y230h/e111g和pet21-m176v/y230h/k44r表達(dá)質(zhì)粒。以上質(zhì)粒由金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)，獲得cada突變體的工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-m176v/t88s、e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h、e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h/h9r、e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h/e111g和e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h/k44r。所有工程菌及野生型對(duì)照采用實(shí)施例4相同的搖瓶表達(dá)酶及催化體現(xiàn)評(píng)價(jià)工程菌的性能，最終溶液中戊二胺產(chǎn)量及殘留賴氨酸含量見表4所示。與野生型cada相比，m176v/t88s突變體的產(chǎn)量是野生型的2.3倍，m176v/y230h突變體的產(chǎn)量是野生型的1.7倍，m176v/y230h/h9r突變體的產(chǎn)量是野生型的2.3倍，m176v/y230h/e111g突變體的產(chǎn)量是野生型的2.7倍，m176v/y230h/k44r突變體的產(chǎn)量是野生型的3.3倍，同時(shí)突變體的賴氨酸殘留量顯著降低。表4.戊二胺產(chǎn)量及殘留賴氨酸含量以上結(jié)果表明，與野生型相比，對(duì)賴氨酸脫羧酶cada的提高活性突變體進(jìn)行組合突變所得的組合突變體也能夠保持提高1.7倍以上活性的性能。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所<120>新的賴氨酸脫羧酶突變體及其應(yīng)用<130>p2015-1663<160>17<170>patentinversion3.5<210>1<211>715<212>prt<213>artificialsequence<220><223>大腸桿菌來(lái)源的野生型賴氨酸脫羧酶<400>1metasnvalilealaileleuasnhismetglyvaltyrphelysglu151015gluproilearggluleuhisargalaleugluargleuasnphegln202530ilevaltyrproasnaspargaspaspleuleulysleuilegluasn354045asnalaargleucysglyvalilepheasptrpasplystyrasnleu505560gluleucysglugluileserlysmetasngluasnleuproleutyr65707580alaphealaasnthrtyrserthrleuaspvalserleuasnaspleu859095argleuglnileserphepheglutyralaleuglyalaalagluasp100105110ilealaasnlysilelysglnthrthraspglutyrileasnthrile115120125leuproproleuthrlysalaleuphelystyrvalarggluglylys130135140tyrthrphecysthrproglyhismetglyglythralapheglnlys145150155160serprovalglyserleuphetyraspphepheglyproasnthrmet165170175lysseraspileserileservalsergluleuglyserleuleuasp180185190hisserglyprohislysglualagluglntyrilealaargvalphe195200205asnalaaspargsertyrmetvalthrasnglythrserthralaasn210215220lysilevalglymettyrseralaproalaglyserthrileleuile225230235240aspargasncyshislysserleuthrhisleumetmetmetserasp245250255valthrproiletyrpheargprothrargasnalatyrglyileleu260265270glyglyileproglnserglupheglnhisalathrilealalysarg275280285vallysgluthrproasnalathrtrpprovalhisalavalilethr290295300asnserthrtyraspglyleuleutyrasnthrasppheilelyslys305310315320thrleuaspvallysserilehispheaspseralatrpvalprotyr325330335thrasnpheserproiletyrgluglylyscysglymetserglygly340345350argvalgluglylysvaliletyrgluthrglnserthrhislysleu355360365leualaalapheserglnalasermetilehisvallysglyaspval370375380asnglugluthrpheasnglualatyrmetmethisthrthrthrser385390395400prohistyrglyilevalalaserthrgluthralaalaalametmet405410415lysglyasnalaglylysargleuileasnglyserilegluargala420425430ilelysphearglysgluilelysargleuargthrgluseraspgly435440445trpphepheaspvaltrpglnproasphisileaspthrthrglucys450455460trpproleuargseraspserthrtrphisglyphelysasnileasp465470475480asngluhismettyrleuaspproilelysvalthrleuleuthrpro485490495glymetglulysaspglythrmetserasppheglyileproalaser500505510ilevalalalystyrleuaspgluhisglyilevalvalglulysthr515520525glyprotyrasnleuleupheleupheserileglyileasplysthr530535540lysalaleuserleuleuargalaleuthraspphelysargalaphe545550555560aspleuasnleuargvallysasnmetleuproserleutyrargglu565570575aspprogluphetyrgluasnmetargileglngluleualaglnasn580585590ilehislysleuilevalhishisasnleuproaspleumettyrarg595600605alaphegluvalleuprothrmetvalmetthrprotyralaalaphe610615620glnlysgluleuhisglymetthrglugluvaltyrleuaspglumet625630635640valglyargileasnalaasnmetileleuprotyrproproglyval645650655proleuvalmetproglyglumetilethrglugluserargproval660665670leuglupheleuglnmetleucysgluileglyalahistyrprogly675680685phegluthraspilehisglyalatyrargglnalaaspglyargtyr690695700thrvallysvalleulysglugluserlyslys705710715<210>2<211>2148<212>dna<213>artificialsequence<220><223>大腸桿菌來(lái)源的野生型賴氨酸脫羧酶的編碼基因<400>2atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgt60gaacttcatcgcgcgcttgaacgtctgaacttccagattgtttacccgaacgaccgtgac120gacttattaaaactgatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgttatttttgactgggat180aaatataatctcgagctgtgcgaagaaattagcaaaatgaacgagaacctgccgttgtac240gcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacagatt300agcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagacc360actgacgaatatatcaacactattctgcctccgctgactaaagcactgtttaaatatgtt420cgtgaaggtaaatatactttctgtactcctggtcacatgggcggtactgcattccagaaa480agcccggtaggtagcctgttctatgatttctttggtccgaataccatgaaatctgatatt540tccatttcagtatctgaactgggttctctgctggatcacagtggtccacacaaagaagca600gaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtact660tccactgcgaacaaaattgttggtatgtactctgctccagcaggcagcaccattctgatt720gaccgtaactgccacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgatgttacgccaatc780tatttccgcccgacccgtaacgcttacggtattcttggtggtatcccacagagtgaattc840cagcacgctaccattgctaagcgcgtgaaagaaacaccaaacgcaacctggccggtacat900gctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccgacttcatcaagaaa960acactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctca1020ccgatttacgaaggtaaatgcggtatgagcggtggccgtgtagaagggaaagtgatttac1080gaaacccagtccactcacaaactgctggcggcgttctctcaggcttccatgatccacgtt1140aaaggtgacgtaaacgaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttct1200ccgcactacggtatcgtggcgtccactgaaaccgctgcggcgatgatgaaaggcaatgca1260ggtaagcgtctgatcaacggttctattgaacgtgcgatcaaattccgtaaagagatcaaa1320cgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtatggcagccggatcatatcgat1380acgactgaatgctggccgctgcgttctgacagcacctggcacggcttcaaaaacatcgat1440aacgagcacatgtatcttgacccgatcaaagtcaccctgctgactccggggatggaaaaa1500gacggcaccatgagcgactttggtattccggccagcatcgtggcgaaatacctcgacgaa1560catggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctgctgttcctgttcagcatcggt1620atcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgactttaaacgtgcgttc1680gacctgaacctgcgtgtgaaaaacatgctgccgtctctgtatcgtgaagatcctgaattc1740tatgaaaacatgcgtattcaggaactggctcagaatatccacaaactgattgttcaccac1800aatctgccggatctgatgtatcgcgcatttgaagtgctgccgacgatggtaatgactccg1860tatgctgcattccagaaagagctgcacggtatgaccgaagaagtttacctcgacgaaatg1920gtaggtcgtattaacgccaatatgatccttccgtacccgccgggagttcctctggtaatg1980ccgggtgaaatgatcaccgaagaaagccgtccggttctggagttcctgcagatgctgtgt2040gaaatcggcgctcactatccgggctttgaaaccgatattcacggtgcataccgtcaggct2100gatggccgctataccgttaaggtattgaaagaagaaagcaaaaaataa2148<210>3<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>3gcatcccatatgaacgttattgcaatattgaatcac36<210>4<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>4ttacgccaagcttttttttgctttcttctttcaatacc38<210>5<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>5gcaatattgaatcgcatgggggtttatttt30<210>6<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>6aaaataaacccccatgcgattcaatattgc30<210>7<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>7cgaccgtgacgacttattaagactgatcgaaaacaatgc39<210>8<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>8gcattgttttcgatcagtcttaataagtcgtcacggtcg39<210>9<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>9cgtattcctctctcgatgtaagcctgaatg30<210>10<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>10catcgagagaggaatacgtattagcgaacgc31<210>11<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>11gcgctgggtgctgctggagatattgctaataagatc36<210>12<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>12gatcttattagcaatatctccagcagcacccagcgc36<210>13<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>13gatttctttggtccgaataccgtgaaatctgatatttc38<210>14<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>14gaaatatcagatttcacggtattcggaccaaagaaatc38<210>15<211>37<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>15ctgcgaacaaaattgttggtatgcactctgctccagc37<210>16<211>37<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>16gctggagcagagtgcataccaacaattttgttcgcag37<210>17<211>35<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>17cgccaagcttttttttgctttcttctttcaatacc35當(dāng)前第1頁(yè)12