本發(fā)明屬于分子生物學(xué)dna標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種基于ssr標(biāo)記的無花果種質(zhì)資源親緣鑒定方法。
背景技術(shù)：
：無花果(學(xué)名：ficuscarical.)，別稱映日果、奶漿果、蜜果、樹地瓜、天仙果、明目果、菩提圣果，是一種開花植物，隸屬于?？崎艑伲饕L于一些熱帶和溫帶的地方，屬亞熱帶落葉小喬木。無花果有較強(qiáng)的耐鹽性，耐瘠薄，根系發(fā)達(dá)、管理簡單，其果營養(yǎng)豐富，具有提高免疫功能的作用，經(jīng)常食用能增強(qiáng)抗病能力。近年來無花果在我國栽培面積迅速擴(kuò)大。我國無花果栽培品種除了早期引進(jìn)的新疆早黃、新疆晚黃、青皮、布蘭瑞克及紫果等品種外，自20世紀(jì)80代以來從美國、日本等國等國相繼引入了一些果大、品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高的無花果新品種，極大地豐富了我國無花果的品種資源。并開展了育種研究，陸續(xù)培育了10幾個新品種。但目前我國對無花果種質(zhì)資源遺傳多樣性和系譜關(guān)系方面的研究還極其缺乏。這對無花果資源的保護(hù)利用都是十分不利的。為了更好的多我國目前的無花果資源進(jìn)行評價利用，對其進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析是必要的基礎(chǔ)工作。分子標(biāo)記是研究植物遺傳多樣性的有力工具，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、不受環(huán)境條件干擾等優(yōu)點(diǎn)，ssr是一種應(yīng)用十分廣泛的分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用在植物親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、連鎖圖譜建立、分子鑒定等方面，具有操作簡單，準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種基于ssr標(biāo)記的無花果種質(zhì)資源親緣鑒定方法。本發(fā)明提供了基于ssr標(biāo)記的無花果資源分析的穩(wěn)定體系，多態(tài)性高的引物。技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種基于ssr標(biāo)記的無花果種質(zhì)資源親緣鑒定方法，其包括以下步驟：1)提取不同品種的無花果的基因組dna；2)ssr引物的篩選；3)利用ssr引物對不同品種的無花果的基因組dna進(jìn)行pcr；4)對pcr產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳；5)對電泳結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析得出遺傳多樣性，經(jīng)過聚類分析得出無花果種質(zhì)資源親緣關(guān)系。其中，上述步驟2)中篩選得到15對ssr引物對，所述引物對序列如seqidno：1～30。其中，上述步驟3)的pcr反應(yīng)體系為：1×pcr緩沖溶液，2mmol/ldntps，0.4mmol/l引物，dna模板40ng，1utaq。其中，上述步驟3)的pcr反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火復(fù)性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。其中，上述步驟4)的毛細(xì)管電泳中甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按100:1的體積比混勻后，取9μl加入上樣板中，再加入1μl稀釋10倍的pcr產(chǎn)物。本
發(fā)明內(nèi)容還包括用于無花果種質(zhì)資源親緣鑒定的ssr標(biāo)記的引物對，所述引物對序列如seqidno：1～30。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的ssr反應(yīng)體系的產(chǎn)物檢測圖譜清晰(可見圖2和圖3)，此圖譜很準(zhǔn)確地反映出此檢測技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性。本發(fā)明的15個ssr標(biāo)記在30個無花果品種資源中表現(xiàn)多態(tài)性，可重復(fù)(表4)，說明是穩(wěn)定可靠的標(biāo)記，可以用來進(jìn)行無花果品種資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。ssr標(biāo)記是以pcr為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，擴(kuò)增片段的大小往往差別很小，以瓊脂糖和聚丙烯酰胺為代表的檢測技術(shù)未能有效分開，而利用毛細(xì)管電泳圖譜技術(shù)直接測定出片段大小，是非常準(zhǔn)確和有效的檢測技術(shù)。附圖說明圖1為無花果品種的聚類圖；圖2引物fcup069-6的擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜，圖中顯示擴(kuò)增得到兩個等位位點(diǎn)；圖3引物fcup044-6-22的擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜，圖中顯示擴(kuò)增得到兩個等位位點(diǎn)。由于本發(fā)明的電泳圖有15*30＝450張，由于電泳圖相差不大，因此選擇了具有代表性的電泳圖。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實施例11、試驗材料：本試驗共搜集30份無花果品種資源參見表1表1供試的無花果品種2、dna提取2015年春季取(30個供試品種無花果幼嫩葉片作為材料)，采用天根dna提取試劑盒提取總dna用于ssr熒光標(biāo)記分析。3、ssr引物篩選從現(xiàn)有與無花果相關(guān)ssr引物中搜集49對，依據(jù)引物多態(tài)性，篩選無花果引物15對用于本研究，用熒光標(biāo)記物fam對正向引物進(jìn)行標(biāo)記。15對引物參見表2；說明：49對引物是從已經(jīng)發(fā)表的無花果相關(guān)的ssr引物中選擇的。對選取的49對引物根據(jù)其pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，進(jìn)一步篩選多態(tài)性高，重復(fù)率高的引物15對，作為本試驗的引物。表2引物及其序列4、利用ssr引物對30個品種的無花果的基因組dna進(jìn)行pcr4.1反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化ssr熒光引物pcr反應(yīng)體系(共25μl)：1×pcr緩沖溶液，2mmol·l-1dntps，0.4mmol·l-1引物，dna模板40ng，1utaq。94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃(退火溫度在54℃上下波動，具體見表3)復(fù)性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。說明：每個樣品的pcr反應(yīng)體積均為25μl，作為擴(kuò)增模板的dna樣品體積1μl。表3引物退火溫度引物名稱退火溫度fcup038-659℃fcup044-655℃fcup045-657℃fcup066-756℃fcup069-655℃lmfc1754℃lmfc1954℃lmfc2756℃lmfc2856℃lmfc3056℃lmfc3748℃lmfc3848℃mfc258℃mfc748℃mfc857℃5、毛細(xì)管電泳方法將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按100:1的體積比混勻后，取9μl加入上樣板中，再加入1μl稀釋10倍的pcr產(chǎn)物。然后使用3730xl測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳(電泳圖結(jié)果參見圖2～3)。6、數(shù)據(jù)處理與數(shù)據(jù)分析6.1利用genemarker中的fragment(plant)片段分析軟件對測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。按照convert1.31軟件要求的格式錄入到excel中，然后用convert1.31軟件轉(zhuǎn)化成popgene軟件所要求格式。使用popgene1.32軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計算等位基因數(shù)(a)、觀測雜合度(ho)、期望雜合度(he)和shannon信息指數(shù)(i)。采用upgma法進(jìn)行聚類分析。6.2ssr標(biāo)記的多態(tài)性分析從49對無花果ssr引物中15對譜帶清晰、多態(tài)性高的引物。利用選出的15對無花果引物對30個無花果品種材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過毛細(xì)管電泳檢測。共檢測出79個等位變異，每對引物檢測出2-10個等位變異，平均5.27個，每個引物所擴(kuò)增的均為多態(tài)性等位基因。15個位點(diǎn)擴(kuò)增的片段長度在133～326bp之間；各位點(diǎn)pic值0.3328-0.8757，平均為0.5303；觀測雜合度(ho)0.1667～0.8667，平均為0.4768；期望雜合度(he)0.3328～0.8757，平均為0.5929；各位點(diǎn)的shannon信息指數(shù)(i),0.6049～2.1273，平均為1.1360。結(jié)果表明，本試驗所搜集的無花果資源具有較豐富的遺傳多樣性。表415對ssr引物擴(kuò)增產(chǎn)物分析6.3聚類分析經(jīng)過聚類分析30份無花果品種資源在遺傳相似系數(shù)0.67處，可以分為兩個類群，類群i和類群ii，在類群i中，只有3個無花果品種，分別是華麗、以色列和新疆早黃；其他27個無花果品種聚為類群ii。在類群ii中，在遺傳相似系數(shù)0.76處又可分為a、b、c三個亞類，其中a亞類包括布蘭瑞克、白熱那亞、香蕉、紫色波爾多等19個無花果品種，其中布蘭瑞克和白熱那亞被聚在一起；香蕉、紫色波爾多、加州黑、瑪斯義陶芬、亞當(dāng)、羅伊爾、杜魯?shù)绕贩N被聚在一起，其中香蕉和紫色波爾多，加州黑和不詳，羅伊爾和杜魯，分別被聚在一起，表現(xiàn)出更緊密的親緣關(guān)系；b1011、波姬紅、白馬賽、d110、美麗亞、金傲芬、a1213、豐產(chǎn)黃、國王、麗莎等品種被聚在一起，其中b1011和波姬紅，d110和美麗亞，國王和麗莎，分別被聚在一起，表現(xiàn)出更緊密的親緣關(guān)系；在b亞類中只有哈代一個品種；在c亞類中，包括中國紫果、青皮、紫寶、格萊斯、日本紫果、白蜜、紫濤芬等品種，其中青皮和紫寶，格萊斯和日本紫果，分別被聚在一起，表現(xiàn)出更緊密的親緣關(guān)系(參見圖1)。當(dāng)前第1頁12