本發(fā)明涉及一種抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法，特別適用于杜氏鹽藻養(yǎng)殖企業(yè)在養(yǎng)殖過程中雜藻的污染控制。
背景技術(shù)：
：杜氏鹽藻（dunalselalsalana），是一種嗜鹽的單細胞真核藻類，是到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)最耐鹽和嗜鹽的真核單細胞生物之一，從屬綠藻門,真綠藻綱,團藻目，鹽藻科,杜氏鹽藻沒有細胞壁，細胞表面帶有正電荷，是杜氏藻中具有代表性的藻種。杜氏鹽藻在特定的生長環(huán)境中，可產(chǎn)生大量類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量最高，可占其干重的14%。β-胡蘿卜素屬四萜類化合物,是一種重要的天然食用色素,廣泛地存在于植物、藻類和真菌中,是全部類胡蘿卜素中含量最大和研究的最多的一種。β-胡蘿卜素具有很強的清除氧自由基的功能，能防治癌癥、腫瘤和心血管疾病以及老年性癡呆和白內(nèi)障等與年齡有關(guān)的退化性疾病，是一種重要的保健品，而且是維生素a的前體和食品加工業(yè)的天然色素。目前從鹽藻中提取出來的胡蘿卜素已經(jīng)制成多種應用于抗輻射、保護視力、緩解眼疲勞的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，杜氏鹽藻具有很高的市場價值，養(yǎng)殖杜氏鹽藻的企業(yè)也越來越多。杜氏鹽藻在在戶外大規(guī)模養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖條件較為粗獷、企業(yè)多藻種養(yǎng)殖等因素的影響，杜氏鹽藻很容易受到雜藻的污染。而這種污染一方面會與杜氏鹽藻在生長過程中競爭培養(yǎng)基，更不利于杜氏鹽藻的生物量的積累，降低藻液中β-胡蘿卜素的含量，這會直接影響杜氏鹽藻藻粉的質(zhì)量，降低企業(yè)效益，不利于企業(yè)長遠發(fā)展。而傳統(tǒng)的抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法是增加培養(yǎng)基鹽度（nacl），使跑道池中藻液鹽度達到17波美以上，但鹽度過高會影響杜氏鹽藻生物量的積累，并且會使養(yǎng)殖成本大大增加。因此，企業(yè)迫切需要找到一種效果更好、養(yǎng)殖成本較低的抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，降低養(yǎng)殖成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明提供了一種抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法，包括以下四個部分:第一部分：確定杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中污染雜藻的種類；具體為:利用普通光學顯微鏡和熒光倒置顯微鏡對生長到對數(shù)期的被雜藻污染的杜氏鹽藻進行取樣、制片和觀察，并拍照記錄藻液中雜藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，同時參照《淡水微型生物圖譜》、《微藻生物技術(shù)》和《中國淡水藻類》等相關(guān)書籍對污染藻種進行分類鑒定；第二部分：確定生長到穩(wěn)定期的杜氏鹽藻藻液中各種污染雜藻的細胞數(shù)并計算其與藻液中細胞總數(shù)和杜氏鹽藻細胞數(shù)之比；具體操作步驟為:①確定單位體積藻液中藻細胞總數(shù)a與杜氏鹽藻細胞數(shù)b；②計算單位體積藻液中污染雜藻的細胞數(shù)c，計算公式為：c=a–b③計算單位體積藻液中污染雜藻細胞的比例k1，計算公式為：k1=c/a×100%④計算單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2，計算公式為：k2=c/b第三部分：確定不同mg2+濃度的培養(yǎng)基條件下單位體積藻液中污染雜藻細胞所占比例；具體步驟為：①配制杜氏鹽藻培養(yǎng)基：配置具有mg2+濃度梯度的培養(yǎng)液，并將配好的培養(yǎng)基置于容器中；②接種：在每個容器中接入被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液，搖勻后測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細胞的細胞數(shù)，并計算單位體積藻液中污染雜藻細胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2；③培養(yǎng)：對接入了被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液的杜氏鹽藻進行培養(yǎng)；④單位體積藻液中污染雜藻的細胞數(shù)：在容器中的藻液培養(yǎng)過程中，每天固定時間（與接種時間保持一致）對每個容器中的藻液進行取樣并測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細胞的細胞數(shù)，并計算單位體積藻液中污染雜藻細胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2，直到藻細胞生長到穩(wěn)定期為止；第四部分：對第三部分得到的結(jié)果進行對比分析，找出培養(yǎng)基所用最佳mg2+濃度。作為進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第二部分的步驟①中，確定單位體積藻液中藻細胞總數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)是使用血球計數(shù)板的方式對企業(yè)內(nèi)長到穩(wěn)定期的隨機五個跑道池中養(yǎng)殖的杜氏鹽藻藻液進行計數(shù)，計數(shù)結(jié)果取平均值，可對企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻的污染情況有進一步把握。確定長到穩(wěn)定期的單位體積藻液中藻細胞總數(shù)a與杜氏鹽藻細胞數(shù)b，能把企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻的污染情況用數(shù)據(jù)表示出來，有利于后續(xù)工作的開展。作為進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第二部分的步驟②，杜氏鹽藻藻液中污染雜藻種類多，細胞形態(tài)較杜氏鹽藻細胞差距大，因此計算單位體積藻液中污染雜藻的細胞數(shù)更加簡單并能直接反映問題。作為進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第三部分的步驟①中，將培養(yǎng)基中mg2+濃度（mgso4·7h2o）設(shè)置成0，1，2，3，4，5mmol/l六個梯度，每個梯度三個平行，且培養(yǎng)基中其他成分與企業(yè)所用鹽藻養(yǎng)殖培養(yǎng)基成分濃度保持一致，并將配好的培養(yǎng)基置于25升的容器中，每個容器裝10升培養(yǎng)基。分梯度配置培養(yǎng)基，既能把企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻所用培養(yǎng)基中鎂離子的濃度包括進去，又可對不同mg2+濃度梯度的培養(yǎng)實驗進行對比分析，以使實驗結(jié)果更理想。同時，對處于每個mg2+濃度梯度的培養(yǎng)基設(shè)置三個平行梯度，能讓實驗結(jié)果更加準確。另外，除了mg2+濃度，培養(yǎng)基中其他成分與企業(yè)所用鹽藻養(yǎng)殖培養(yǎng)基成分濃度保持一致，可保證單一變量的原則，并能確保實驗結(jié)果的準確性。進一步，所述第三部分中所述容器為透明塑料桶。使用透明塑料桶，可以方便人們觀察和記錄數(shù)據(jù)，同時透明塑料桶可以最大限度的保證試驗樣品與跑道池中的藻液接受相同的光照。作為進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第三部分的步驟②，每個容器中接入被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液1l。這可在不影響杜氏鹽藻正常生長的前提下，使接種藻液鎂離子濃度對整個培養(yǎng)基中鎂離子濃度的影響降到最低。接種搖勻后測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細胞的細胞數(shù)，可對實驗初始藻液的污染程度有一定把握并提供具體的數(shù)據(jù)，為后續(xù)實驗數(shù)據(jù)提供對比。接種搖勻后計算單位體積藻液中污染雜藻細胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2，既能對實驗初始藻液的污染程度有進一步把握，又可對實驗結(jié)果提供更正確的理論與數(shù)據(jù)依據(jù)。作為進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第三部分中的培養(yǎng)方式為將接種后的容器放入養(yǎng)殖鹽藻的跑道池中，并用繩子固定，每隔一個小時手搖一次。由于企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻的光照強，溫度高，水的比熱容較大，直接將大塑料桶置于光照下，會使大塑料桶內(nèi)藻液溫度急劇升高，藻細胞很快會死亡，將接種后的透明塑料桶放入養(yǎng)殖鹽藻的跑道池中，并用繩子固定，可利用跑道池藻液表面積大散熱快的特點，既能保證大塑料桶內(nèi)藻液溫度恒定，又能保證與跑道池內(nèi)藻液溫度保持一致，并且接受的光照強度也一致，確保了單一變量的原則。培養(yǎng)過程匯中，對大塑料桶內(nèi)藻液每隔一個小時手搖一次，能保證藻液中藻細胞充分接受光照，提高藻細胞的光和效率。本發(fā)明技術(shù)效果顯著，主要體現(xiàn)在：杜氏鹽藻在培養(yǎng)基中鎂離子缺乏時，會啟用上述污染雜藻沒有的光和系統(tǒng)備用保護機制，即合成β-胡蘿卜素，因此，降低培養(yǎng)基中鎂離子濃度會抑制藻液中雜藻的生長，但對杜氏鹽藻的生長影響較小，而且鎂離子缺乏會誘導杜氏鹽藻細胞積累β-胡蘿卜素。本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有高鹽度抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法相比，成本低，效果明顯，操作程序簡單，并可誘導杜氏鹽藻細胞積累β-胡蘿卜素，可謂一舉兩得。用該方法處理，對杜氏鹽藻生物量幾乎沒有影響，因此藻粉產(chǎn)量恒定，并且使藻粉質(zhì)量提高，企業(yè)經(jīng)濟效益增長明顯，對于杜氏鹽藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展意義重大。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，便于更好的理解本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明。本實施例中所涉及的實驗技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常用技術(shù)，實驗材料和試劑，如未特別說明，均為市售商品。本發(fā)明提供了一種抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法，包括以下四個部分:第一部分：確定杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中污染雜藻的種類；具體為:利用普通光學顯微鏡和熒光倒置顯微鏡對生長到對數(shù)期的被雜藻污染的杜氏鹽藻進行取樣、制片和觀察，并拍照記錄藻液中雜藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，同時參照《淡水微型生物圖譜》、《微藻生物技術(shù)》和《中國淡水藻類》等相關(guān)書籍對污染藻種進行分類鑒定；第二部分：確定生長到穩(wěn)定期的杜氏鹽藻藻液中各種污染雜藻的細胞數(shù)并計算其與藻液中細胞總數(shù)和杜氏鹽藻細胞數(shù)之比；具體操作步驟為：①用血球計數(shù)板對企業(yè)內(nèi)長到穩(wěn)定期的隨機五個跑道池中養(yǎng)殖的杜氏鹽藻藻液進行計數(shù)，計數(shù)結(jié)果取平均值，確定單位體積藻液中藻細胞總數(shù)a與杜氏鹽藻細胞數(shù)b和藻液中β胡蘿卜素含量；②計算單位體積藻液中污染雜藻的細胞數(shù)c，計算公式為：c=a–b③計算單位體積藻液中污染雜藻細胞的比例k1，計算公式為：k1=c/a×100%④計算單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2，計算公式為：k2=c/b第三部分：確定不同mg2+濃度的培養(yǎng)基條件下單位體積藻液中污染雜藻細胞所占比例；具體步驟為：①配制杜氏鹽藻培養(yǎng)基：將培養(yǎng)基中mg2+濃度（mgso4·7h2o）設(shè)置成0，1，2，3，4，5mmol/l六個梯度，每個梯度三個平行，培養(yǎng)基中其他成分與企業(yè)所用鹽藻養(yǎng)殖培養(yǎng)基成分濃度保持一致，將配好的培養(yǎng)基置于25升透明塑料桶中，每個透明塑料桶裝10升培養(yǎng)基；②接種：每個透明塑料桶接入被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液1l，搖勻后測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細胞的細胞數(shù)，并計算單位體積藻液中污染雜藻細胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2；③培養(yǎng)：將接種后的透明塑料桶放入養(yǎng)殖鹽藻的跑道池中，并用繩子固定，每隔一個小時手搖一次；④單位體積藻液中污染雜藻的細胞數(shù)：在透明塑料桶中的藻液培養(yǎng)過程中，每天固定時間（與接種時間保持一致）對每個透明塑料桶中的藻液進行取樣并測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細胞的細胞數(shù)，并計算單位體積藻液中污染雜藻細胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2，直到藻細胞生長到穩(wěn)定期為止;第四部分：對第三部分得到的結(jié)果進行對比分析，找出培養(yǎng)基所用最佳mg2+濃度。其中第一部分，確定杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中污染雜藻的種類為微小杜氏藻（綠藻門）、小球藻（綠藻門）、擬微球藻（綠藻門）、鹽生隱桿藻（藍藻門）。其中第二部分的步驟①具體為：用血球計數(shù)板對企業(yè)跑道池中生長到穩(wěn)定期的杜氏鹽藻藻液中細胞總數(shù)和杜氏鹽藻細胞數(shù)進行計數(shù)，分別為85×104個/ml、64.5×104個/ml。用有機溶劑萃取法對藻液中β-胡蘿卜素進行萃取，并用分光光度計在波長450nm處測定吸光度od450,然后利用公式計算藻液中β-胡蘿卜素含量為6.9mg/l。其中第二部分的步驟②得到單位體積藻液中污染雜藻的細胞數(shù)c=20.5×104個/ml。其中第二部分的步驟③得到單位體積藻液中污染雜藻細胞的比例k1=24.1%。其中第二部分的步驟④得到單位體積藻液中污染雜藻細胞數(shù)與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比k2=0.318。附表7給出了實施例1-實施例6的實驗結(jié)果對比匯總，具體的各實施例的技術(shù)方案如下：實施例1：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為0mmol/l的實驗實驗材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計實驗條件：自然條件實驗結(jié)果如附表1所示：附表1培養(yǎng)時間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.650.911.422.483.584.365.245.305.48單位體積杜氏鹽藻細胞數(shù)（104個/ml）6.258.513.2523.434.2542.7543.243.543.75雜藻所占比例(%)24.120.415.09.24.71.20.40.20.08雜藻與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比0.3180.2780.2050.1310.0720.0180.0060.0040.003實施例2：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為1mmol/l的實驗實驗材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計實驗條件：自然條件實驗結(jié)果如附表2所示：附表2培養(yǎng)時間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.680.951.552.613.844.755.565.875.86單位體積杜氏鹽藻細胞數(shù)（104個/ml）6.548.9014.4624.6536.7548.6751.2551.6752.92雜藻所占比例(%)23.823.522.918.413.710.26.85.55.4雜藻與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比0.3200.3170.3080.2420.1800.1340.0890.0650.058實施例3：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為2mmol/l的實驗實驗材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計實驗條件：自然條件實驗結(jié)果如附表3所示：附表3培養(yǎng)時間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.700.991.802.613.024.976.026.106.09單位體積杜氏鹽藻細胞數(shù)（104個/ml）6.759.2516.7528.5039.7050.7555.2555.7556.00雜藻所占比例(%)24.023.822.419.715.21210.710.810.2雜藻與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比0.3150.3120.2930.2590.2000.1570.1380.1280.125實施例4：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為3mmol/l的實驗實驗材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計實驗條件：自然條件實驗結(jié)果如附表4所示：附表4培養(yǎng)時間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.651.161.962.683.215.186.206.256.27單位體積杜氏鹽藻細胞數(shù)（104個/ml）6.7510.818.2530.0042.4553.7558.559.2560.00雜藻所占比例(%)23.923.823.221.619.517.816.415.916.0雜藻與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比0.3200.3140.3020.2850.2560.2310.2150.2080.204實施例5：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為4mmol/l的實驗實驗材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計實驗條件：自然條件實驗結(jié)果如附表5所示：附表5培養(yǎng)時間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.621.202.082.753.825.526.546.476.60單位體積杜氏鹽藻細胞數(shù)（104個/ml）7.0012.4019.8032.2546.557.2563.2563.863.75雜藻所占比例(%)24.124.023.623.222.522.422.422.522.4雜藻與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比0.3160.3150.3120.2980.2840.2800.2830.2790.281實施例6：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為5mmol/l的實驗實驗材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計實驗條件：自然條件實驗結(jié)果如附表6所示：附表6培養(yǎng)時間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.681.482.513.725.025.956.596.656.71單位體積杜氏鹽藻細胞數(shù)（104個/ml）7.0215.2524.836.255061.4568.568.9569.25雜藻所占比例(%)24.124.224.224.023.923.923.724.023.9雜藻與杜氏鹽藻細胞數(shù)之比0.3200.3170.3160.3210.3180.3170.3210.3180.318對上述實例進行對比分析，對比結(jié)果如附表1所示。結(jié)果表明，當培養(yǎng)基中mg2+濃度為2mmol/l時，可使杜氏鹽藻藻液中污染雜藻比例降低50%以上，杜氏鹽藻生物量的增加影響很小，相對增加了β-胡蘿卜素的積累量；附表7為穩(wěn)定期杜氏鹽藻藻液中各項生長指標對比分析表：附表7當前第1頁12