本發(fā)明涉及分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系，還涉及所述雜交瘤細(xì)胞系及其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10在口蹄疫診斷或防治中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)屬于小rna病毒科口蹄疫病毒屬的成員，其基因組為單股正鏈rna，基因組rna全長約8.5kb?？谔阋?foot-and-mouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒(fmdv)引起的，嚴(yán)重危害牛、豬、羊等多種偶蹄動(dòng)物的高度接觸性傳染病，能夠引起幼畜死亡、產(chǎn)奶量下降、肉食減少、肉品下降、動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低等，而且該病具有極強(qiáng)的傳染性，可形成大范圍流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防和控制口蹄疫的關(guān)鍵是高效疫苗和準(zhǔn)確的診斷方法的應(yīng)用。

口蹄疫病毒有七個(gè)血清型，分別為o、a、c、sat1、sat2、sat3和asial，各血清型之間無交叉免疫保護(hù)。目前，中國主要流行o型、a型和asial型fmd。口蹄疫病毒的抗原結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株的抗原位點(diǎn)和抗原表位都不盡相同，存在廣泛的抗原變異。因此，開發(fā)新的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體，將對于口蹄疫的有效防控具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一株分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系以及其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是將上述分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系及其分泌的單克隆抗體10b10應(yīng)用于口蹄疫的診斷或防治。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開了一株分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系。

本發(fā)明用滅活并純化的a型口蹄疫毒株a/jlys/cha/2014免疫balb/c鼠，將免疫小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞?？贵w陽性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為10b10、3c7和4g2。間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，單抗10b10與a、o、asia1型毒株均呈陽性反應(yīng)，表明10b10為fmdv血清型共享性單抗；而單抗3c7和4g2僅與o型毒株均呈陽性反應(yīng)，為o型毒株特異性單抗。

本發(fā)明將分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系10b10提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：cgmccno.13841；分類命名為：分泌fmdv共享型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間是2017年4月24日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了由雜交瘤細(xì)胞系10b10分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10。免疫球蛋白亞類鑒定顯示，單抗10b10重鏈類型為igg2a，輕鏈為κ類型；雜交瘤細(xì)胞上清和腹水的elisa抗體效價(jià)分別為1:1024和1:10⁵。微量細(xì)胞中和試驗(yàn)表明，單抗10b10無中和活性。相對親和力測定結(jié)果表明，單克隆抗體10b10具有高強(qiáng)度的親和力，其相對親和力指數(shù)為5.5mol/l。單克隆抗體10b10識別的fmdvvp2蛋白的抗原表位是⁸tlledrilt¹⁶。

本實(shí)驗(yàn)室之前篩選獲得了一株血清型共享性fmdv單抗4b2，其重鏈類型為igg1，輕鏈為κ類型；所針對的抗原表位是²kkteettlledr¹³。單抗4b2的相對親和力指數(shù)為2.5mol/l，顯示單抗4b2具有中等強(qiáng)度的親和力。親和力的強(qiáng)弱，是一株單抗在某種檢測方法中應(yīng)用效果的重要指標(biāo)。本發(fā)明篩選出的各血清型共享型fmdv單抗10b10，其親和力指數(shù)明顯高于單抗4b2。因此，與單抗4b2相比，高親和力單抗10b10在建立病毒抗原診斷及其抗體檢測方法中具有更大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

本發(fā)明在泛口蹄疫病毒抗原檢測方法中，應(yīng)用單抗10b10為檢測單抗時(shí)的使用濃度為0.87μg/ml，而應(yīng)用單抗4b2為檢測單抗時(shí)的使用濃度為1.54μg/ml?？梢姡褂脝慰?0b10不但可以節(jié)約一半的成本，而且預(yù)示著也能在一定程度上提高方法的敏感性。本發(fā)明檢測fmdv的敏感性試驗(yàn)也證實(shí)，單抗10b10檢測a型和o型fmdv的敏感性比單抗4b2要高3倍左右。上述分析結(jié)果表明，本發(fā)明所述的單抗10b10是完全不同于4b2的一株新的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體，而且比單抗4b2具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明所述的分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系或其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10能夠應(yīng)用于制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑或藥物。其中，所述口蹄疫包括由o型、a型或asia1型口蹄疫病毒引起的口蹄疫中的任意一種或多種。

本發(fā)明還公開了所述分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系或其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10在制備口蹄疫病毒抗原或抗體檢測的試劑中的應(yīng)用。其中，所述口蹄疫病毒包括：o型、a型或asia1型口蹄疫病毒中的任意一種或多種。

本發(fā)明將牛多抗作為捕獲抗體、純化的單抗10b10標(biāo)記hrp后作為檢測抗體，分析了10b10作為檢測抗體在口蹄疫病毒抗原檢測中的應(yīng)用效果。結(jié)果表明，單抗10b10可用于fmdv抗原的特異性檢測，對a型fmdv細(xì)胞毒的最低檢出量為1.05×10⁴tcid50，對o型fmdv細(xì)胞毒的最低檢出量為5.9×10³tcid50。為檢驗(yàn)單抗10b10在口蹄疫病毒抗體檢測中的應(yīng)用效果，本發(fā)明同時(shí)使用兩株fmdv血清型共享的單抗3d9和10b10，以3d9作為包被抗體、hrp標(biāo)記的10b10作為檢測抗體建立固相競爭elisa方法，分別檢測系列稀釋的a、o和asia1型fmdv的陰性和陽性血清，計(jì)算反應(yīng)的抑制百分率。結(jié)果表明，用單抗10b10建立的固相競爭elisa方法能夠特異性區(qū)分三種血清型fmdv的陰性和陽性血清。以上結(jié)果證明，本發(fā)明所述的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10及分泌10b10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，能夠應(yīng)用于fmdv病原診斷及抗體檢測。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種用于口蹄疫病毒抗原檢測的抗原捕獲elisa試劑盒，包括：包被捕獲抗體的固相載體、檢測抗體、口蹄疫病毒陰性對照抗原、口蹄疫病毒陽性對照抗原、封閉液、洗滌液、底物溶液和終止液。其中，所述檢測抗體為辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10，其最佳使用濃度為0.87μg/ml；所述捕獲抗體為牛抗fmdv多抗，其最佳包被濃度為2.9μg/ml。所述洗滌液為0.05％tween-20pbs(pbst)溶液；所述封閉液為5％脫脂乳pbst溶液；所述底物溶液為tmb底物溶液；所述終止液為2mh2so4。所述口蹄疫病毒包括：o型、a型或asia1型口蹄疫病毒。

本發(fā)明還公開了一種用于口蹄疫病毒抗體檢測的固相競爭elisa試劑盒，包括：包被包被抗體的固相載體、檢測抗體、口蹄疫病毒抗原、洗滌液、底物溶液和終止液。其中，所述檢測抗體為辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10，所述包被抗體為fmdv血清型共享的單抗3d9。所述洗滌液為ph7.4的pbst溶液；所述底物溶液為tmb底物溶液；所述終止液為2mh2so4。所述口蹄疫病毒包括：o型、a型或asia1型口蹄疫病毒。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明篩選獲得一株fmdv共享型單克隆抗體10b10。間接免疫熒光檢測結(jié)果表明，單抗10b10與o型、a型和asia1型口蹄疫病毒均呈特異性反應(yīng)。單抗10b10具有高強(qiáng)度的親和力，其相對親和力指數(shù)為5.5mol/l，明顯高于另一株血清型共享型fmdv單抗4b2。本發(fā)明所述高親和力的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10及分泌單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系，在泛口蹄疫病毒抗原及其抗體的檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為ifa檢測單抗10b10與a型、o型、asia1型fmdv毒株的反應(yīng)；其中，positivecontrol為陽性對照，cellcontrol為bhk細(xì)胞對照；

圖2為單抗4b2和10b10的相對親和力測定；

圖3為用固相競爭elisa檢測a、o和asia1型fmdv的強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性血清的抑制百分率變化曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1fmdv各血清型毒株共享單克隆抗體的篩選和鑒定

1、材料和方法

1.1病毒、細(xì)胞、菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用于ifa進(jìn)行單抗特異性分析的毒株包括：afmdva/kt/58(genbankaccessionnumber:aj131665)，a/jlys/cha/2014(aj131665)，a/xjbc/cha/2010，asia1fmdvasia1/ys/cha/05(gu931682)，o/ys/cha/05(hm008917)，ofmdvo/tibet/cha/99(aj539138)，o/gd/86(aj131468)(wangh,zhaol,liw,zhoug,yul(2011)identificationofaconformationalepitopeonthevp1g-hloopoftypeasia1foot-and-mouthdiseasevirusdefinedbyaprotectivemonoclonalantibody.veterinarymicrobiology148:189-199.)；乳倉鼠腎細(xì)胞bhk-21、sp2/0骨髓瘤細(xì)胞為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存；清潔級雌性balb/c小鼠購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。mab3d9和mab4b2由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。a型、o和asia1型fmdv的高免牛血清及其離子交換層析純化抗體，由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

融合劑peg/dmso(mw,1450)、hat鹽(50x)、ht鹽(50x)、hrp或fitc標(biāo)記的羊抗鼠igg、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自sigma公司；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自southernbiotech公司；l-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸購自amresco公司；二甲基亞砜(dmso)、鄰苯二胺(opd)、peg6000購自solarbio公司；高糖dmem干粉購自gibco公司；進(jìn)口優(yōu)級胎牛血清(paa)購自西班牙nalgene公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自加拿大jetbiochemical公司。

1.3鼠免疫與單克隆抗體的制備

(1)將a型fmdv(a/jlys/cha/2014)接種于bhk-21細(xì)胞單層，待75％以上細(xì)胞出現(xiàn)病變后收毒。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融三次，裂解細(xì)胞釋放病毒。凍融后的病毒液加入1∶1000tritonx-100和4∶10000甲醛裂解與滅活48h以上，取滅活過的病毒液1ml接種bhk-21細(xì)胞盲傳三代、檢測滅活是否徹底。將經(jīng)凍融裂解后的培養(yǎng)液9000rpm(beckman高速離心機(jī)，ja-10轉(zhuǎn)子)、4℃離心90min，回收病毒液上清，棄去細(xì)胞沉淀；按病毒液上清的體積加入80g/l的peg6000和40g/l的nacl，室溫?cái)嚢?h至完全溶解，4℃過夜沉淀；次日將上清9000rpm、4℃離心90min，棄上清回收沉淀；用net緩沖液于低溫下將沉淀輕輕重懸，29000rpm、4℃離心2h，在冰盒中用適量的net緩沖液輕輕重懸沉淀；制備15％～45％均勻線性蔗糖梯度，對病毒濃縮液進(jìn)行蔗糖密度梯度超速離心，利用用紫外分光光度計(jì)檢測od259值，根據(jù)公式計(jì)算146s抗原的含量。

(2)純化的a型fmdv抗原(100μg/200ul)加等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行充分的乳化，背部皮下注射6周齡雌性balb/c小鼠；2周后進(jìn)行第2次免疫，佐劑改為弗氏不完全佐劑；2周后，以不加佐劑的等量抗原進(jìn)行第3次免疫。為刺激小鼠快速產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，于融合前3d采用尾靜脈和脾臟注射相結(jié)合的免疫方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用二倍劑量的抗原。

(3)細(xì)胞融合

a)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前一天進(jìn)行飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備，眼科剪刀、眼科鑷子、平皿等試驗(yàn)用具用前高溫干熱滅菌，hat完全培養(yǎng)液做無菌檢驗(yàn)。取2只balb/c小鼠摘除眼球放血，按常規(guī)方法分離陰性血清。拉頸脫臼處死小鼠，將其浸泡于75％酒精中，10min后移入超凈工作臺。將小鼠腹部向上固定在鼠架上，用鑷子提起腹正中部皮膚，眼科剪刀橫向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和鑷子上下撕開皮膚，充分暴露腹膜。用鑷子輕輕提起腹膜，將10ml注射器內(nèi)吸取的8-10mlhat完全培養(yǎng)液注入腹腔，切勿刺破臟器和腸道，注射器不要拔出，在腹腔內(nèi)來回抽吸5-10次，然后用鑷子按摩兩側(cè)腹部30秒左右，再進(jìn)行抽吸，重復(fù)以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔內(nèi)液體。注意避開腸系膜及脂肪組織，以免堵塞針頭。將從2只鼠中取出的腹腔細(xì)胞加入55mlhat培養(yǎng)液中，吹散混勻細(xì)胞，以100μl/孔分裝于6塊96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

b)骨髓瘤細(xì)胞的制備：融合前36-48h，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期。融合當(dāng)天，用15mldmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞從瓶壁上吹下，收集于50ml離心管,1000rpm離心10min。將細(xì)胞沉淀重懸置20mldmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取少量骨髓瘤細(xì)胞懸液，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，備用。

c)免疫脾細(xì)胞的制備：融合前摘除小鼠眼球采血，制備陽性血清。將小鼠拉頸脫臼致死，浸泡于75％酒精中，10min后放于超凈臺。無菌打開腹腔，分離結(jié)締組織并取出脾臟，將脾臟放入裝有滅菌尼龍網(wǎng)和盛有15mldmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，用滅菌玻璃注射器內(nèi)芯研磨脾臟，使脾細(xì)胞全部通過網(wǎng)孔進(jìn)入平皿中。將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液大約至30ml，混勻，1000rpm離心8min，棄上清。將細(xì)胞沉淀懸于10mldmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取細(xì)胞懸液，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，備用。

d)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合：取65mlhat培養(yǎng)液，15ml基礎(chǔ)dmem培養(yǎng)液和1ml50％peg于37℃水浴中預(yù)熱，另備200ml燒杯盛有37℃的水。按5份脾細(xì)胞數(shù)加1份骨髓瘤細(xì)胞數(shù)取相應(yīng)細(xì)胞懸液量，加入50ml玻璃離心管中，補(bǔ)加dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液至30ml，混勻。1000rpm離心10min，棄上清，盡可能倒干。用手掌輕擊離心管底部，使沉淀細(xì)胞松散均勻呈糊狀。將離心管放入盛有37℃水的200ml燒杯中，一手均勻轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，另一手用1ml巴氏吸管吸取37℃50％peg溶液1ml，1min內(nèi)加完，靜置2min。隨后先慢后快地加入dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止反應(yīng)，37℃水浴靜置10min。1000rpm離心10min，棄上清，加入65mlhat培養(yǎng)基，輕輕地吹散細(xì)胞，每孔0.1ml接種于已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的6塊96孔培養(yǎng)板，置37℃、5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后半量換液，8d后全換液，待克隆長至孔底面積1/4-1/3時(shí)取上清進(jìn)行檢測并換ht培養(yǎng)液。

1.4抗體檢測elisa

用提純的病毒抗原包被96孔板，加入100ul雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫育1h后洗滌，加入1:5000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗，洗滌后加入底物tmb避光顯色10min，于波長450nm測定吸光值。

1.5間接免疫熒光

96孔板微孔板培養(yǎng)bhk-21細(xì)胞至單層，接種口蹄疫病毒4×10³tcid50/孔，出現(xiàn)cpe之前用冷無水乙醇進(jìn)行固定，加入50ul雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫育40min后pbs洗滌三次，加入1:200稀釋的fitc標(biāo)記羊抗鼠igg抗體，37℃溫育40min，洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

1.6單克隆抗體的純化

采用辛酸-飽和硫酸銨法對制備的腹水進(jìn)行純化，操作步驟簡述如下：

(1)取3ml預(yù)處理過的腹水加6ml醋酸緩沖液(0.06mol，ph4.8)；腹水中加99ul辛酸室溫?cái)嚢?0分鐘，4℃靜置2小時(shí)以上；取出11000rpm離心30分鐘，棄沉淀；上清用2mol/lnaoh調(diào)ph至7.4；

(2)在4℃條件下加入飽和硫酸銨至50％飽和度，冰浴攪拌作用30分鐘，4℃靜置2小時(shí)以上；11000rpm離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于5mlpbs(0.1m，ph7.4)中；

(3)向沉淀懸浮物中邊攪拌邊加適量飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液中濃度為30％-40％，冰浴攪拌作用30分鐘，4℃靜止2小時(shí)以上；11000rpm離心30分鐘，取沉淀，將沉淀融入2mlpbs中；

(4)將沉淀懸浮液裝入透析帶中，在4℃用pbs透析，2小時(shí)換液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的純化腹水，紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度，用sds-page進(jìn)行純度檢測。

再用deae-sephadexa-50(ge公司)柱層析進(jìn)一步純化單克隆抗體，回收純化后的單克隆抗體，紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度，用sds-page進(jìn)行純度檢測。

1.7單克隆抗體相對親和力測定

采用硫氰酸鹽洗脫法對單克隆抗體的相對親和力進(jìn)行測定，操作步驟如下：

(1)用已經(jīng)確定的最佳抗原濃度包被elisa板，每孔100μl，4℃過夜包被。

(2)pbst洗滌、脫脂乳封閉同間接elisa。洗滌后加入飽和濃度的待測單抗，每孔100μl，37℃孵育1h。

(3)洗滌后進(jìn)行硫氰酸鹽洗脫處理，每孔加入nascn溶液60μl，濃度依次為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5mol/l，室溫靜置15min，pbst洗滌4次。

(4)洗滌后加入1:5000稀釋的hrp標(biāo)記羊抗鼠二抗，tmb顯色后用酶標(biāo)儀測定od450值。

(5)結(jié)果判定：經(jīng)硫氰酸鹽洗脫后每種抗體與抗原結(jié)合的od450值下降至未經(jīng)洗脫時(shí)od450值的50％所對應(yīng)的nascn濃度，即為該抗體的相對親和力指數(shù)，以mol/l表示。

1.8抗原捕獲elisa方法的建立

1)用ph9.6的碳酸鹽緩沖液包被牛多抗，4℃過夜。用0.05％tween-20pbs(pbst)洗板3次，每次3min；2)用5％脫脂乳pbst封閉酶標(biāo)板，37℃1h，同上洗板；3)加待檢抗原和陰陽性對照抗原，37℃1h，洗滌方法同上；4)加入hrp標(biāo)記的檢測單抗，37℃1h，洗滌方法同上；5)加入底物，室溫避光作用10min；6)加2mh2so4(50μl/孔)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm處測量吸光度a值(od450nm)。

1.9固相競爭elisa實(shí)驗(yàn)步驟

1)用ph9.6的碳酸鹽緩沖液按使用濃度稀釋包被單抗3d9于elisa板，50μl/孔，4℃過夜。次日取出elisa板，棄去液體，用ph7.4pbst洗板5次，甩干；2)用pbst稀釋口蹄疫病毒抗原至使用濃度，50μl/孔，37℃溫育1h，同上洗板5次；3)陰性血清，陽性血清自1:8～1:512倍比稀釋，50μl/孔，加入elisa板中；4)在elisa板中立即加入用檢測抗體稀釋液稀釋的hrp-10b10，50μl/孔，充分搖振混勻，37℃溫育1h。此時(shí)，elisa板中的反應(yīng)體系為100μl；5)同上洗板5次，加入底物溶液tmb，50μl/孔，室溫避光15min。15min后，加入2mh2so4終止液，50μl/孔，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取od450nm值。結(jié)果判定：通過檢測已知陰性和陽性血清，計(jì)算抑制百分率(percentageinhibition,pi)。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1一株fmdv各血清型毒株共享單克隆抗體的篩選和鑒定

免疫小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞，用間接elisa和ifa方法驗(yàn)證其培養(yǎng)上清中的fmdv特異性抗體，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對fmdv抗原的od450光吸收值與正常balb/c小鼠血清、sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清對fmdv抗原od450值之比均大于2.1，且雜交瘤細(xì)胞上清與正常bhk-21細(xì)胞不產(chǎn)生熒光反應(yīng)，判為陽性?？贵w陽性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為10b10、3c7和4g2。免疫球蛋白亞類鑒定顯示，單抗10b10重鏈類型為igg2a，輕鏈為κ類型。單抗3c7重鏈類型為igg2a，輕鏈為κ類型。單抗4g2重鏈類型為igg2b，輕鏈為κ類型。微量細(xì)胞中和試驗(yàn)表明，10b10、3c7和4g2均無中和活性。

將單抗10b10培養(yǎng)上清分別與感染a、o和asia1型fmdv的bhk-21細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(圖1)，結(jié)果顯示，10b10與a、o、asia1型毒株均呈陽性反應(yīng)，表明10b10為fmdv血清型共享性單抗。而單抗3c7和4g2僅與o型毒株均呈陽性反應(yīng)，為o型毒株特異性單抗。

本發(fā)明將能穩(wěn)定分泌fmdv血清型共享性單抗10b10的雜交瘤細(xì)胞系10b10提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為：cgmccno.13841。

2.2單克隆抗體腹水的純化及標(biāo)記

鑒于單抗10b10的血清型共享性，本發(fā)明進(jìn)一步研究單抗10b10在口蹄疫病毒抗原和抗體檢測中的診斷價(jià)值。將本發(fā)明制備的單抗10b10腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法純化，紫外分光光度計(jì)測定10b10的濃度為6.51mg/ml?？贵w10b10再經(jīng)deae-sephadexa-50離子交換層析進(jìn)一步純化，用改良過碘酸鈉法標(biāo)記hrp。

2.3單抗10b10與單抗4b2的親和力比較

采用硫氰酸鹽(nascn)洗脫法對單克隆抗體的相對親和力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。分別用0mol/l、0.5mol/l、1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l、3.0mol/l、3.5mol/l、4.0mol/l等不同濃度的nascn對2株單抗進(jìn)行洗脫，經(jīng)測定，單抗4b2和10b10的相對親和力指數(shù)分別為2.5mol/l和5.5mol/l，顯示單抗4b2具有中等強(qiáng)度的親和力、而單抗10b10具有高強(qiáng)度的親和力。親和力的強(qiáng)弱，是一株單抗在某種檢測方法中應(yīng)用效果的重要指標(biāo)。本發(fā)明篩選出的各血清型共享型fmdv單抗10b10，其親和力指數(shù)(5.5mol/l)明顯高于本實(shí)驗(yàn)室之前篩選的一株血清型共享型fmdv單抗4b2(2.5mol/l)，因此可以預(yù)見，高親和力單抗10b10在建立病毒抗原及其抗體檢測方法中具有明顯的優(yōu)勢，比4b2具有更大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。

2.4泛口蹄疫病毒抗原檢測方法的初步建立

2.4.1包被多抗和檢測單抗使用濃度的確定

對包被多抗和檢測單抗10b10與4b2的使用濃度進(jìn)行方正滴定，結(jié)果如表1和表2所示。當(dāng)捕獲?？筬mdv多抗1:800稀釋(2.9μg/ml)、hrp標(biāo)記檢測單抗10b10為1：2000稀釋(0.87μg/ml)時(shí)，p/n比值最大；當(dāng)捕獲?？筬mdv多抗1:800稀釋(2.9μg/ml)、hrp標(biāo)記檢測單抗4b2為1：1000稀釋(1.54μg/ml)時(shí)，p/n比值最大。可見，在泛口蹄疫病毒抗原檢測方法中，應(yīng)用單抗10b10時(shí)的使用濃度為0.87μg/ml，而應(yīng)用單抗4b2時(shí)的使用濃度為1.54μg/ml，這樣使用單抗10b10不但可以節(jié)約大概一半的成本、而且預(yù)示著也能在一定程度上提高方法的敏感性。

表1多抗最佳包被濃度及檢測單抗10b10最佳使用濃度的方陣滴定結(jié)果

表2多抗最佳包被濃度及檢測單抗4b2最佳使用濃度的方陣滴定結(jié)果

2.4.2敏感性試驗(yàn)

將a型fmdv細(xì)胞毒(tcid50＝10^6.5)和o型fmdv細(xì)胞毒(tcid50＝10^6.25)梯度稀釋，進(jìn)行elisa檢測。結(jié)果如表3和表4所示。當(dāng)用hrp標(biāo)記的10b10作為檢測單抗時(shí)，該方法對a型fmdv細(xì)胞毒的最低檢出量為1.05×10⁴tcid50、對o型fmdv細(xì)胞毒的最低檢出量為5.9×10³tcid50；當(dāng)用hrp標(biāo)記的4b2作為檢測單抗時(shí)，該方法對a型fmdv細(xì)胞毒的最低檢出量為3.16×10⁴tcid50、對o型fmdv細(xì)胞毒的最低檢出量為1.78×10⁴tcid50。結(jié)果表明，用單抗10b10檢測a型和o型fmdv的敏感性比單抗4b2要高3倍左右。

表310b10作為檢測單抗的敏感性測定結(jié)果

表44b2作為檢測單抗的敏感性測定結(jié)果

2.5檢測泛fmdv抗體的固相競爭elisa方法的初步建立

為檢驗(yàn)單抗10b10及其雜交瘤細(xì)胞系在口蹄疫病毒抗體檢測方法中的應(yīng)用價(jià)值，參照oie標(biāo)準(zhǔn)方法建立固相競爭elisa方法用于檢測泛fmdv抗體，分別檢測系列稀釋的a、o和asia1的陰性血清和陽性血清，并計(jì)算抑制百分率。結(jié)果如圖3所示，應(yīng)用該固相競爭elisa方法檢測fmdva、o和asia1的強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性血清，其抑制百分率曲線的形狀典型，能夠特異性區(qū)分三種血清型fmdv的陽性血清與陰性血清。

2.6單抗10b10與單抗4b2的差異性總結(jié)

本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室已有一株針對口蹄疫病毒vp2蛋白上的血清型共享性單抗4b2，其所針對的抗原表位(²kkteettlledr¹³)也已被本實(shí)驗(yàn)室所鑒定；而本發(fā)明中單抗10b10識別的fmdvvp2蛋白的抗原表位是⁸tlledrilt¹⁶。單抗10b10重鏈類型為igg2a，輕鏈為κ類型；而單抗4b2重鏈類型為igg1，輕鏈為κ類型。進(jìn)一步的比較分析結(jié)果表明，單抗4b2具有中等強(qiáng)度的親和力，其相對親和力指數(shù)分2.5mol/l；而單抗10b10具有高強(qiáng)度的親和力，其相對親和力指數(shù)為5.5mol/l。高強(qiáng)度親和力的單抗在建立病毒抗原診斷及其抗體檢測方法中具有更大的應(yīng)用價(jià)值和潛力，這在本發(fā)明檢測fmdv的敏感性試驗(yàn)中也得到了證實(shí)：將a型和o型fmdv梯度稀釋，分別用單抗10b10和4b2進(jìn)行elisa檢測，結(jié)果表明，單抗10b10檢測a型和o型fmdv的敏感性比單抗4b2要高3倍左右。上述比較分析結(jié)果均表明，本發(fā)明中的單抗10b10是完全不同于4b2的一株新的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體，而且比4b2具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，單抗10b10在建立泛口蹄疫病毒抗原及其抗體檢測方法中具有應(yīng)用價(jià)值。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

<120>分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系及其應(yīng)用

<130>hlj-2001-170417a

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