本發(fā)明涉及一種煤地質(zhì)環(huán)境微生物菌群的變性梯度凝膠電泳(dgge)分子檢測(cè)中煤地質(zhì)環(huán)境古菌專(zhuān)用的物種dnamarker，屬于微生物分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煤地質(zhì)環(huán)境微生物是指煤層產(chǎn)出水樣或煤樣中檢測(cè)到的微生物或上述兩樣經(jīng)富集培養(yǎng)后檢測(cè)到的微生物，主要分為細(xì)菌和古菌兩大類(lèi)。煤地質(zhì)環(huán)境中的古菌主要指產(chǎn)甲烷古菌。產(chǎn)甲烷古菌分布十分廣泛，從土壤到湖泊沉積物，從陸地到海洋，從零下低溫環(huán)境到100℃以上的高溫環(huán)境，遍布地球大部分的缺氧環(huán)境，它們?cè)诘厍蛱妓匮h(huán)中扮演著重要角色，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在所有ch4排放源中，約69％的ch4來(lái)源于產(chǎn)甲烷古菌的新陳代謝活動(dòng)。在煤層以及煤層產(chǎn)出水中檢測(cè)到的產(chǎn)甲烷古菌，它們主要參與降解煤產(chǎn)甲烷的過(guò)程中，產(chǎn)生的ch4稱(chēng)為生物成因煤層氣。目前，生物成因煤層氣具體的生成過(guò)程及機(jī)理還不是十分清楚，但唯一確定的是產(chǎn)甲烷的最后一步，即由產(chǎn)甲烷古菌將co2+h2、乙酸和一些甲基化物質(zhì)轉(zhuǎn)化為ch4，且ch4是它們唯一的代謝產(chǎn)物。根據(jù)產(chǎn)甲烷古菌利用底物類(lèi)別的不同，可以將產(chǎn)甲烷古菌分為3個(gè)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型：甲基營(yíng)養(yǎng)型、氫營(yíng)養(yǎng)型及乙酸營(yíng)養(yǎng)型。甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的特征菌屬主要有methanomethylovorans、methanolobus等；氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的特征菌屬主要有methanothermobacter、methanolinea和methanoculleus等；乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的特征菌屬主要為methanosaeta。而常見(jiàn)的methanosarcina可以利用co2+h2、乙酸以及部分甲基化物質(zhì)產(chǎn)生ch4。研究煤層氣相關(guān)產(chǎn)甲烷古菌的多樣性及其活性與功能對(duì)煤層氣再生和揭示生物降解煤具有重要意義。

在以往的幾十年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要基于16srrna的未培微生物研究技術(shù)來(lái)分析煤層氣相關(guān)微生物的多樣性，常見(jiàn)于克隆文庫(kù)、末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性(terminal-restrictionfragmentlengthpolymorphism，t-rflp)、高通量測(cè)序、變性梯度凝膠電泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，dgge)等分析。各項(xiàng)分析技術(shù)都有其特有的局限性。其中，克隆文庫(kù)建庫(kù)庫(kù)容量有限，往往不能準(zhǔn)確地反應(yīng)原始樣品中微生物的多樣性。t-rflp可能會(huì)對(duì)微生物的多樣性造成過(guò)多估計(jì)，準(zhǔn)確性較差。高通量測(cè)序雖然準(zhǔn)確性高，但針對(duì)微生物多樣性分析的周期較長(zhǎng)，耗時(shí)又耗錢(qián)，成本較高。

dgge技術(shù)在微生物多樣性的研究應(yīng)用中表現(xiàn)出了其可靠性、精確性、高效性等優(yōu)點(diǎn)，但是，對(duì)微生物多樣性的分析過(guò)程中仍需依賴(lài)于dgge條帶的克隆及測(cè)序分析，需要一定的實(shí)驗(yàn)周期，因而不能夠快速直觀地對(duì)dgge條帶所屬的種屬地位進(jìn)行表征。在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，dnamarker常作為一種分子標(biāo)記運(yùn)用在分子生物學(xué)的各種電泳過(guò)程中，以便直觀地對(duì)樣品進(jìn)行分析。一般的dnamarker是由分子量不同的dna片段混合組成，常應(yīng)用在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。這種dnamarker的使用主要是通過(guò)其大小粗略估算樣品dna分子量的大小，如dl2000、100bp、lambdadna/hindiii等。在微生物多樣性分析方面，dnamarker可以作為個(gè)體特異性的遺傳標(biāo)記。因此，需要一種dnamarker能夠應(yīng)用在微生物菌群pcr-dgge的快速檢測(cè)中。但是截至目前為止，還沒(méi)有有關(guān)煤地質(zhì)環(huán)境微生物菌群pcr-dgge檢測(cè)中dnamarker的研究報(bào)道。綜上所述，獲得煤地質(zhì)環(huán)境微生物菌群分子檢測(cè)的dnamarker對(duì)應(yīng)用pcr-dgge檢測(cè)煤地質(zhì)環(huán)境微生物菌群多樣性及其研究微生物降解煤產(chǎn)生煤層氣的機(jī)制具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為實(shí)現(xiàn)高效快速且又經(jīng)濟(jì)有效地應(yīng)用pcr-dgge技術(shù)檢測(cè)煤地質(zhì)環(huán)境微生物菌群的多樣性，本發(fā)明公開(kāi)了一種煤地質(zhì)微生物pcr-dgge檢測(cè)中古菌物種dnamarker及制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的：

用于檢測(cè)煤地質(zhì)微生物古菌物種的dnamarker，該dnamarker由8條dna片段a-h組成，dna片段a的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，dna片段b的核苷酸序列如seq.id.no.2所示，dna片段c的核苷酸序列如seq.id.no.3所示，dna片段d的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，dna片段e的核苷酸序列如seq.id.no.5所示，dna片段f的核苷酸序列如seq.id.no.6所示，dna片段g的核苷酸序列如seq.id.no.7所示，dna片段h的核苷酸序列如seq.id.no.8所示。

本發(fā)明用于檢測(cè)煤地質(zhì)微生物古菌物種的dnamarker制備方法，包括以下步驟：

(1)提取煤地質(zhì)環(huán)境樣品中微生物基因組dna，以提取的微生物基因組dna為模板，第一次pcr擴(kuò)增古菌16srdnav3-v4區(qū)序列，將第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收目標(biāo)dna片段；

(2)以回收的目標(biāo)dna片段為模板進(jìn)行第二次pcr擴(kuò)增，將第二次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行dgge分析，從dgge膠上切下的dna片段為古菌16srdnav3-v4區(qū)dna片段；

(3)以步驟(2)dgge膠上切下的古菌16srdnav3-v4區(qū)dna片段為模板經(jīng)第三次pcr擴(kuò)增，回收第三次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)將步驟(3)的第三次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到t載體上獲得連接產(chǎn)物；

(5)將經(jīng)步驟(4)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主菌，篩選陽(yáng)性重組子；

(6)以陽(yáng)性重組子作為模板進(jìn)行第四次pcr擴(kuò)增；

(7)將步驟(6)第四次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行dgge分析，驗(yàn)證條帶位置，條帶位置正確的dna片段作為煤地質(zhì)微生物古菌物種dnamarker組成中的dna片段a；

(8)重復(fù)步驟(1)至(7)，制備煤地質(zhì)微生物古菌物種dnamarker組成中的dna片段b-h；

(9)步驟(7)和(8)的組合構(gòu)成煤地質(zhì)微生物古菌物種的dnamarker。

優(yōu)選地，本發(fā)明步驟(6)中第四次pcr擴(kuò)增中所使用的模板濃度為16～21ng/μl。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(2)中的從dgge膠上切下的dna片段用30μl去離子水在4℃條件下浸泡過(guò)夜，取浸泡液作為步驟(3)的模板。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(4)中t載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司的載體。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(5)中宿主菌為大腸桿菌dh5α。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(1)中第一次pcr擴(kuò)增和步驟(3)中第三次pcr擴(kuò)增時(shí)用到的引物為0357f/0691r；所述步驟(2)中第二次pcr擴(kuò)增時(shí)用到的引物為0357f-gc/0691r；所述步驟(4)中第四次pcr擴(kuò)增時(shí)用到的引物為0357f-gc/0691r-a和0357f-gc/0691r-g。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述引物0357f/0691r、0357f-gc/0691r、0357f-gc/0691r-a和0357f-gc/0691r-g的序列為：

0357f：ccctacggggcgcagcag；

0357f-gc：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

0691r-a：ggattacaagatttcac；

0691r-g：ggattacaggatttcac。

本發(fā)明用于檢測(cè)煤地質(zhì)微生物古菌物種的dnamarker的應(yīng)用，將物種dnamarker與6×dna上樣緩沖液以體積比5∶1混合，用于煤地質(zhì)微生物pcr-dgge古菌物種的檢測(cè)。

本發(fā)明提到的pcr-dgge檢測(cè)中的dnamarker并非dna片段大小的尺度，而是通過(guò)其物種特異性序列(16srdna的可變區(qū)v3-v4區(qū))來(lái)精準(zhǔn)表征樣品dna所屬的菌屬地位，marker的每條組成條帶都為單一序列，代表特定的菌種，僅限于在變性梯度凝膠電泳中使用。本發(fā)明應(yīng)用于pcr-dgge檢測(cè)中的dnamarker具有條帶銳利、條帶亮度均一、marker組成條帶數(shù)不受限制、種屬特異性等優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明公開(kāi)的dnamarker克隆在了載體上，可以通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌得到大量質(zhì)粒，然后通過(guò)pcr法獲得，生產(chǎn)重復(fù)性高、穩(wěn)定性好。此種marker的使用可以加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，減短實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，尤其是樣品量較大的實(shí)驗(yàn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明使用的以山西沁水盆地高階煤層產(chǎn)出水樣為菌源的不同富集培養(yǎng)方式獲得的培養(yǎng)樣品基因組dna提取結(jié)果0.7％瓊脂糖凝膠電泳圖，

圖中為不同培養(yǎng)方式的前期取樣樣品，m為lambdadna/hindiii；

圖2為本發(fā)明使用高階煤層產(chǎn)出水樣的富集培養(yǎng)液基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增古菌16srdnav3-v4區(qū)的結(jié)果1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖，

圖中m為100bp；

圖3為本發(fā)明使用高階煤層產(chǎn)出水樣富集培養(yǎng)液基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增古菌16srdnav3-v4區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的dgge圖譜，

dgge的電泳條件為預(yù)電泳200v，5min，然后85v，12h，膠濃度為8％，變性范圍為40％-60％，電泳液溫度為60℃，采用的設(shè)備為美國(guó)bio-rad公司生產(chǎn)的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)；

圖4為本發(fā)明篩選陽(yáng)性克隆子菌落pcr結(jié)果1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖，

圖中k1為空白對(duì)照，k2為克隆片段，kl為以藍(lán)斑為模板的陽(yáng)性對(duì)照；

圖5為本發(fā)明篩到的陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒提取結(jié)果0.7％瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖6為本發(fā)明篩選部分dnamarker組成條帶的dgge圖譜，

圖中c、e、f、i、k分別為dnamarker的組成條帶，dgge的電泳條件為預(yù)電泳200v，5min，然后85v，12h，膠濃度為8％，變性范圍為40％-60％，電泳液溫度為60℃，采用的設(shè)備為美國(guó)bio-rad公司生產(chǎn)的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)；

圖7為本發(fā)明制備的煤地質(zhì)微生物pcr-dgge檢測(cè)中古菌物種dnamarker(命名為cbmarc1)的dgge電泳圖譜，以及各序列菌屬相似性比對(duì)結(jié)果，

圖中8個(gè)條帶分別標(biāo)記為a、b、c、d、e、f、g、h。dgge的電泳條件為預(yù)電泳200v，5min，然后85v，12h，膠濃度為8％，變性范圍為40％-60％，電泳液溫度為60℃，采用的設(shè)備為美國(guó)bio-rad公司生產(chǎn)的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)；

圖8為應(yīng)用本發(fā)明制備的古菌物種dnamarker(cbmarc1)對(duì)高階煤層產(chǎn)出水與褐煤的富集培養(yǎng)樣品進(jìn)行檢測(cè)的dgge電泳圖譜，

圖中cbmarc1為本發(fā)明制備的用于檢測(cè)煤地質(zhì)古菌物種的dnamarker，其他泳道樣品為高階煤層產(chǎn)出水與褐煤富集培養(yǎng)不同時(shí)間段的取樣樣品，

dgge的電泳條件為預(yù)電泳200v，5min，然后85v，12h。膠濃度為8％，變性范圍為40％-60％，電泳液溫度為60℃，采用的設(shè)備為美國(guó)bio-rad公司生產(chǎn)的d-codeuniversalmutationdetectionsystem(bio-rad,usa)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.提取不同富集培養(yǎng)方式的前期富集培養(yǎng)液中的基因組dna，選用2套引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

1.1基因組dna提取步驟見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn2016103727233，基因組dna0.7％瓊脂糖凝膠驗(yàn)證圖譜如附圖1所示；

1.2第一次pcr擴(kuò)增，得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒純化回收，-20℃保存?zhèn)溆?，pcr反應(yīng)在ptc-200,bio-rad，usapcr儀上運(yùn)行；

1.2.1pcr反應(yīng)體系：

1.2.2pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34個(gè)循環(huán)，72℃10min，10℃forever，

1.2.3引物序列如下：

0357f：ccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

1.3上述純化回收的dna片段再次進(jìn)行pcr擴(kuò)增，即第二次pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠驗(yàn)證圖譜如附圖2所示。得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫琾cr反應(yīng)在ptc-200,bio-rad，usapcr儀上運(yùn)行；

1.3.1pcr反應(yīng)體系：

1.3.2pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34個(gè)循環(huán)，72℃10min，10℃forever，

1.3.3引物序列如下：

0357f-gc：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

2.dgge分析：

2.1選擇聚丙烯酰胺凝膠膠濃度為8％，膠變性范圍為40％～60％，取40％、60％膠各18ml，分別加入50μl的temed及40μl的10％過(guò)硫酸銨，梯度混合制膠，夏天室溫凝固，冬天可放在37℃培養(yǎng)箱里凝固，若室溫凝固，凝膠時(shí)間至少3h；

2.2待膠凝固完全之后，拔掉梳子，將整個(gè)板子安裝在dgge支架上，將安裝有板子的dgge支架放入電泳槽中，清洗膠孔，接通電源，待電泳液溫度上升至60℃時(shí)，200v預(yù)電泳5min，用50微升微量進(jìn)樣器快速上樣，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為45-50μl，于60℃、85v條件下電泳12h；

2.3電泳完畢后，將膠放入3×gelred染液中染色30min左右，拍照，dgge圖譜如附圖3所示；

2.4將8條特異性目的條帶切下，放入無(wú)菌的ep管中，編號(hào)；

2.5用去離子水洗滌膠條，并將膠條弄碎成小段，加入30μl去離子水浸泡，4℃過(guò)夜；

2.6使用不含gc夾的引物再次進(jìn)行pcr擴(kuò)增，即第三次pcr擴(kuò)增。得到的pcr產(chǎn)物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒純化回收，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2.6.1pcr反應(yīng)體系：

2.6.2pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34個(gè)循環(huán)，72℃10min，10℃forever，

2.6.3引物序列如下：

0357f：ccctacggggcgcagcag；

0691r：ggattacargatttcac；

3.ta克隆轉(zhuǎn)化，上述純化回收的dna片段的ta連接方法按北京全式金生物技術(shù)有限公司的cloningkit進(jìn)行；

3.1克隆反應(yīng)體系：pcr產(chǎn)物：0.5～4μl；cloningvector：1μl。輕輕混合，25℃反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束后，將pcr管置于冰上，將連接產(chǎn)物加入50μl的dh5α剛解凍的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激30s，立即置于冰上2min，加入250μl的lb培養(yǎng)基，200rpm、37℃培養(yǎng)1h。在此期間，取8μl的500mmiptg和40μl的20mg/mlx-gal混合，均勻地涂布在amp⁺抗性的lb固體平板上，使iptg和x-gal充分吸收。4000rpm離心菌液1min，棄掉部分上清，懸浮菌體，涂布在準(zhǔn)備好的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12h左右；

3.1.1使用的lb培養(yǎng)基配方(1l):胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g。使用的感受態(tài)細(xì)胞為dh5α；

3.2使用菌落pcr的方法鑒定陽(yáng)性克隆；

3.2.1挑取白色單克隆菌落于amp⁺抗性的lb固體平板上備份菌種后，放入盛有10μl去離子水的ep管中，沸水浴煮樣5min；

3.2.2取2μl沸水浴煮過(guò)的樣液作模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(以藍(lán)色單克隆菌落為模板)及空白對(duì)照(以去離子水為模板)；

3.2.2.1pcr反應(yīng)體系：

3.2.2.2pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃30s，55℃30s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min，10℃forever，

3.2.2.3引物序列如下：

m13r：caggaaacagctatgacc

m13f：tgtaaaacgacggccagt

3.2.3pcr產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠驗(yàn)證大小，片段大小在500-600bp之間的克隆子視為陽(yáng)性克隆，pcr產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠驗(yàn)證圖譜如附圖4所示。

4.提取陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒，每個(gè)克隆片段選3個(gè)陽(yáng)性克隆子的質(zhì)粒送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至ncbi，在線比對(duì)確定序列的菌屬地位；

4.1挑取確定的陽(yáng)性克隆接種于5ml的lb液體培養(yǎng)基(接種前加入5μl50mg/ml的amp)中，37℃，200rmp培養(yǎng)12～14h，用生工的sanprep柱式質(zhì)粒dna小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，溶于50μl的去離子水中，-20℃保存?zhèn)溆茫渲?，提取質(zhì)粒的0.7％瓊脂糖凝膠驗(yàn)證圖譜如附圖5所示；

4.1.1使用的lb液體培養(yǎng)基配方(1l):胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，酵母提取物5g。

4.2每個(gè)克隆片段選取3個(gè)陽(yáng)性克隆子的質(zhì)粒送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序；

4.3測(cè)序結(jié)果提交至ncbi，在線比對(duì)確定序列的菌屬地位；

5.再次進(jìn)行dgge分析，驗(yàn)證條帶在dgge膠片上的位置；

5.1酶標(biāo)儀測(cè)提取質(zhì)粒的濃度，用去離子水稀釋質(zhì)粒濃度至20ng/μl左右，以稀釋質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，即第四次pcr擴(kuò)增；

5.1.1pcr反應(yīng)體系：

5.1.2pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，34個(gè)循環(huán)，72℃10min，10℃forever，

5.1.3引物序列如下：

0357f-gc：cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggccctacggggcgcagcag；

0691r-a：ggattacaagatttcac；

0691r-g：ggattacaggatttcac。

5.2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用于dgge上樣分析，dgge電泳過(guò)程參照具體實(shí)施方案1中2.1、2.2、2.3進(jìn)行，dgge圖譜上條帶電泳行為與模板條帶電泳行為一致者則選作dnamarker的組成條帶，驗(yàn)證的dgge圖譜如附圖6所示。

6.制作煤地質(zhì)微生物pcr-dgge檢測(cè)中古菌物種的dnamarker；

6.1以質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，各質(zhì)粒模板量控制在16-21ng/μl范圍內(nèi)，擴(kuò)增體系、條件、所用引物參照具體實(shí)施方案1中步驟5.1.1、5.1.2、5.1.3。

6.2取各質(zhì)粒的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物20μl進(jìn)行等體積混合，混合后的pcr產(chǎn)物于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行濃縮，待pcr產(chǎn)物體積濃縮至30μl左右與6×dnaloadingbuffer以體積比5：1混合均勻，即獲得dnamarker，制備好的dnamarker用于dgge上樣分析，dgge電泳過(guò)程參照具體實(shí)施方案1中的步驟2.1、2.2、2.3，dgge圖譜如附圖7所示；

7.結(jié)合每條dnamarker條帶所代表的菌屬地位，對(duì)制備的pcr-dgge檢測(cè)中dnamarker進(jìn)行命名，本發(fā)明專(zhuān)利制備的dnamarker命名為cbmarc1。

實(shí)施例2

1.提取山西沁水盆地高階煤層產(chǎn)出水樣與云南昭通褐煤的前中期富集培養(yǎng)液中的基因組dna，選用2套引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，基因組提取及pcr擴(kuò)增參照具體實(shí)施方案1中的1.1、1.2、1.3。

2.dgge分析：

2.1選擇聚丙烯酰胺凝膠膠濃度為8％，膠變性范圍為40％～60％，取40％、60％膠各18ml，分別加入50μl的temed及40μl的10％過(guò)硫酸銨，梯度混合制膠，夏天室溫凝固，冬天可放在37℃培養(yǎng)箱里凝固，若室溫凝固，凝膠時(shí)間至少3h；

2.2待膠凝固完全之后，拔掉梳子，將整個(gè)板子安裝在dgge支架上，將安裝有板子的dgge支架放入電泳槽中，清洗膠孔，接通電源，待電泳液溫度上升至60℃時(shí)，200v預(yù)電泳5min，用50微升微量進(jìn)樣器快速上樣，上樣樣品為后期產(chǎn)出水富集培養(yǎng)樣的古菌v3-v4區(qū)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物及具體實(shí)施方案1中制備的古菌dnamarker。產(chǎn)出水富集培養(yǎng)樣的古菌v3-v4區(qū)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為45-50μl，古菌dnamarker上樣量為30μl。于60℃、85v條件下電泳12h；

2.3電泳完畢后，將膠放入3×gelred染液中染色30min左右，拍照，dgge圖譜如附圖8所示；

2.4結(jié)果分析：如附圖8中所示，本專(zhuān)利發(fā)明制備的dnamarker部分組成條帶與樣品所含的部分條帶一一對(duì)應(yīng)，初步認(rèn)為樣品中與marker對(duì)應(yīng)的條帶為marker組成條帶相對(duì)應(yīng)的菌屬。即山西沁水盆地高階煤層產(chǎn)出水樣與云南昭通褐煤的前中期富集培養(yǎng)樣液中古菌的菌群結(jié)構(gòu)包含本專(zhuān)利發(fā)明制備marker所對(duì)應(yīng)的部分菌屬。

3.樣品條帶序列分析：

3.1將富集培養(yǎng)樣品中與制備的古菌dnamarker位于同一位置的條帶切下，放入無(wú)菌的ep管中，編號(hào)；

3.2用去離子水洗滌膠條，并將膠條弄碎成小段，加入30μl去離子水浸泡，4℃過(guò)夜；

3.3使用不含gc夾的引物再次進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系、條件及引物參照具體實(shí)施方案1中的2.6.1、2.6.2及2.6.3。得到的pcr產(chǎn)物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒純化回收，回收的dna片段送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序；

3.4測(cè)序結(jié)果提交至ncbi，在線比對(duì)確定序列的菌屬地位，經(jīng)比對(duì)分析與marker位于同一位置的條帶所屬菌屬地位與對(duì)應(yīng)的marker相同，且菌屬相似性均大于97％。證明了山西沁水盆地高階煤層產(chǎn)出水樣與云南昭通褐煤的前中期富集培養(yǎng)樣液中古菌的菌群結(jié)構(gòu)包含了本專(zhuān)利發(fā)明制備marker所對(duì)應(yīng)的部分菌屬。即富集培養(yǎng)的前期樣品中主要優(yōu)勢(shì)古菌菌屬為methanocelleus。在富集培養(yǎng)的中期，主要優(yōu)勢(shì)古菌菌屬為methanosarina與methanocelleus。

sequencelisting

<110>山西大學(xué)

<120>用于檢測(cè)煤地質(zhì)微生物古菌物種的dnamarker及制備方法和應(yīng)用

<130>.

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>327

<212>dna

<213>methanobacterium

<400>1

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<210>2

<211>327

<212>dna

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<400>2

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<211>327

<212>dna

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<400>3

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<210>4

<211>327

<212>dna

<213>methanosarcina

<400>4

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<210>5

<211>323

<212>dna

<213>methanocelleus

<400>5

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<210>6

<211>323

<212>dna

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<400>6

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<210>7

<211>346

<212>dna

<213>methanomethylovorans

<400>7

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<210>8

<211>327

<212>dna

<213>methanosarcina

<400>8

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