【
技術(shù)領域：
】本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一種高產(chǎn)子囊霉素的吸水鏈霉菌誘變菌株及其應用。
背景技術(shù)：
：大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑是一類具有經(jīng)體內(nèi)外研究證明具有顯著的免疫抑制作用的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的免疫抑制劑，其代表物質(zhì)為子囊霉素(ascomycin，fk-520)及其衍生物、他克莫司(tacrolimus,fk506)、西羅莫司(sirolimus,rapamycin)等。大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑可被用于治療器官移植的排異反應和自身免疫相關(guān)性疾病等。子囊霉素是一種由二十三元環(huán)組成的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其藥用機理與他克莫司相似，可應用于治療特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風、netherton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療。近年來，一系列研究發(fā)現(xiàn)子囊霉素及其衍生物還具有抗痙攣、抗瘧疾、神經(jīng)保護再生等功能活性。子囊霉素衍生物“吡美莫司”于2001年被美國食品和藥物管理局(fda)批準上市，是治療特異性皮炎早起緩解和長期控制的非甾體類藥物；據(jù)報道，2006年子囊霉素美國的市場售價為150000美元/kg，其衍生物“吡美莫司”的市場售價為500000美元/kg，吡美莫司在美國的銷售額達159248000美元。子囊霉素及其衍生物的藥用價值和市場價值巨大，子囊霉素一般采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，現(xiàn)有菌株發(fā)酵生產(chǎn)子囊霉素的產(chǎn)量相對較低，發(fā)酵水平相對較低，國內(nèi)僅有131.7mg/l，國外雖然高達350～400mg/l，但成本過高是限制它使用的一個主要原因。因此，選育高產(chǎn)菌株，研究菌株特性及發(fā)酵行為，對于提高子囊霉素的生產(chǎn)性能，具有重要科學價值。目前常用的菌種選育技術(shù)(strainimprovement)根據(jù)其原理可分成隨機選育(randomscreening)和理性選育(rationalizedselection)兩大類。雖然以分子生物學為基礎的基因工程、代謝工程以及由各種組學組成的系統(tǒng)生物學研究為定向構(gòu)建功能細胞株提供了廣闊前景，但要真正實現(xiàn)以這些功能細胞培養(yǎng)來達到改造目標卻極其困難。由于微生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡的復雜性和多結(jié)點性，基因操作后菌株的代謝流往往并不朝著預期設計的方向轉(zhuǎn)移。尤其是在產(chǎn)生抗生素等次級代謝產(chǎn)物的復雜體系中，要想得到優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要還是采用隨機選育技術(shù)。長期以來針對吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)菌株改良的隨機選育技術(shù)中主要采用的是紫外誘變和ntg誘變等傳統(tǒng)的育種手段，且已取得一定的效果，然而長期使用這些誘變劑處理同一菌種，由于突變的不定向性及突變的累積使得在獲得高產(chǎn)的同時菌株在生活能力、產(chǎn)孢量等方面會明顯減弱，并且多次誘變往往導致較高的負突變率和抗性飽和，從而使得菌株改善的空間不足。有鑒于此，獲得一株能夠高產(chǎn)替考拉寧并且具有良好改善空間的菌株是從業(yè)人員所迫切期望地。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高產(chǎn)子囊霉素的吸水鏈霉菌誘變菌株，誘變菌株為吸水鏈霉菌fim-311-80(streptomyceshygroscopicus)，于2016年12月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmccno.13470。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：本實驗室以吸水鏈霉菌fim-311(streptomyceshygroscopicus)為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)并篩選得到的菌株，對該菌株的理化特性等進行鑒定，最終鑒定其為吸水鏈霉菌菌屬的一株菌株。同時，本發(fā)明揭露了該吸水鏈霉菌fim-311-80(streptomyceshygroscopicus)在發(fā)酵生產(chǎn)子囊霉素中的應用。本發(fā)明的有益效果在于：提供一種吸水鏈霉菌fim-311-80(streptomyceshygroscopicus)，其能夠發(fā)酵高產(chǎn)子囊霉素，大幅度提高了子囊霉素的產(chǎn)量，能夠應用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)；且該菌株fim-311-80穩(wěn)定性良好，連續(xù)傳代四代其產(chǎn)子囊霉素效價基本穩(wěn)定，維持在同一較高水平，能夠作為進一步研究和開發(fā)的生產(chǎn)菌株。【附圖說明】下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。圖1是本發(fā)明中致死率曲線。【具體實施方式】本發(fā)明中吸水鏈霉菌fim-311-80(streptomyceshygroscopicus)是以吸水鏈霉菌fim-311(streptomyceshygroscopicus)為出發(fā)菌株、并采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)篩選得到的菌株，該菌株能夠發(fā)酵生產(chǎn)子囊霉素，且產(chǎn)量優(yōu)異。實施例1、菌株fim-311的分離(1)于福建省福州市鼓嶺樹林下采集土壤，具體地，用取樣鏟將表層10cm左右的浮土除去，采集10cm處土樣10g～25g；稱取2g土樣并加入10ml無菌生理鹽水，振蕩后靜置30min，取上清液即原液并用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，選用稀釋度為10-2、10-3、10-4和10-5的懸浮液；(2)分別取原液及選用的懸浮液0.1ml涂布于添加50mg/l重鉻酸鉀的水配制的燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個樣重復3個平行板，然后將涂布后的平板置于28℃培養(yǎng)，觀察菌落外觀、大小、顏色、邊緣形狀、表面干濕狀態(tài)等形態(tài)特征；(3)無菌操作條件下，培養(yǎng)8-12天后挑出菌落圓形、菌落中心突起、表面呈皺褶、淺灰色或灰黑色、氣生菌絲吸水等具有代表性的單菌落，并劃線接種于燕麥瓊脂培養(yǎng)基斜面，置于28℃條件下培養(yǎng)，分離純化得到菌株，并將得到的菌株命名為菌株fim-311，然后于-80℃條件下將分離獲得的菌株fim-311以20％甘油保存。實施例2、菌株fim-311的鑒定(1)生理生化特性鑒定：將獲得的菌株fim-311在燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線涂菌并插入蓋玻片,28℃培養(yǎng)7～20d，用光學顯微鏡、透射和掃描電子顯微鏡觀察單菌落的形態(tài)特征及其菌絲。得到該菌株fim-311的主要形態(tài)及生理生化特性如下：成熟孢子鏈有10～42個孢子，孢子形狀呈橢圓或圓柱形狀，0.5～0.7×0.7～0.8μm。孢子聚集成堆，產(chǎn)生黑色斑點；在平板上，菌落圓形，菌落培養(yǎng)10d直徑約5～6mm，中心突起，表面呈皺褶，淺灰色或灰黑色，基內(nèi)菌絲為淺黃褐色，產(chǎn)可溶性色素，氣生菌絲吸水，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落由灰色變成黑色；可利用葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、檸檬酸鈉，不利用阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉籽糖、醋酸鈉，在馬鈴薯塊-明膠培養(yǎng)基上明膠液化，牛奶胨化，淀粉水解，纖維素上生長好，產(chǎn)生類黑色素和酪氨酸酶；此菌株fim-311為高耗氧菌，生長溫度為18～35℃，最適生長溫度為24-30℃，生長ph值為4.5～9.5，最佳生長ph為5～8。(2)分子生物學鑒定：對菌株fim-311的16srdna序列進行測序，測得的16srdna序列如seqidno.1所示；將所測的菌株的16srdna序列與genbank數(shù)據(jù)庫中已有序列進行比對，及進行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)網(wǎng)站上選取相應的模式株16srrna基因序列，系統(tǒng)進化分析用clustal-x軟件進行比對，生成的比對文件用treecon軟件鄰接法進行系統(tǒng)進化分析，拓撲分析為1000次重復取樣的結(jié)果；通過16srdna序列分析表明，菌株fim-311與吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)的序列同源性為100％。結(jié)合上述形態(tài)、生理生化特征與分子生物學鑒定，最終確定菌株fim-311屬于吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)菌屬。且菌株fim-311即水鏈霉菌fim-311(streptomyceshygroscopicus)，于2017年02月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmccno.13659。實施例3、菌株fim-311-80的獲得(1)、取所述菌株fim-311并轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-12天，且培養(yǎng)溫度為28℃；之后用生理鹽水洗下斜面培養(yǎng)基上的孢子，玻璃珠打散，經(jīng)紗布過濾，制成106個/ml的孢子懸液；(2)、用移液槍吸取10μl步驟(1)制得的孢子懸液于直徑為1cm的圓形鐵片上，置于以氦氣作為工作氣體、電源功率為110w、工作氣流量10l/min的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)中，且處理距離為2mm，分別處理5s、10s、15s、30s、45s、60s、60s、75s、90s，將處理后的孢子懸液進行梯度稀釋涂平板，制作致死率曲線(如圖1所示)；從中可以看出誘變處理劑量與菌株fim-311菌株致死率之間存在明顯的劑量效應關(guān)系，隨著處理時間的延長，致死率逐漸升高；(3)、根據(jù)步驟(1)的致死率曲線，選擇5s、30s兩個不同致死劑量的照射時間，對菌株fim-311的孢子懸液進行等離子體誘變；(4)、將步驟(3)中兩個不同處理時間的孢子懸液混合于裝有生理鹽水的試管中，混合均勻，得誘變孢子懸液，備用；(5)、將步驟(4)所得誘變孢子懸液進行梯度稀釋，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，選取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的孢子懸液，分別涂布于分離平板培養(yǎng)基上，于28℃避光培養(yǎng)8-12d；(6)、將步驟(5)中各個分離平板上長出的單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后，以1％的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，于30℃、230r/min條件下培養(yǎng)45-50h后得種子液；以10％的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、230r/min條件下培養(yǎng)3-6d，得發(fā)酵液；(7)取步驟(6)中所得發(fā)酵液適量，加入兩倍體積的無水乙醇，即發(fā)酵液與無水乙醇的體積比為1:2，充分振蕩、靜置、4000r/min離心10min，上清液過有機濾膜后，利用高效液相色譜法測定子囊霉素的產(chǎn)量，通過此方法即篩選出產(chǎn)子囊霉素量最大的菌株，為了方便描述，將篩選所得的菌株命名為菌株fim-311-80，且菌株fim-311-80于甘油中保存。實施例4、菌株fim-311-80的鑒定(1)生理生化特性鑒定：將獲得的菌株fim-311-80在燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線涂菌并插入蓋玻片，28℃培養(yǎng)7～20d，用光學顯微鏡、透射和掃描電子顯微鏡觀察單菌落的形態(tài)特征及其菌絲。得到該菌株fim-311的主要形態(tài)及生理生化特性如下：成熟孢子鏈有10～42個孢子，孢子形狀呈橢圓或圓柱形狀，0.5～0.7×0.7～0.8μm；孢子聚集成堆，產(chǎn)生黑色斑點；在平板上，菌落不規(guī)則，中心呈草帽狀突起，表面呈皺褶，灰黑色或褐色，基內(nèi)菌絲為黃褐色，產(chǎn)可溶性色素，氣生菌絲吸水，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落由灰色變成灰黑色或表面菌絲逐漸變黑；可利用葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、檸檬酸鈉，不利用阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉籽糖、醋酸鈉，在馬鈴薯塊—明膠培養(yǎng)基上明膠液化，牛奶胨化，淀粉水解，纖維素上生長好，產(chǎn)生類黑色素和酪氨酸酶；此菌株為高耗氧菌，最適生長溫度為26-30℃，最適生長ph為7.0-7.2；在搖床轉(zhuǎn)速為230～280r/min，培養(yǎng)3-6d時，子囊霉素產(chǎn)量最高，發(fā)酵過程中溶氧對子囊霉素的產(chǎn)生具有顯著作用。(2)分子生物學鑒定：對菌株fim-311-80的16srdna序列進行測序，測得的16srdna序列如seqidno.2所示；將所測的菌株的16srdna序列與genbank數(shù)據(jù)庫中已有序列進行比對，及進行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)網(wǎng)站上選取相應的模式株16srrna基因序列，系統(tǒng)進化分析用clustal-x軟件進行比對，生成的比對文件用treecon軟件鄰接法進行系統(tǒng)進化分析，拓撲分析為1000次重復取樣的結(jié)果；通過16srdna序列分析表明，菌株fim-311-80與與吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)的序列同源性為100％。通過上述的鑒定，可確定該菌株fim-311-80屬于吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)菌屬。實施例5、菌株fim-311-80發(fā)酵生產(chǎn)子囊霉素菌株fim-311-80的活化：將采用甘油保存的菌株fim-311-80轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-12天，且培養(yǎng)溫度為28℃；制備種子液：將菌株fim-311-80活化所得的單菌落接種于種子培養(yǎng)基(500ml三角瓶內(nèi)裝60ml種子培養(yǎng)基)中，于28℃、250r/min條件下培養(yǎng)40-60h，得種子液；發(fā)酵培養(yǎng)：將制得的種子液以5％(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(500ml三角瓶內(nèi)裝60ml發(fā)酵培養(yǎng)基)中，于28℃、250r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)3-6d，之后將所得發(fā)酵液進行檢測；檢測結(jié)果：菌株fim-311-80在發(fā)酵培養(yǎng)基上子囊霉素的產(chǎn)量高達546mg/l。實施例6、菌株fim-311-80的遺傳穩(wěn)定性驗證將經(jīng)實施例5驗證過的高產(chǎn)子囊霉素的菌株fim-311-80進行500ml搖瓶連續(xù)培養(yǎng)3～5代，以檢測其遺傳穩(wěn)定性，菌株傳代發(fā)酵實驗結(jié)果如下：對高產(chǎn)抗性菌株fim-311-80連續(xù)傳代5次：f1、f2、f3、f4、f5，經(jīng)搖瓶發(fā)酵后測定發(fā)酵效價，以生長良好的原代菌株(f0)為對照，結(jié)果見如下表1。表1傳代對菌株fim-311-80產(chǎn)替考拉寧的影響菌株代數(shù)f0f1f2f3f4f5相對效價(％)100100.3100.699.599.294.3由表1可知，菌株fim-311-80傳四代發(fā)酵水平無明顯影響，其子囊霉素效價基本穩(wěn)定，維持在同一較高水平；從而表明菌株fim-311-80具有較好的遺傳穩(wěn)定特性，目標菌種即菌株fim-311-80產(chǎn)子囊霉素水平最終維持在546mg/l左右，相對于出發(fā)菌株即菌株fim-311(90mg/l)提高了500％左右，所以誘變菌株吸水鏈霉菌fim-311-80(streptomyceshygroscopicus)能夠作為進一步研究和開發(fā)的生產(chǎn)菌株。另外，需要說明的是，在發(fā)明所涉及的各培養(yǎng)基的組分如下：分離平板培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基、及燕麥瓊脂培養(yǎng)基的組分均為：燕麥粉2％、瓊脂2％、余量為蒸餾水，121℃高壓蒸汽滅菌30min；種子培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖0.5％、燕麥粉1％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.15％、nacl0.2％、余量為蒸餾水，ph7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30min；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：糊精5.5％、黃豆粉2％、玉米漿粉0.5％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.3％、k2hpo40.1％、碳酸鈣0.05％、余量為蒸餾水，ph7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30min；且在無特殊說明的情形下，本發(fā)明中的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。綜上，本發(fā)明提供一種吸水鏈霉菌fim-311-80(streptomyceshygroscopicus)，其能夠發(fā)酵高產(chǎn)子囊霉素，大幅度提高了子囊霉素的產(chǎn)量，能夠應用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)；且該菌株fim-311-80穩(wěn)定性良好，連續(xù)傳代四代其產(chǎn)子囊霉素效價基本穩(wěn)定，維持在同一較高水平，能夠作為進一步研究和開發(fā)的生產(chǎn)菌株。sequencelisting<110>福建省微生物研究所<120>一種高產(chǎn)子囊霉素的吸水鏈霉菌誘變菌株及其應用<130>10000<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1395<212>dna<213>吸水鏈霉菌fim-311（streptomyceshygroscopicus）<400>1taccatgcagtcgacgatgaaccggtttcggccggggattagtggcgaacgggtgagtaa60cacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccgga120tatgaccgccgaccgcatggtctggtggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgc180ggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctg240agagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300tggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacgg360ccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgcaagtgacggtacctgcagaag420aagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccg480gaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccgggg540cttaactccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaat600tcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatc660tctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccc720tggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgttgtccgtg780ccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaa840ggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaa900gaaccttaccaaggcttgacatacatcggaaacactcagagatgggtgcccccttgtggt960cggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc1020cgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcctttcggggtgatggggactc1080acaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccc1140cttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgaagccgtga1200ggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgacccca1260tgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggc1320cttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaac1380ccttgtgggggagcc1395<210>2<211>1395<212>dna<213>吸水鏈霉菌fim-311-80（streptomyceshygroscopicus）<400>2taccatgcagtcgacgatgaaccggtttcggccggggattagtggcgaacgggtgagtaa60cacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccgga120tatgaccgccgaccgcatggtctggtggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgc180ggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctg240agagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300tggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacgg360ccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgcaagtgacggtacctgcagaag420aagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccg480gaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccgggg540cttaactccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaat600tcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatc660tctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccc720tggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgttgtccgtg780ccgcagctaa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