本發(fā)明屬于蛹蟲草栽培領(lǐng)域，特別涉及一種提高蛹蟲草中蟲草素含量的方法。
背景技術(shù)：
：作為傳統(tǒng)中藥，蟲草的研究和應用一直備受關(guān)注。蟲草是由子囊菌門(ascomycoa)，肉座菌目(hypocreales)，麥角菌科(clavicipitaceae)蟲草屬(cordyceps)真菌的孢子寄生于昆蟲幼蟲身上并由夏季從蟲體生出子實體所形成的菌蟲復合體。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(hepialusarmoricanus)幼蟲的冬蟲夏草(ophiocordycepssinensis)和寄生于鱗翅目蛹的蛹蟲草(cordycepsmilitaris)(sungetal.,2007)。蟲草具有多種藥用功效，包括：抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎癥、殺蟲、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神經(jīng)保護、腎保護等功能，在腫瘤治療、器官移植、肝腎移植和心臟保護等方面具有重要作用。其主要成分包括四類：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。蟲草素作為一種新型的廣譜抗菌素有抗病毒、抗腫瘤作用。，以其特有的抗菌抗病毒活性，已引起全球科技發(fā)達國家的高度重視。它能抑制病毒的rna合成；對枯草桿菌和鳥結(jié)核桿菌均有抑制作用；對hiv-i型病毒也有殺傷作用；尤其對多種實體惡性腫瘤有很強的抑制作用。因此，將其作為一種用途廣泛的新藥來開發(fā)是必然的趨勢。snf1基因是snf1蛋白激酶復合體的一個組分，是哺乳動物、植物、真菌等維持體內(nèi)能源代謝所必需的(hardieetal.,1998,annualreviewofbiochemistry67:821-855)，其在真核生物中高度保守。在酵母(saccharomycescerevisiae)中，snf1是酵母為適應葡萄糖有限的環(huán)境下利用其他碳源，如蔗糖、乙醇、乳糖等多必需的；在赤酶菌(gibberellasaubinetii)中，gzsnf1基因的敲除影響了該菌的有性、無性生殖，改變了赤酶對碳源的應用(leeetal.,2009,eukaryotcell8(1):116-127)；在青霉(penicilliumdigitatum)中，pdsnf1基因在正常條件下并不參與cwde基因的表達調(diào)控，然而在以果膠為碳源的生長條件下，pdsnf1基因參與cwde基因的表達調(diào)控；pdsnf1基因缺失突變菌株在以不同碳源的條件下(如葡萄糖、蔗糖、果膠、果糖、甘油等)，突變體的生長速度變慢，菌絲生長受到不同程度的抑制(zhang，etal.,2013,applmicrobiolbiotechnol.doi10.1007/s00253-012-4593-z)。通過酵母snf1的氨基酸同源性的比對，在已測序的蛹蟲草cm01中找到其同源基因ccm_05552，該基因與酵母的蛋白序列相似性為60％，與食用真菌草菇的蛋白序列相似性為51％，香菇的蛋白序列相似性為38％。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高蛹蟲草中蟲草素含量的方法，該方法通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了蛹蟲草的cmsnf1基因敲除突變菌株，該突變菌株和野生型菌株及回補菌株相比，其發(fā)酵液中蟲草素的產(chǎn)量提高7倍以上，為進一步篩選蛹蟲草的優(yōu)良品種打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明的一種提高蛹蟲草中蟲草素含量的方法，包括：(1)收集pda上蛹蟲草菌絲，提取dna；將目的基因cmsnf1的上下游片段利用引物進行pcr擴增，將擴增片段構(gòu)建到pdht-bar上，得到pdht-bar-cmsnf1載體；(2)將上述pdht-bar-cmsnf1載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，通過平板培養(yǎng)選出含有目的載體的菌株；(3)將蛹蟲草孢子和步驟(2)得到的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，經(jīng)誘導和篩選得到轉(zhuǎn)基因菌株。所述步驟(1)中的目的基因cmsnf1的序列如seqidno.1所示。來源于蛹蟲草，已經(jīng)在genbank注冊，geneid:18167570。所述步驟(1)中的引物為：snfl-u1：ccctcgagtttggttctatctgggctaa；snfl-u2：cggaattcaaagtttccgtccgtcata；snfl-d1：ggactagtacaatgggctacggaaag；snfl-d2：cgagctccaagggtgtcactgaggac。所述步驟(1)中的pdht的序列如seqidno.2所示。所述載體pdht-bar為經(jīng)過改建的pdht，即加入啟動子和bar基因。所述步驟(2)中的平板培養(yǎng)采用含50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基。所述步驟(3)中的誘導和篩選采用含300μg/ml頭孢霉素和300μg/ml草銨膦的m-100培養(yǎng)基。有益效果本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了蛹蟲草的cmsnf1基因敲除突變菌株，該突變菌株和野生型菌株及回補菌株相比，其發(fā)酵液中蟲草素的產(chǎn)量提高7倍以上，為進一步篩選蛹蟲草的優(yōu)良品種打下了基礎(chǔ)。附圖說明圖1為本發(fā)明基因敲除載體構(gòu)建示意圖；圖2為本發(fā)明基因敲除菌株的pcr、rt-pcr鑒定圖；其中，1:marker；2:cm01；3，4:δcmsnf1；5:snf1-comp；圖3為野生型菌株、突變菌株、互補菌株hplc檢測的蟲草素含量。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。蛹蟲草菌株所用培養(yǎng)基pda培養(yǎng)基：購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。配方：馬鈴薯淀粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，瓊脂粉15.0g/l。sdb培養(yǎng)基：購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。配方：動物組織胃蛋白酶消化物5.0g/l，胰酶消化酪蛋白胨5.0g/l，葡萄糖20.0g/l。m-100培養(yǎng)基：m-100saltsolution62.5ml/l，葡萄糖10g/l，kno33g/l，瓊脂粉15g/l。做覆蓋用時，瓊脂粉減為0.75g/l。m-100saltsolution：kh2po416g/l，na2so44g/l，kcl8g/l，mgso4.7h2o2g/l，cacl21g/l，m-100traceelementsolution8ml/l。m-100traceelementsolution：h3bo30.06g/l，mncl2·4h2o0.14g/l，zncl20.40g/l，na2moo4·2h2o0.04g/l，fecl3·6h2o0.10g/l，cuso4·5h2o0.40g/l。細菌菌株所用培養(yǎng)基lb培養(yǎng)基：購自mdbio(青島生工生物科技有限公司)。配方：tryptone10g/l，nacl10g/l，yeastextract5g/l。若要配制固體培養(yǎng)基，則再添加15g/l瓊脂粉。農(nóng)桿菌誘導培養(yǎng)基im(液體)：2.5×mmsaltsolution400ml/l，葡萄糖1.8g/l，甘油5ml/l，加水定容至940ml。高壓滅菌并冷卻至50℃后，每升加入40ml1mmes(ph5.5，過濾除菌)，20ml10mmas(乙酰丁香酮，dmso(二甲基亞砜)配制，過濾除菌)。若配置固體培養(yǎng)基，葡萄糖減為0.9g/l，并加入瓊脂粉15.0g/l。2.5×mmsaltsolution：kh2po43.625g/l，k2hpo45.125g/l，mgso4.7h2o1.250g/l，nacl0.375g/l，cacl2·2h2o0.165g/l，feso4·7h2o0.0062g/l(先配制6.2g/l的溶液，用時移取1ml)，(nh4)2so41.250g/l。實施例1重組載體的構(gòu)建1)利用引物snfl-u/snfl-d分別擴增獲得同源重組載體的上下游同源臂，利用酶切位點酶切、消化、連接，獲得重組載體pdht-bar-cmsnf1。snfl-u1ccctcgagtttggttctatctgggctaasnfl-u2cggaattcaaagtttccgtccgtcatasnfl-d1ggactagtacaatgggctacggaaagsnfl-d2cgagctccaagggtgtcactgaggacsnfl-check1tgcgacaccctcatatcatcaasnfl-check2atgtgccttctacacccgacttpcr反應體系和條件為試劑體積(μl)pcrmagicmix2.025primer12primer22templatedna3ddh2o18total50反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30個循環(huán)；最后在72℃下補平10min，10℃保存。2)轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌：將1μl構(gòu)建好的載體加入到100μl農(nóng)桿菌agl-1感受態(tài)中，液氮中放置5min，使感受態(tài)徹底凍住；37℃溫育5min，使感受態(tài)徹底融化；向感受態(tài)中加入800μllb液體培養(yǎng)基，28℃，220rmp振蕩培養(yǎng)2h；在超凈臺中將菌液均勻涂于lb固體培養(yǎng)基上(含50μg/ml卡那霉素)，28℃培養(yǎng)30h。選取3個長出的單菌落分別用snfl-u/snfl-d引物進行pcr驗證，檢驗轉(zhuǎn)化是否成功。實施例2同源重組載體蛹蟲草中的轉(zhuǎn)化(根癌農(nóng)桿菌介導的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化)1)從lb平板(含50μg/ml卡那霉素)上挑選一新鮮培養(yǎng)的含目的載體的農(nóng)桿菌agl-1單菌落，接種于5mllb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)中，220rpm，28℃過夜培養(yǎng)。2)次日離心收集菌體，用等體積的液體誘導培養(yǎng)基im重懸，移取適量的重懸液至5ml液體誘導培養(yǎng)基im使od660＝0.14-0.2。3)28℃、220rpm振蕩培養(yǎng)4-6h，菌液濃度至od660＝0.5-0.8之間即可。4)蛹蟲草孢子的培養(yǎng)和收集：在超凈工作中，將在pda培養(yǎng)基上活化好(25℃，20d)的新鮮菌絲轉(zhuǎn)移至均質(zhì)儀中，加入50mlsdb液體培養(yǎng)基，均質(zhì)30s(低速10s，高速10s，低速10s)后，移取10ml至100mlsdb液體培養(yǎng)基中，25℃，150rmp，搖床培養(yǎng)7d至芽生孢子量達到108-109。無紡布過濾收集芽生孢子，儲存在4℃待用，一個月內(nèi)可用。5)取上述農(nóng)桿菌菌液和用0.05％tween20稀釋至1×106個/ml的孢子懸液各100μl充分混勻后涂布于im平板，28℃共培養(yǎng)2d。6)加入1ml0.05％tween20溶液至上述平板，用涂布器充分洗滌(刮取)混勻共培養(yǎng)物。將洗滌下來的培養(yǎng)物按每板200μl均勻涂布在含300μg/ml頭孢霉素和300μg/ml草銨膦的m-100培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3～5d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，即得基因敲除菌株。7)挑取轉(zhuǎn)化子至含300μg/ml頭孢霉素的m-100培養(yǎng)基上，待其長至直徑為1-2cm時小量提取基因組進行pcr驗證(圖2)，同時提取野生出發(fā)菌株和過表達菌株的rna，進行反轉(zhuǎn)錄為cdna，進行表達量的驗證，實驗證明cmsnf1的基因幾乎不表達。實施例3轉(zhuǎn)基因菌株的蟲草素含量檢測1)菌絲發(fā)酵分別收集野生型菌株和突變菌株的新鮮孢子懸浮液，濃度調(diào)至108，吸取300μl，接種到100ml的sdb培養(yǎng)基中，25℃，150rmp，搖床培養(yǎng)7d；2)取培養(yǎng)基，經(jīng)0.22μm水膜過濾于進樣瓶中；3)選用250mm*4.6mm(i.d.)，5μm的c18色譜柱，流動相為20％甲醇和80％水，流速1.0ml/min柱溫30℃，紫外波長260nm，進樣量為10μl。結(jié)果如圖3所示，相對于野生型菌株和回補菌株，突變菌株中的蟲草素含量有很大提高。sequencelisting<110>上海市農(nóng)業(yè)科學院<120>一種提高蛹蟲草中蟲草素含量的方法<130>1<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>2240<212>dna<213>人工序列<400>1atggctcaccgaggctttgatgatgaggaactaaccatttcgctctcatcaacgcacgtt60cgccgacagcagcaaccgcagcacccaccccaccaccgtcatgatgccgaccggccgccc120aagccggcgtcccaaaccgtcggcgctcccccaaaggaaaagacaaagacggagcagcgt180attggtgcctacaaggtgattcgcacactgggtgaaggctcgtttggtaaggtcagacta240gccacccacatcggcaccggccagcaggtcgctctcaagattatcgcccgcaagaagctc300atcagccgtgacatggttggccgcgttgagcgagagattgagtacctgcagctgctgcga360caccctcatatcatcaaactgtgagtgtccaatacattgcgggcaatccgagacacgcta420accgccatccaccatagatacaccgtcatcaagacacagaccgaaatcatcatggtcctc480gaatacgccggcggagaactgttcgactacattgtacaaaatggccgcatgaaggagccc540gaagctcgacgcttctttcagcaaatgctctgcgctgtcgagtactgccatcgccacaag600attgttcaccgcgatcttaagcccgaaaatctgcttctcgacgagaacctcaatgtcaag660attgctgatttcggtctaagcaacattatgacggacggaaactttctcaagacatcctgt720ggcagtcccaactatgcagccccagaggttattggcggaaagctgtatgctggcccggaa780gttgacgtctggagctgtggagtaatcctctacgtcttgcttgtcggacgtctgcccttt840gatgacgagcacatccccagtctctttgccaagattgcaagaggaacatatagtatgccc900cagtggatgccaagcggcgccgctaatctcatcaagaaaatgctcgtcgtcaatccagtt960cagcgtgccacgatcgaggatatccgccaggacccatggttcatgaccgaactccccgct1020tacctgcagcctcccgtcgaggagtttctcaacacaggtgtggatcctaacagagctatt1080gagaagagtgacattgctcccaatgcctctgtcaaggtccaagaacgcctgcataacgag1140gttaccgacaagatcagcaagacaatgggctacggaaagacggatgtcgaagaggctctc1200caatcagaggaaccttccgccatcaaggatgcatacatgattgtccgcgaaaacaaaatg1260atgcaagttaaccagcttgtcgaagctgttgccaccgagaccgaagaaggaagccctgtg1320atgagcatgtcttcggcacgttcgggagttccgccgccgccgcgcccatatgttagcaaa1380gttggtatcctgccttcaagtataggcacgtatcacaaagactacattgagcgtgccaag1440tcgggtgtagaaggcacattgcccgatgagacggccattaacgatgagccgacgtcggct1500cgcactgatgctgaaagggaagaggcttcccgacgtctcaagccccactcgcgctcacaa1560aagcagctagaggagggcttgaagagaccacagggcatgacaccgattaatccgccgaag1620aagaccaagcccgttcgctggcaattcggtatccgatcgcgcaatgctccatgggaggca1680ctgctgtgcatccacaaggcgctgtataagctcggcgccgcttatattccagacgaagac1740tatgcgagattgcggcaacacgatggagagacgccagttgaggaggagccacaagaacct1800ttggatgggaaggaccccacgcaacagtacaagctccccgcggacccttggcacattcgt1860gtgcgctgggagactaagagtatgtgaacctacgaatgccattttgctactgtgtgccac1920aggtactaacgtttgtatccgtagttatgcgcagcacaaacgcgagcacaccgacagaga1980ccgaagccggccaggagaccaagatacccgacacataccaagtgctggagggcaaggccg2040cgcagacgcgggactttgtcgcgctgcacctgggcatccaaatctacgaaatggagcagg2100gcgtgtatctagtggatttcaagtgctcggggtacgagacggcggatggtaagttgctgg2160aggagaaggaggtgatgagcccttttccgttcctagacatggcggcgcgtctcatcatgc2220agcttgctgaagctgattga2240<210>2<211>7076<212>dna<213>人工序列<400>2aattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggca60ctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgc120cttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgc180ccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcag240attgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggta300aacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaaggtt360tatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagta420ctttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccgt480cttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgccct540tttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactaga600accggagacattacgccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgcg660tcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggctgca720ccaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccagga780tgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggccc840gcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctgc900gtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccg960tgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggc1020gcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcac1080agatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctg1140cactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtga1200cgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacg1260ccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacgg1320ccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggta1380cgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggttt1440gtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccg1500ccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgta1560tatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgta1620cttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctg1680caactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgat1740tgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgatt1800gaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccag1860gcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcag1920ccaagcccttacg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