本發(fā)明涉及一種熒光化學(xué)傳感材料的制備方法及應(yīng)用，主要研究一種基于香豆素衍生物的熒光傳感材料的制備方法和用途，屬于化學(xué)熒光傳感材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

食品安全一直是當(dāng)今社會(huì)的一個(gè)熱門話題，食品安全的檢測(cè)也引起了科學(xué)家的關(guān)注，并且已經(jīng)成為食品科學(xué)研究中的重要領(lǐng)域。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平日益提高，對(duì)飲食的要求也越來(lái)越高，為了延長(zhǎng)食品和飲料的保質(zhì)期，防腐劑和添加劑被廣泛地加入到食品和飲料中，過(guò)量的防腐劑和添加劑會(huì)對(duì)人體造成傷害，引起疾病。

二氧化硫是一種危險(xiǎn)的環(huán)境污染物，是煤和含硫化石燃料燃燒的必然產(chǎn)物。在中性溶液中或在通過(guò)呼吸系統(tǒng)吸入體內(nèi)后，二氧化硫可以容易地與水合成亞硫酸鹽。在食品和飲料工業(yè)中，亞硫酸鹽被廣泛用于抑制新鮮的水果、蔬菜降解和飲料變質(zhì)，并由于其具有抗菌、抑菌和抗氧化能力，所以它可以作為一般食品防腐劑以延長(zhǎng)食品和飲料的保質(zhì)期。流行病學(xué)研究表明，亞硫酸鹽與心血管疾病如局部缺血性心臟病、心肌缺血、自發(fā)性高血壓和低氧性肺動(dòng)脈高壓相關(guān)。另外，過(guò)量的亞硫酸鹽可能造成一些人哮喘和過(guò)敏反應(yīng)。因此，從事于食品添加劑的糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家委員會(huì)已經(jīng)發(fā)布，可接受的每日攝入量應(yīng)<0.7mg/kg體重。

為了減少和避免過(guò)量亞硫酸鹽對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類的危害，有效的監(jiān)測(cè)分析是必不可少的，因此開發(fā)一種快速、便捷、靈敏有效的檢測(cè)技術(shù)成為了一項(xiàng)新的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如電化學(xué)法，色譜法，流動(dòng)注射分析以及滴定法通常需要麻煩的預(yù)處理并且耗時(shí)，這限制了其應(yīng)用。用于檢測(cè)亞硫酸鹽的熒光探針由于其便利性，高靈敏度，快速響應(yīng)和活細(xì)胞中的生物成像而引起研究人員的興趣。特別地，乙酰丙酸酯保護(hù)的羥基可用于通過(guò)乙酰丙酸裂解檢測(cè)亞硫酸鹽。它顯示出高靈敏度和選擇性。然而，這些探針的缺點(diǎn)在于不滿意的檢測(cè)限和水溶性差。香豆素作為最優(yōu)秀的熒光團(tuán)之一，被發(fā)現(xiàn)具有良好的水溶性，優(yōu)異的功能，擴(kuò)展的光譜范圍和完美的光化學(xué)性質(zhì)，包括高熒光量子產(chǎn)率。

因此，本發(fā)明制備了基于香豆素衍生物和乙酰丙酸的新型熒光響應(yīng)型傳感材料。其合成用于選擇性檢測(cè)亞硫酸鹽，具有快速響應(yīng)的能力。該熒光傳感材料的水溶性和生物相容性良好，可以實(shí)現(xiàn)在水溶液介質(zhì)中對(duì)目標(biāo)離子進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用，也為生物細(xì)胞中目標(biāo)離子的成像分析提供了前提。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的限制，目的在于提供一種基于香豆素衍生物的熒光傳感材料及其制備方法和用途，本發(fā)明涉及的傳感材料能夠很好的實(shí)現(xiàn)生物細(xì)胞中痕量so3^2-離子的有效檢測(cè)，具有成本低，合成簡(jiǎn)單，響應(yīng)快和檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種基于香豆素衍生物的熒光傳感材料，所述材料是由7-羥基香豆素和乙酰丙酸作為基礎(chǔ)原料，二氯甲烷作為溶劑，n,n-二異丙基碳二亞胺是脫水劑，并且加入4-甲基氨基吡啶作為中和劑，經(jīng)親核反應(yīng)制備熒光化學(xué)傳感材料。

本發(fā)明還提供一種基于香豆素衍生物的熒光傳感材料的制備方法，步驟如下：

(1)先稱取乙酰丙酸和n,n-二異丙基碳二亞胺(dpts)加入燒杯中，再加入二氯甲烷溶解攪拌，得到懸浮固體n,n-二異丙基碳脲，過(guò)濾，得乙酰丙酸酐的濾液；

(2)稱取7-羥基香豆素和4-甲基氨基吡啶(dic)加入三口燒瓶中，加入與步驟(1)等量的二氯甲烷溶解；

(3)將步驟(1)所得濾液倒入三口燒瓶中，用與步驟(1)等量的二氯甲烷洗滌，將洗滌液倒入步驟(2)所得的混合溶液中，在一定溫度下回流加熱反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得到黃色固體。

步驟(1)中，所述乙酰丙酸、n,n-二異丙基碳二亞胺、二氯甲烷的用量比例為1.276-1.508g：0.882-1.134g：10-30ml。

步驟(2)中，7-羥基香豆素、4-甲基氨基吡啶、二氯甲烷的用量比例為810-1134mg：540-756mg：10-30ml。

步驟(3)中，所述回流加熱反應(yīng)溫度為40-60℃，反應(yīng)時(shí)間為4-6h。

本發(fā)明還提供一種基于香豆素的熒光傳感材料用于so3^2-選擇性識(shí)別檢測(cè)和生物體活細(xì)胞成像的用途。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，有益效果為：

(1)由于香豆素類化合物有較高的熒光量子產(chǎn)率，較大的斯托克斯位移和光學(xué)性能易調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，香豆素類衍生物被廣泛的用做激光染料、熒光增白劑等，也是分子熒光探針設(shè)計(jì)中最常用的熒光團(tuán)之一。本發(fā)明采用7-羥基香豆素作為基礎(chǔ)原料，羥基是強(qiáng)供電子基團(tuán)，在香豆素的7位引入強(qiáng)的供電子基團(tuán)，香豆素發(fā)射出強(qiáng)的熒光。將羥基酰基化后得到了熒光傳感材料，顯著的降低了7位取代基的供電子能力，吸收光譜藍(lán)移，熒光顯著下降。

(2)制備基于香豆素衍生物的熒光傳感材料過(guò)程中，加入n,n-二異丙基碳二亞胺，使乙酰丙酸的羧基脫去水分子變?yōu)樗狒?；加?-甲基氨基吡啶，能中和過(guò)量的乙酰丙酸。

(3)本發(fā)明制備的熒光傳感材料對(duì)so3^2-具有靈敏的選擇性識(shí)別性能，檢測(cè)限低，響應(yīng)時(shí)間快，在紫外燈下熒光信號(hào)的變化肉眼可見，其他常見陰離子干擾性小。

(4)本發(fā)明制備的熒光傳感材料檢測(cè)條件更為溫和，采用純水作為檢測(cè)介質(zhì)，避免了有機(jī)溶劑引入而造成的二次污染，體現(xiàn)出良好的生物相容性。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例3所制備的基于香豆素衍生物的熒光傳感材料的合成過(guò)程示意圖。

圖2為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料的¹hnmr圖，其中溶劑為dmso-d6。

圖3為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料的¹³cnmr圖,其中溶劑為dmso-d6。

圖4為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料的ms圖。

圖5為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料在不同陰離子存在時(shí)的熒光光譜圖。圖中的1表示的是本發(fā)明制備的熒光傳感材料。

圖6為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料在不同陰離子存在時(shí)的紫外可見光譜圖。圖中的1表示的是本發(fā)明制備的熒光傳感材料。

圖7為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料在不同濃度so3^2-存在時(shí)的熒光光譜圖。

圖8為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料在不同濃度so3^2-存在時(shí)的紫外可見光譜圖。

圖9為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料的熒光強(qiáng)度與存在so3^2-濃度的線性關(guān)系圖。

圖10為實(shí)施例3所制備熒光傳感材料用于生物體活細(xì)胞中so3^2-的成像圖；圖中a為加入熒光傳感材料培養(yǎng)后的細(xì)胞在明場(chǎng)下的成像，b為加入熒光傳感材料培養(yǎng)后的細(xì)胞在熒光場(chǎng)下的成像，c為加入10μmso3^2-后細(xì)胞在明場(chǎng)下的成像，d為加入10μmso3^2-后細(xì)胞在熒光場(chǎng)下的成像。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖說(shuō)明對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：制備基于香豆素衍生物的熒光化學(xué)傳感材料

先稱取1.276g乙酰丙酸和0.882gn,n-二異丙基碳二亞胺(dpts)加入燒杯中，再加入10ml二氯甲烷溶解攪拌，得到懸浮固體n,n-二異丙基碳脲。過(guò)濾，得濾液。稱取810mg7-羥基香豆素和540mg4-甲基氨基吡啶(dic)加入三口燒瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解。將濾液倒入三口燒瓶中，用10ml二氯甲烷洗滌，將洗滌液倒入三口燒瓶40℃回流。加熱4h后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得到黃色固體。

實(shí)施例2：制備基于香豆素的熒光化學(xué)傳感材料

先稱取1.508g乙酰丙酸和1.0gn,n-二異丙基碳二亞胺(dpts)加入燒杯中，再加入30ml二氯甲烷溶解攪拌，得到懸浮固體n,n-二異丙基碳脲。過(guò)濾，得濾液。稱取1134mg7-羥基香豆素和756mg4-甲基氨基吡啶(dic)加入三口燒瓶中，加入30ml二氯甲烷溶解。將濾液倒入三口燒瓶中，用30ml二氯甲烷洗滌，將洗滌液倒入三口燒瓶60℃回流。加熱6h后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得到黃色固體。

實(shí)施例3：制備基于香豆素的熒光化學(xué)傳感材料

先稱取1.392g乙酰丙酸和1.134gn,n-二異丙基碳二亞胺(dpts)加入燒杯中，再加入20ml二氯甲烷溶解攪拌，得到懸浮固體n,n-二異丙基碳脲。過(guò)濾，得濾液。稱取973mg7-羥基香豆素和648mg4-甲基氨基吡啶(dic)加入三口燒瓶中，加入20ml二氯甲烷溶解。將濾液倒入三口燒瓶中，用20ml二氯甲烷洗滌，將洗滌液倒入三口燒瓶50℃回流。加熱5h后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得到黃色固體。

如圖1所示是基于香豆素衍生物的熒光傳感材料的合成過(guò)程示意圖。

如圖2和圖3所示分別是熒光傳感材料的¹hnmr和¹³cnmr圖。¹hnmr(dmso-d6)δ(ppm):7.93(d,1h),7.52(d,1h),6.78(dt,1h),6.71(d,1h),6.20(d,1h),2.96(s,3h),2.65(t,2h),2.37(t,2h)。¹³cnmr(dmso-d6)δ(ppm):161.88,160.91,155.98,145.00,130.16,113.62,111.80,111.69,107.18,102.63,38.07,30.06,28.34,23.75。通過(guò)核磁譜圖可以確定熒光傳感材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

如圖4所示為熒光傳感材料(c14h12o5,260.07[m]⁺)的質(zhì)譜圖，其中261.04為[m+h]⁺對(duì)應(yīng)的分子量,進(jìn)一步證實(shí)了該熒光傳感材料的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例4：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對(duì)so3^2-選擇性的檢測(cè)

將實(shí)施例3中制備的熒光傳感材料制備成1mm的儲(chǔ)備液待用。取0.5ml上述儲(chǔ)備液用純水定容到100ml配制成5μm熒光傳感材料溶液。分別移取4ml上述5μm的待用溶液，分別加入50μm濃度的各種不同的陰離子(f^-,cl^-,br^-,i^-,no3^-,no2^-,scn^-,so4^2-,s2o3^2-,h2po4^-,clo4^-,aco^-,gsh,cysand1)，1表示的是本發(fā)明制備的熒光傳感材料。采用熒光光譜儀分別對(duì)各自的熒光光譜進(jìn)行測(cè)定，其中激發(fā)波長(zhǎng)為370nm。

取40μl探針儲(chǔ)備液和80μl各種不同的陰離子儲(chǔ)備液于4ml在純水溶液中，得到10μm濃度的探針和200μm濃度的各種不同的陰離子，測(cè)量吸光度的變化。

實(shí)施例5：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對(duì)so3^2-靈敏性的檢測(cè)

移取實(shí)施例3中的5μm的待用溶液，分別對(duì)so3^2-進(jìn)行熒光和紫外滴定實(shí)驗(yàn)，即分別加入0～11當(dāng)量的so3^2-進(jìn)行熒光光譜。本實(shí)施例中用到的陰離子濃度分別為：0.1×10^-5m、0.2×10^-5m、0.3×10^-5m、0.4×10^-5m、0.5×10^-5m、0.6×10^-5m、0.7×10^-5m、0.8×10^-5m、0.9×10^-5m、1.0×10^-5m、2.0×10^-5m、3.0×10^-5m、4.0×10^-5m、6.0×10^-5m、8.0×10^-5m、10.0×10^-5m、11.0×10^-5m。

熒光滴定實(shí)驗(yàn)的熒光發(fā)射光譜如圖7所示，從圖中可以看出，隨著so3^2-濃度的增加，455nm處的熒光發(fā)射峰逐漸增強(qiáng)。

取40μl探針儲(chǔ)備液于4ml純水中，得到10μm濃度的探針，滴定法測(cè)得吸光度隨so3^2-濃度的變化值。紫外可見滴定實(shí)驗(yàn)的熒光發(fā)射光譜如圖8所示，從圖中可以看出，熒光傳感材料在284和317nm處顯示出強(qiáng)烈的紫外可見吸收帶。

圖9表明在一定的濃度范圍內(nèi)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度與so3^2-離子的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程的斜率(slope)分別為31.53253，根據(jù)方程lod＝3δ/slope(10次空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差δ＝0.90249)計(jì)算得最低檢出限分別可低達(dá)8.5×10^-8nm。結(jié)果表明該熒光傳感材料對(duì)一定濃度范圍內(nèi)的so3^2-可進(jìn)行定量檢測(cè)并具有高的靈敏性。

實(shí)施例6：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對(duì)細(xì)胞的成像分析

將人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480接種到含有10％小牛胎血清的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)中，在溫度為37℃含有5％的co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。第一組是加入5μm的實(shí)施例3制備的熒光傳感材料繼續(xù)培養(yǎng)30min，之后用hepes緩沖溶液洗滌三次移除殘余的熒光傳感材料，第二組是加入10μmso3^2-后繼續(xù)培養(yǎng)30min，然后再次用hepes洗滌細(xì)胞，采用倒置熒光顯微鏡對(duì)加入so3^2-前后的細(xì)胞進(jìn)行成像分析。

熒光傳感材料對(duì)生物細(xì)胞中so3^2-的成像結(jié)果如圖10所示，圖10a和圖10b分別為加入熒光傳感材料培養(yǎng)后的細(xì)胞在明場(chǎng)和熒光場(chǎng)下的成像，圖10a表明該傳感材料具有低的生理毒性，并沒有對(duì)生物細(xì)胞造成破壞，圖10b表明用熒光傳感材料培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞并無(wú)熒光；圖10c和圖10d分別為加入so3^2-后細(xì)胞在明場(chǎng)和熒光場(chǎng)下的成像情況。從圖中可以看出，細(xì)胞中so3^2-的存在會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)部呈現(xiàn)出強(qiáng)的熒光發(fā)射。這一結(jié)果充分的表明熒光傳感材料具有良好的生物膜透過(guò)性并已成功進(jìn)入細(xì)胞到內(nèi)部，同時(shí)也證實(shí)了熒光傳感材料可用于生物體細(xì)胞中so3^2-熒光成像檢測(cè)分析。