本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的多重pcr引物組、包括該引物組的五重pcr檢測試劑盒以及利用該引物組的五重pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

隨著規(guī)模化養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，疫病的發(fā)生和流行也相應(yīng)增加，導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)效益下降。重要的細(xì)菌性傳染病如禽大腸桿菌病、雞白痢、雞傷寒等重要細(xì)菌病嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)。

目前，國內(nèi)主要依靠抗生素防治細(xì)菌病，但由于長期、不合理地使用抗生素導(dǎo)致：一方面產(chǎn)生廣泛的耐藥性，另一方面藥物殘留直接影響了動(dòng)物產(chǎn)品的安全。因此，加強(qiáng)對這些細(xì)菌性疾病的長期監(jiān)測和研究，對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生都具有重要意義。

國內(nèi)外對細(xì)菌性疾病的診斷和監(jiān)測技術(shù)種類繁多，主要包括：細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒定、分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等。pcr技術(shù)因其特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡單、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

目前，針對禽大腸桿菌和不同血清型沙門菌建立了多種檢測方法，然而，沒有針對禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的快速檢測及鑒別診斷pcr方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能夠準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、特異性和靈敏性高的檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的引物組，其特征在于，包括：特異性擴(kuò)增禽大腸桿菌phoa基因的引物對ecphoa-f和ecphoa-r；特異性擴(kuò)增雞傷寒沙門菌glgc基因的引物對sgglgc-f和sgglgc-r；特異性擴(kuò)增雞傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌spec基因的引物對sgpspec-f和sgpspec-r；特異性擴(kuò)增腸炎沙門菌sdfⅰ基因的引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r；特異性擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌stm4495基因的引物對ststm4495-f和ststm4495-r，

各個(gè)引物的核苷酸序列分別為：

ecphoa-f，5’-ggcaatacactcactatgcgctg-3’,

ecphoa-r，5’-aggattcgcagcatgatcctg-3’；

sgglgc-f，5’-cgtcgctataaagcggaatatgtc-3’，

sgglgc-r，5’-ccttttcaaaacatacgcgagtag-3’；

sgpspec-f，5’-gttgccgtaccggtcgtaacg-3’，

sgpspec-r，5’-ttcctgacgggcatcgacggc-3’；

sesdfⅰ-f，5’-gatgtggttggttcgtcactg-3’，

sesdfⅰ-r，5’-gcgagacctcaaacttactcag-3’；

ststm4495-f，5’-cagcggtatgatgcggtagt-3’，

ststm4495-r，5’-tcaccggtggacatgcctgc-3’。

本發(fā)明提供的引物組，還具有這樣的特征：引物對ecphoa-f和ecphoa-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為761bp；引物對sgglgc-f和sgglgc-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為83bp；引物對sgpspec-f和sgpspec-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為249bp；引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為409bp；引物對ststm4495-f和ststm4495-r用于擴(kuò)增的目的片段大小為569bp。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種五重pcr檢測試劑盒，用于檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌，其特征在于，包括：用于建立pcr反應(yīng)體系的2×pcr預(yù)混液和引物組，其中，pcr反應(yīng)體系用于引物組中的各個(gè)引物對進(jìn)行特異性擴(kuò)增，引物組上述的引物組。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測試劑盒，還具有這樣的特征：其中，2×pcrpremix的體積為12.5μl，在引物組中，引物對ecphoa-f和ecphoa-r的體積各為0.5μl，引物對sgglgc-f和sgglgc-r的體積各為0.2μl，引物對sgpspec-f和sgpspec-r的體積各為0.3μl，引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r的體積各為0.4μl、引物對ststm4495-f和ststm4495-r的體積各為0.5μl。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種檢測禽大腸桿菌、雞傷寒門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的五重pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，基于待檢測細(xì)菌制備得到pcr模板；步驟2，制備特異性引物組，采用權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)的引物組制備得到特異性引物組；步驟3，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，基于步驟1得到的pcr模板，采用步驟2得到的特異性引物組建立得到包括的引物組的pcr反應(yīng)體系，然后采用該pcr反應(yīng)體系在預(yù)定pcr反應(yīng)參數(shù)條件下進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟4，進(jìn)行電泳檢測，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測得到電泳結(jié)果，根據(jù)電泳結(jié)果判定是否出現(xiàn)禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌或鼠傷寒沙門菌。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測方法，還具有這樣的特征：步驟1中得到的pcr模板為待檢測細(xì)菌的菌液，具體過程為：將待檢測細(xì)菌的菌株接種至lb液體培養(yǎng)基，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)至od600＝1.0，得到的菌液即為pcr模板。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測方法，還具有這樣的特征：步驟1中得到的pcr模板為細(xì)菌粗提dna，具體過程為：將待檢測細(xì)菌的菌株接種至lb液體培養(yǎng)基，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)至od600＝1.0，得到菌液，然后將1ml該菌液在10000-12000r/min下離心1-2min，去上清，加0.1-0.5ml滅菌超純水重懸，煮沸5-10min，然后在10000-12000r/min下離心3-5min，得到的上清即為細(xì)菌粗提dna。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測方法，還具有這樣的特征：步驟3的pcr反應(yīng)體系包括：12.5μl的2×pcrpremix，1.0μl的模板、7.7μl的超純水，和引物組，在引物組中，引物對ecphoa-f和ecphoa-r的體積各為0.5μl，引物對sgglgc-f和sgglgc-r的體積各為0.2μl，引物對sgpspec-f和sgpspec-r的體積各為0.3μl，引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r的體積各位0.4μl、引物對ststm4495-f和ststm4495-r的體積各為0.5μl。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測方法，還具有這樣的特征：制備特異性引物組時(shí)，引物組中使用的各個(gè)引物的濃度為10pm，將使用的各個(gè)引物的稀釋液置于-20℃保存后再用。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測方法，還具有這樣的特征：預(yù)定pcr反應(yīng)參數(shù)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃下30s，57℃下30s，72℃下50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃，10min。

本發(fā)明提供的五重pcr檢測方法，還具有這樣的特征：步驟4的具體過程為，取10μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠電泳板孔中，在80-100v電壓下，電泳30-40min，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照得到電泳結(jié)果，對電泳結(jié)果進(jìn)行判定的前提條件為陰性對照無任何條帶出現(xiàn)，當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)761bp條帶判定為禽大腸桿菌，當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)83bp和249bp條帶判定為雞傷寒沙門菌，當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)249bp條帶判定為雞白痢沙門菌，當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)409bp條帶判定為腸炎沙門菌，當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)569bp條帶判定為鼠傷寒沙門菌。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的引物組在制備用于檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的五重pcr檢測試劑盒中的應(yīng)用。

發(fā)明作用與效果

本發(fā)明提供的用于檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的多重pcr引物組、包括該引物組的五重pcr檢測試劑盒以及利用該引物組的五重pcr檢測方法，由于其中的引物組的特異性強(qiáng)，靈敏性高，同時(shí)，該引物組具有良好的重復(fù)性，所以本發(fā)明提供的包括采用上述引物組的五重pcr檢測方法或含有上述引物組的五重pcr檢測試劑盒對禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的檢測具有靈敏、特異、快速和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為快速檢測與鑒定禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌提供了有效的手段，同時(shí)該引物組還可以在制備用于檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的五重pcr檢測試劑盒中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果；

圖2為評價(jià)例1中特異性評價(jià)的試驗(yàn)結(jié)果；

圖3為評價(jià)例2中以細(xì)菌菌液為模板的敏感性評價(jià)的試驗(yàn)結(jié)果；

圖4為評價(jià)例2以細(xì)菌基因組dna為模板的敏感性評價(jià)的試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。對于實(shí)施例中所用到的具體方法或材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明技術(shù)思路的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的替換選擇，而不僅限于本發(fā)明實(shí)施例的具體記載。

實(shí)施中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1五重pcr檢測方法

本實(shí)施例采用用于多重pcr檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的引物組對禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌進(jìn)行檢測，具體包括以下步驟：

步驟1，基于待檢測細(xì)菌制備得到pcr模板

將待檢細(xì)菌菌株接種至lb液體培養(yǎng)基，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)至od600＝1.0，即得到可以用做pcr模板的菌液。

步驟2，制備特異性引物組

制備用于多重pcr檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的引物組：以其中的各個(gè)引物組的濃度為10pm，對該濃度的引物的稀釋液置于-20℃保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融，

上述引物組包括以下引物對：

特異性擴(kuò)增禽大腸桿菌phoa基因的引物對ecphoa-f和ecphoa-r；特異性擴(kuò)增雞傷寒沙門菌glgc基因的引物對sgglgc-f和sgglgc-r；特異性擴(kuò)增雞傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌spec基因的引物對sgpspec-f和sgpspec-r；特異性擴(kuò)增腸炎沙門菌sdfⅰ基因的引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r；特異性擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌stm4495基因的引物對ststm4495-f和ststm4495-r，

各個(gè)引物的核苷酸序列分別為：

ecphoa-f，5’-ggcaatacactcactatgcgctg-3’,

ecphoa-r，5’-aggattcgcagcatgatcctg-3’；

sgglgc-f，5’-cgtcgctataaagcggaatatgtc-3’，

sgglgc-r，5’-ccttttcaaaacatacgcgagtag-3’；

sgpspec-f，5’-gttgccgtaccggtcgtaacg-3’，

sgpspec-r，5’-ttcctgacgggcatcgacggc-3’；

sesdfⅰ-f，5’-gatgtggttggttcgtcactg-3’，

sesdfⅰ-r，5’-gcgagacctcaaacttactcag-3’；

ststm4495-f，5’-cagcggtatgatgcggtagt-3’，

ststm4495-r，5’-tcaccggtggacatgcctgc-3’。

其中，引物對ecphoa-f和ecphoa-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為761bp；引物對sgglgc-f和sgglgc-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為83bp；引物對sgpspec-f和sgpspec-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為249bp；引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r用于擴(kuò)增的目的片段的大小為409bp；引物對ststm4495-f和ststm4495-r用于擴(kuò)增的目的片段大小為569bp。

步驟3，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)

基于步驟1中得到的pcr模板，采用步驟2中的特異性引物組建立得到包括的引物組的pcr反應(yīng)體系：取pcr管，分別加2×pcrpremix12.5μl、引物ecphoa-f/ecphoa-r各0.5μl、引物sgglgc-f/sgglgc-r各0.2μl、引物sgpspec-f/sgpspec-r各0.3μl、引物sesdfⅰ-f/sesdfⅰ-r各0.4μl、引物ststm4495-f/ststm4495-r各0.5μl、模板1.0μl、超純水7.7μl，混勻，得到25μl的pcr反應(yīng)體系。

然后采用上述pcr反應(yīng)體系在預(yù)定pcr反應(yīng)參數(shù)條件下進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物：預(yù)定pcr反應(yīng)參數(shù)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃30s，57℃30s，72℃50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃，10min。

步驟4，進(jìn)行電泳檢測，

對步驟3中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測得到電泳結(jié)果，根據(jù)電泳結(jié)果判定是否出現(xiàn)禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌或鼠傷寒沙門菌：

取10μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠電泳板孔中，在80-100v電壓下，電泳30-40min，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照得到電泳結(jié)果，對電泳結(jié)果進(jìn)行判定的前提條件為陰性對照無任何條帶出現(xiàn)：

當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)761bp條帶判定為禽大腸桿菌，

當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)83bp和249bp條帶判定為雞傷寒沙門菌，

當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)249bp條帶判定為雞白痢沙門菌，

當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)409bp條帶判定為腸炎沙門菌，

當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)569bp條帶判定為鼠傷寒沙門菌。

圖1為實(shí)施例1的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

如圖1所示，泳道1為禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌五重pcr產(chǎn)物；泳道2為雞傷寒沙門菌(83bp和249bp)；泳道3為雞白痢沙門菌(249bp)；泳道4為腸炎沙門菌(409bp)；泳道5為鼠傷寒沙門菌(569bp)；泳道6為禽大腸桿菌(761bp)；泳道7為陰性對照。

實(shí)施例2五重pcr檢測試劑盒進(jìn)行檢測

本實(shí)施例，與實(shí)施例1的步驟一致，不同的是本實(shí)施例直接采用包括實(shí)施例1中提到的引物組的五重pcr檢測試劑盒來建立上述pcr反應(yīng)體系。

此時(shí)的五重pcr檢測試劑盒的組成包括2×pcrpremix和引物組，其中2×pcrpremix的體積為12.5μl，引物組中引物對ecphoa-f和ecphoa-r的體積各為0.5μl，引物對sgglgc-f和sgglgc-r的體積各為0.2μl，引物對sgpspec-f和sgpspec-r的體積各為0.3μl，引物對sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r的體積各為0.4μl、引物對ststm4495-f和ststm4495-r的體積各為0.5μl。

評價(jià)例1特異性評價(jià)

本實(shí)施例以實(shí)施例2的五重pcr檢測試劑盒為例對實(shí)施例1和實(shí)施例2中的引物組進(jìn)行了特異性檢測的：

選取鴨疫里默氏桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌pa14、豬鏈球菌、鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、單增李斯特菌、禽巴氏桿菌、禽致病性大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、禽支原體、鼠傷寒沙門菌、禽波氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌(cvcc1805)、雞毒支原體等細(xì)菌按照五重pcr檢測試劑盒使用說明操作進(jìn)行pcr，產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

圖2為評價(jià)例1中特異性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

如圖2所示，泳道m(xù)：dnamaker；泳道1：五重pcr；泳道2：血清1型鴨疫里默氏桿菌ch3；泳道3：金黃色葡萄球菌(cvcc543)；泳道4：銅綠假單胞菌pa14；泳道5：豬鏈球菌；泳道6：血清2型鴨疫里默氏桿菌yb2；泳道7：鼠傷寒沙門菌sat52；泳道8：血清10型鴨疫里默氏桿菌hxb2；泳道9：雞傷寒沙門菌；泳道10：單增李斯特菌10403s；泳道11：禽巴氏桿菌(cvcc493)；泳道12：禽致病性大腸桿菌；泳道13、鴨疫里默氏桿菌(wg4)；泳道14：雞白痢沙門菌(cvcc519)；泳道15：禽支原體(cvcc274)；泳道16：鼠傷寒沙門菌sl1344；泳道17：禽波氏菌(ipdh591-77)；泳道18：金黃色葡萄球菌(cvcc543)；泳道19：腸炎沙門菌(cvcc1805)；泳道20：雞毒支原體(cvcc1651)；泳道21：陰性對照。

結(jié)果顯示，以禽致病性大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌分別作為模板，可擴(kuò)增到特異性條帶；而對其他細(xì)菌等對照樣品擴(kuò)增，pcr結(jié)果均為陰性。說明實(shí)施例1和實(shí)施例2中的引物組的特異性較強(qiáng)，采用其建立的五重pcr檢測方法或檢測試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、特異性地將禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌與其它菌區(qū)別開來。

評價(jià)例2敏感性評價(jià)

本實(shí)施例以實(shí)施例2的五重pcr檢測試劑盒為例對實(shí)施例1和實(shí)施例2中的引物組的敏感性進(jìn)行了測評：

本實(shí)施例分別以倍比稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)菌dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

(1)以細(xì)菌培養(yǎng)物為模板的敏感性試驗(yàn)

分別接種禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌至lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌至od600＝1.0，各取1ml菌液12000r/min離心1min，去上清，滅菌超純水洗3次，1ml滅菌超純水重懸，分別制備菌液，濃度為10⁶cfu/μl、10⁵cfu/μl、10⁴cfu/μl、10³cfu/μl、10²cfu/μl、10cfu/μl。各吸取1μl加入pcr反應(yīng)體系，按照五重pcr檢測試劑盒操作說明進(jìn)行pcr，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果測定上述引物組對禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的敏感性。

圖3為評價(jià)例2中以細(xì)菌菌液為模板的靈敏股評價(jià)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

如圖3所示，結(jié)果分析如表1，表明采用上述引物組建立的pcr反應(yīng)體系最低可以檢測出1000cfu細(xì)菌。

表1以細(xì)菌菌液為模板的敏感性測評結(jié)果

(+：出現(xiàn)特異性條帶；－:未出現(xiàn)特異性條帶)

(2)以細(xì)菌基因組dna為模板的敏感性試驗(yàn)

分別接種禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌至lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌至od600＝1.0，分別取其中1ml增菌液，按照試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行操作，提取細(xì)菌dna。分別稀釋濃度為100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、100pg/μl、10pg/μl。各吸取1μl加入pcr反應(yīng)體系，按照五重pcr試劑盒操作說明進(jìn)行pcr，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果測定上述引物組對禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的敏感性。

圖4為評價(jià)例2以細(xì)菌基因組dna為模板的敏感性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

如圖4所示，結(jié)果分析如表2，表面本發(fā)明建立的禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的五重pcr檢測試劑盒最低可以檢測出100pg的禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌，而僅能檢測出500pg的雞白痢沙門菌。

表2以細(xì)菌基因組dna為模板的敏感性測評結(jié)果

(+：出現(xiàn)特異性條帶；－:未出現(xiàn)特異性條帶)

說明實(shí)施例1和實(shí)施例2中的引物組的敏感性較強(qiáng)，采用其建立的五重pcr檢測方法或五重pcr檢測試劑盒可以靈敏地將禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌與其它菌區(qū)別開來。

評價(jià)例3重復(fù)性評價(jià)

本實(shí)施例以實(shí)施例2的五重pcr檢測試劑盒為例對制備的禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的五重pcr檢測試劑盒的重復(fù)性進(jìn)行了測評：

本實(shí)施例分別在不同時(shí)間、不同操作條件(包括pcr儀、操作人員)下對陽性模板進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表3。

表3重復(fù)性檢測結(jié)果

(+：出現(xiàn)特異性條帶；－:未出現(xiàn)特異性條帶)

如表3所示，根據(jù)pcr檢測結(jié)果，說明實(shí)施例1和實(shí)施例2中的引物組的重復(fù)性較強(qiáng)，采用其建立的五重pcr檢測方法或五重pcr檢測試劑盒可以重復(fù)性較好地將禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌與其它菌區(qū)別開來。

實(shí)施例1和實(shí)施例2的作用與效果

通過評價(jià)例1至評價(jià)例3可以看出，由于采用的引物組對實(shí)驗(yàn)室已保存的陽性菌株進(jìn)行擴(kuò)增，均可擴(kuò)增到特異性條帶，而其他細(xì)菌菌株等對照樣品均未擴(kuò)增到條帶，說明該引物組的特異性強(qiáng)，而用采用該引物組檢測不同稀釋度的陽性樣品，其最低檢測敏感性可達(dá)到1000cfu細(xì)菌菌液及500pg細(xì)菌基因組dna，說明該該引物組的靈敏性高，同時(shí)，該引物組具有良好的重復(fù)性，說明其穩(wěn)定性較強(qiáng)。所以實(shí)施例1和實(shí)施例2提供的包括采用上述引物組的五重pcr檢測方法或含有上述引物組的五重pcr檢測試劑盒對禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的檢測具有靈敏、特異、快速和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為快速檢測與鑒定禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌提供了有效的手段，同時(shí)該引物組還可以制備用于檢測禽大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌的五重pcr檢測試劑盒。

另外，實(shí)施例1和實(shí)施例2中，步驟1中以培養(yǎng)的待檢測細(xì)菌的菌液為制備得到的pcr模板，作為本發(fā)明，還可以繼續(xù)對步驟1中的菌液進(jìn)行提取得到細(xì)菌粗提dna為pcr模板，此時(shí)具體的過程為：將待檢測細(xì)菌的菌株接種至lb液體培養(yǎng)基，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)至od600＝1.0，得到菌液，然后將1ml該菌液在10000-12000r/min下離心1-2min，去上清，加0.1-0.5ml滅菌超純水重懸，煮沸5-10min，然后在10000-12000r/min下離心3-5min，得到的上清即為細(xì)菌粗提dna。

本發(fā)明的范圍不受具體實(shí)施方案的限制，實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進(jìn)。改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。