本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及snp位點(diǎn)的應(yīng)用及其檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
目前實體器官移植術(shù)后移植物的健康監(jiān)測常采用抽血進(jìn)行肝功能檢查，或穿刺針采集組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。
對于常規(guī)抽血功能檢查，其各項指標(biāo)如肌酐、alt、ast、膽紅素等等靈敏度和特異性均不高，無法準(zhǔn)確的反應(yīng)移植物的健康狀況。
對于目前金標(biāo)準(zhǔn)的組織活檢，其雖可直接的反應(yīng)移植物的健康狀況。但存在以下重大缺點(diǎn)：
1)侵入式檢測，對病人造成較大痛苦，同時對移植物造成損傷；
2)檢出異常時，移植物實質(zhì)性損傷已經(jīng)發(fā)生，并且損傷往往已經(jīng)較為嚴(yán)重，這時對于臨床醫(yī)生來說拯救移植物往往已經(jīng)太晚；
3)若穿刺針未采集到移植物的病灶組織部分，會對結(jié)果準(zhǔn)確性造成較大影響，因此準(zhǔn)確性和靈敏度不高。
因此，尋求一種可靈敏、特異、準(zhǔn)確的評估肝移植物的損傷狀況和排斥風(fēng)險的無創(chuàng)傷檢測方法具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供snp位點(diǎn)在制備評估肝移植術(shù)后移植物損傷及排斥風(fēng)險的產(chǎn)品中的應(yīng)用及其檢測試劑盒，使得該試劑盒能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確的評估肝移植物的損傷狀況和排斥風(fēng)險，無需進(jìn)行任何創(chuàng)傷檢測。
本發(fā)明提供了snp位點(diǎn)在制備評估肝移植術(shù)后移植物損傷及排斥風(fēng)險的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述snp位點(diǎn)選自：
rs2012852、rs2071985、rs867983、rs218503、rs407930、rs2070849、rs2067003、rs2269951、rs2269952、rs399714、rs469783、rs2074012、rs179785、rs84933、rs2076537、rs2071277、rs2075817、rs1007311、rs400218、rs1064416、rs2076416、rs2076435、rs2074428、rs2070776、rs2071427、rs2071502、rs2073900、rs2071484、rs518471、rs2279096、rs2278945、rs474949、rs1381532、rs2279984、rs2279985、rs1278278、rs2279547、rs2270181、rs2070669、rs2070759、rs1635537、rs2070876、rs624707、rs1289315、rs2070340、rs926027、rs2070777、rs2238354、rs2076237、rs2075852、rs2076393、rs2251252、rs362549、rs2268082、rs2070351、rs2070356、rs2251252、rs2070438、rs521861和rs2282614。
本發(fā)明研究表明，將上述60個snp位點(diǎn)作為檢測靶點(diǎn)，計算得到的受體游離dna中供體游離dna的含量(gcfdna供受比)能夠準(zhǔn)確反映出移植排斥的程度，為臨床檢測器官移植術(shù)后移植物損傷和排斥風(fēng)險提供了一種簡單而有效的輔助手段。
本發(fā)明還提供了一種用于評估肝移植術(shù)后移植物損傷及排斥風(fēng)險的試劑盒，包括序列如seqidno.1～120所示的引物和序列如seqidno.121～240所示的探針。
本發(fā)明提供的上述試劑盒，seqidno.1～120所示的引物和seqidno.121～240所示的探針用于擴(kuò)增、檢測60個snp位點(diǎn)，序列如下：
優(yōu)選的，seqidno.121～240所示的探針中，用于檢測snp位點(diǎn)的探針對的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記nfq和mgb。本發(fā)明對于熒光基團(tuán)的種類沒有特殊限制，本領(lǐng)域常用的種類即可。在本發(fā)明提供的具體實施例中，檢測snp位點(diǎn)的兩條探針的5’端分別標(biāo)記fam熒光基團(tuán)和vic熒光基團(tuán)。
本發(fā)明提供的試劑盒還包括ddpcrtmprobesupermix和超純水。
本發(fā)明還提供一種檢測受體游離dna中供體游離dna含量的方法，包括如下步驟：
步驟1：以待測樣品的總的游離dna為模板，加入seqidno.1～120所示的引物和序列如seqidno.121～240所示的探針，制備數(shù)字pcr反應(yīng)微滴，將制備好的反應(yīng)微滴轉(zhuǎn)移至96孔板中，進(jìn)行數(shù)字pcr反應(yīng)；
步驟2：反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板轉(zhuǎn)移至qx200tm數(shù)字pcr讀取儀中，讀取結(jié)果并獨(dú)立分析每個snp位點(diǎn)，計算供者游離dna/受者游離dna的比值，即gcfdna供受比，其中，snp位點(diǎn)的分析方法如下：
1)該位點(diǎn)兩種堿基比(低含量/高含量)＝0.9～1，視該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)；
2)該位點(diǎn)兩種堿基比(低含量/高含量)＝0，即僅有一種堿基陽性，視該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)；
3)該位點(diǎn)兩種堿基比(低含量/高含量)＝0～0.9，視該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)；在有效數(shù)據(jù)中，以snpno#1和snpno#2為例，snpno#1的堿基比約等于snpno#2的兩倍(2±0.4)，則判定snpno#1中，移植受者和移植供者在中均為純合子；在snpno#2中，移植受者為純合子，移植供者為雜合子；
4)選擇判定移植受者和移植供者均為純合子的snp位點(diǎn)數(shù)據(jù)，計算平均值，即為gcfdna供受比。
在本發(fā)明提供的具體實施例中，數(shù)字pcr的反應(yīng)體系為：
所述snp位點(diǎn)的引物和探針為權(quán)利要求3所述試劑盒中的引物和探針。
在本發(fā)明提供的具體實施例中，所述pcr反應(yīng)程序如下：
95℃、10min預(yù)變性；95℃、15s，57℃、1min，40個循環(huán)；95℃保持10min；10℃保存。
本發(fā)明提供了snp位點(diǎn)在評估肝移植術(shù)后移植物損傷及排斥風(fēng)險中的應(yīng)用，通過對移植后受體總游離dna的60個特定snp位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)合數(shù)字pcr技術(shù)以及特定的計算方法，最終獲得受體游離dna中供體游離dna的含量，即gcfdna供受比，根據(jù)gcfdna供受比判斷移植排斥的程度，為臨床檢測器官移植術(shù)后移植物損傷和排斥風(fēng)險提供了一種簡單而有效的輔助手段，具有如下優(yōu)勢：
(1)無創(chuàng)，5～10ml靜脈采血即可進(jìn)行檢測；
(2)靈敏，選擇現(xiàn)有pcr技術(shù)中精準(zhǔn)度最高的數(shù)字pcr設(shè)備作為檢測平臺；
(3)早期，選用核酸分子作為檢測靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)的變化發(fā)生在器官病變或損傷的最早期；
(4)特異，檢測出的特定游離dna直接來源于肝臟移植物，可特異性的反映出肝臟移植物的健康狀況；
(5)方便，相比該領(lǐng)域其它技術(shù)或檢測，例如測序、dsa檢測等需要移植受者和移植供者雙方的樣本相比，該方法無需移植供者樣本，僅需受者血液樣本即可完成。
具體實施方式
本發(fā)明公開了snp位點(diǎn)的應(yīng)用及其檢測試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
對所公開的實施例的說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。
本發(fā)明提供的snp位點(diǎn)的應(yīng)用及其檢測試劑盒中所用試劑均可由市場購得。引物序列和探針序列由(請補(bǔ)充合成序列的)公司合成。
下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
實施例1采用本發(fā)明提供的試劑盒評估肝移植術(shù)后移植物損傷及排斥風(fēng)險
血漿中總游離dna提取
1、使用streck無創(chuàng)采血管靜脈采集一名肝移植術(shù)后2周受者血液10ml；
2、將streck無創(chuàng)采血管采集的血液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，低溫4℃2000g離心10min；取上層血漿約4～6ml于新的15ml離心管中，繼續(xù)低溫4℃4000g離心10min；取上層血漿4～6ml于新的15ml離心管中；
3、取4ml血漿，使用qiagen公司的qiaampcirculatingnucleicacidkit進(jìn)行總游離dna的提取，調(diào)整dna濃度為10～40ng/ul。
制備數(shù)字pcr反應(yīng)微滴
1、配置數(shù)字pcr反應(yīng)體系，制備數(shù)字pcr反應(yīng)微滴，進(jìn)行pcr反應(yīng)；60個snp位點(diǎn)的檢測體系，共計60管，反應(yīng)配制如下：
其中，用于檢測snp位點(diǎn)的引物包含上、下游引物，各0.125μl，共0.25μl；探針為兩條，各0.125μl，共0.25ul。
2、將配置好的反應(yīng)體系加入到微滴發(fā)生卡dg8tmcartridges的樣品槽中，同時在發(fā)生油槽中加入60ul微滴發(fā)生油dropletgenerationoilforprobes，最后用封膜dg8tmgaskets封好，置于微滴發(fā)生儀上，進(jìn)行反應(yīng)微滴的制備。
3、將制備好的反應(yīng)微滴緩慢轉(zhuǎn)移至96孔板中，然后用鋁制封膜配合封膜機(jī)器熱封好后進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置如下：
結(jié)果分析
pcr反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板轉(zhuǎn)移至qx200tm數(shù)字pcr讀取儀中，讀取結(jié)果，見表1。
表160個snp位點(diǎn)的原始數(shù)據(jù)
按照以下方法對表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：
1)該位點(diǎn)兩種堿基比(低含量/高含量)＝0.9～1，視該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)；
2)該位點(diǎn)兩種堿基比(低含量/高含量)＝0，即僅有一種堿基陽性，視該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)；
3)該位點(diǎn)兩種堿基比(低含量/高含量)＝0～0.9，視該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)；在有效數(shù)據(jù)中，以snpno#1和snpno#2為例，snpno#1的堿基比約等于snpno#2的兩倍(2±0.4)，則判定snpno#1中，移植受者和移植供者在中均為純合子；在snpno#2中，移植受者為純合子，移植供者為雜合子；
4)選擇判定移植受者和移植供者均為純合子的snp位點(diǎn)數(shù)據(jù)，計算平均值，即為gcfdna供受比。
評價標(biāo)準(zhǔn)：gcfdna供受比≤10％，表示受者肝臟移植物相對健康，排斥風(fēng)險低；gcfdna供受比＞10％，表示受者肝臟移植物存在較重?fù)p傷，排斥風(fēng)險高。
根據(jù)表1的數(shù)據(jù)計算得到gcfdna供受比(供者游離dna/受者游離dna)為35.4±1.2％，表示受者肝臟移植物存在較重?fù)p傷，排斥風(fēng)險高。
實施例2
使用edta采血管采集實施例1中肝移植術(shù)后2周受者的血液2ml，進(jìn)行肝功常規(guī)檢測，結(jié)果如表2所示。
表2受者肝功常規(guī)檢測結(jié)果
結(jié)果顯示，該肝移植術(shù)后2周受者的肝臟移植物存在實質(zhì)性損傷，和本發(fā)明檢測結(jié)果吻合，此外，采用本發(fā)明提供的試劑盒對其他50名肝移植患者進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均與肝功常規(guī)檢測結(jié)果相吻合，表明本發(fā)明試劑盒能夠及時、準(zhǔn)確并特異地反映肝臟移植物的健康狀況。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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<110>成都仕康美生物技術(shù)有限公司
<120>snp位點(diǎn)的應(yīng)用及其檢測試劑盒
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