本發(fā)明生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)效率及遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：毛狀根，又稱(chēng)發(fā)狀根，發(fā)根，是由發(fā)根農(nóng)桿菌含有的ri質(zhì)粒上的t-dna插入到植株或器官、組織(包括愈傷組織)、單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體的細(xì)胞核基因組，而在感染部位產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物。毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)可作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)有應(yīng)用價(jià)值的植物代謝產(chǎn)物。另外，還可通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌將外源基因?qū)?，以調(diào)控目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。柴胡是我國(guó)典型的傳統(tǒng)大宗藥材，有2000多年的應(yīng)用歷史。是疏散退熱、舒肝、升陽(yáng)之要藥。北柴胡(bupleurumchinensedc.)是我國(guó)國(guó)家藥典規(guī)定的柴胡基源植物之一，為傘形科柴胡屬多年生草本植物。我國(guó)東北、華北、西北、華東、湖北、四川等地均有分布和種植，是柴胡藥材的主要來(lái)源。目前已有多種植物包括藥用植物具有毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，但每種植物的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系都存在差異，在一種植物上有效的方法，換一種植物往往難以成功。在摸索特定植物毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)體系過(guò)程中，通常是從發(fā)根農(nóng)桿菌菌種的類(lèi)別、植物外殖體類(lèi)型、侵染方式、侵染時(shí)間等條件出發(fā),通過(guò)試驗(yàn)獲得最佳條件。在《北柴胡毛狀根誘導(dǎo)及其植株再生體系的建立》(孫晶等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013)一文中，我們研究了從設(shè)計(jì)多種誘導(dǎo)條件出發(fā)，探索建立穩(wěn)定的柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系。發(fā)根農(nóng)桿菌a4侵染北柴胡無(wú)菌苗葉基部，共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)，10天開(kāi)始出現(xiàn)毛狀根，經(jīng)4～5周培養(yǎng)，轉(zhuǎn)為液體搖培，獲得大量毛狀根，誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根可再生成植株。毛狀根再生成植株有兩種方式:一種是液體搖培的毛狀根自發(fā)脫落形成幼苗的繼續(xù)培養(yǎng)，另一種是將毛狀根產(chǎn)生脫落的類(lèi)愈傷組織置于經(jīng)篩選的再生固體培養(yǎng)基上再生成植株。柴胡毛狀根及其植株再生體系的建立，為開(kāi)展柴胡次生代謝研究，尤其是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究和利用奠定了基礎(chǔ)。然而，此體系用于多基因轉(zhuǎn)化毛狀根的研究及應(yīng)用，效率比較低，毛狀根誘導(dǎo)率僅在10％左右。在《農(nóng)桿菌誘導(dǎo)北柴胡毛狀根體系建立及ugt基因功能初步研究》(孫晶等，微生物學(xué)，2014)一文中，參考前文提供的誘導(dǎo)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)多種誘導(dǎo)條件，包括不同菌種種類(lèi)、外植體類(lèi)型、侵染方式和侵染時(shí)間等，探索建立穩(wěn)定的北柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系。發(fā)現(xiàn)：在采用發(fā)根農(nóng)桿菌a4侵染北柴胡無(wú)菌苗葉基部，菌液浸染20min，置于固體培養(yǎng)基(b5+乙酰丁香酮200μtmol/l+蔗糖20g/l或ms+naa6mg/l+乙酰丁香酮200mol/l+蔗糖20g/l)共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)，10d左右發(fā)出毛狀根。由此，建立了北柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系。誘導(dǎo)率仍然在10％左右。且文章指出：柴胡毛狀根誘導(dǎo)率是否還可提高有待繼續(xù)從菌株和誘導(dǎo)條件等方面摸索。此外，在《農(nóng)桿菌誘導(dǎo)北柴胡毛狀根體系建立及ugt基因功能初步研究》(孫晶等，微生物學(xué)，2014)一文中，“進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的北柴胡bcugt10基因的遺傳轉(zhuǎn)化初步研究”，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)：“誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根經(jīng)25mgm潮霉素篩選獲得3條抗性毛狀根，pcr檢測(cè)后，未得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化毛狀根”本發(fā)明的目的在于提供一種能夠提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)率，并借以實(shí)現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)效率及遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明第一方面提供了一種提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)效率的方法，包括如下步驟：(1)獲得用于侵染的外植體；(2)獲得供侵染用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；(3)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng)：將步驟1)所得的外植體置于步驟2)所得侵染用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，搖培浸染；然后轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基，按照a)或b)處理：a)在黑暗條件下共培養(yǎng)3～5天；b)按照光照/黑暗(優(yōu)選16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)交替培養(yǎng)4～7天；(4)毛狀根的誘導(dǎo)：取步驟3)處理的外植體置于抑菌培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)根，獲得誘導(dǎo)的毛狀根。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(1)中，所述的獲得用于侵染的外植體的步驟具體包括：消毒種子萌芽獲得幼苗后，切去幼苗根部，至繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得無(wú)菌無(wú)根的分化小苗，即獲得用于第一菌種侵染的外植體。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，種子消毒后接種于ms固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無(wú)菌幼苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除本發(fā)明實(shí)施例所示示例之外，還可以采用其他的方法對(duì)種子進(jìn)行消毒、除菌，并培養(yǎng)至種子萌芽，獲得無(wú)菌幼苗。進(jìn)一步地，所述獲得的無(wú)菌無(wú)根的分化小苗置于無(wú)激素ms培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)0～3天后，獲得用于第一菌種侵染的外植體；優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)0、1、2或3天。優(yōu)選地，所述第一菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌a4、accc10060、accc15834、sw101中的一種或多種。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述繼代培養(yǎng)基為含如下組分的ms培養(yǎng)基：6-ba2.5mg/l、iaa2.5mg/l、30g/l蔗糖、5g/l植物凝膠。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(1)中，取(優(yōu)選為土壤中栽培的)柴胡幼苗的葉片和葉柄，經(jīng)消毒除菌后獲得所述用于第二菌種侵染的外植體。進(jìn)一步地，所述獲得的經(jīng)消毒滅菌的柴胡幼苗的葉片和葉柄置于無(wú)激素ms培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)0～3天后，獲得用于第二菌種侵染的外植體；優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)0、1、2或3天。更進(jìn)一步地，所述消毒除菌的方法包括：采用75％的酒精浸泡30～50s，20％的次氯酸鈉(naclo)溶液封閉處理5-10min，無(wú)菌水沖洗3～5次。優(yōu)選地，所述第二菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌sw101。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所用菌株的菌液od值為0.8～1.2。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所用菌株的菌液od值為0.8、1或1.2。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(3)中，所述搖培浸染的時(shí)間為20～25min。在本發(fā)明一實(shí)施例中，當(dāng)所述步驟(3)取a)步驟時(shí)，所用菌株為發(fā)根農(nóng)桿菌a4、accc10060、accc15834、sw101中的一種或多種。進(jìn)一步地，當(dāng)所述步驟(3)取a)步驟時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)間為3、4或5天。在本發(fā)明一實(shí)施例中，當(dāng)所述步驟(3)取b)步驟時(shí)，所用菌株為發(fā)根農(nóng)桿菌sw101。進(jìn)一步地，當(dāng)所述步驟(3)取b)步驟時(shí)，交替培養(yǎng)4、5、6或7天。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(4)中，抑菌培養(yǎng)基為含500mg/l的頭孢噻肟鈉(或car)的ms培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除本發(fā)明實(shí)施例所示示例之外，還可以采用其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的抑菌培養(yǎng)基，比如采用400或300mg/l的頭孢噻肟鈉(或car)的ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(4)中，黑暗培養(yǎng)20～30天后獲得誘導(dǎo)的毛狀根。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(4)中，獲得的誘導(dǎo)的毛狀根，每30天繼代一次，共抑菌處理90～100天，轉(zhuǎn)入普通培養(yǎng)基中(如無(wú)頭孢噻肟鈉(或卡納)的ms液體培養(yǎng)基)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)(具體地，150rpm黑暗培養(yǎng))，獲得大量誘導(dǎo)的毛狀根。本發(fā)明第二方面提供了一種提高北柴胡毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，包括如下步驟：(1)獲得用于侵染的外植體；(2)獲得供侵染用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，所述發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶外源基因；(3)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng)：將步驟1)所得的外植體置于步驟2)所得侵染用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，搖培浸染；然后轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基，按照a)或b)處理：a)在黑暗條件下共培養(yǎng)3～5天；b)按照光照/黑暗(優(yōu)選16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)交替培養(yǎng)4～7天；(4)毛狀根的誘導(dǎo)：取步驟3)處理的外植體置于抑菌培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)根，獲得誘導(dǎo)的毛狀根。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(1)中，所述的獲得用于侵染的外植體的步驟具體包括：消毒種子萌芽獲得幼苗后，切去幼苗根部，至繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得無(wú)菌無(wú)根的分化小苗，即獲得用于第一菌種侵染的外植體。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，種子消毒后接種于ms固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無(wú)菌幼苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除本發(fā)明實(shí)施例所示示例之外，還可以采用其他的方法對(duì)種子進(jìn)行消毒、除菌，并培養(yǎng)至種子萌芽，獲得無(wú)菌幼苗。進(jìn)一步地，所述獲得的無(wú)菌無(wú)根的分化小苗置于無(wú)激素ms培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)0～3天后，獲得用于第一菌種侵染的外植體；優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)0、1、2或3天。優(yōu)選地，所述第一菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌a4、accc10060、accc15834、sw101中的一種或多種。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述繼代培養(yǎng)基為含如下組分的ms培養(yǎng)基：6-ba2.5mg/l、iaa2.5mg/l、30g/l蔗糖、5g/l植物凝膠。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(1)中，取(優(yōu)選為土壤中栽培的)柴胡幼苗的葉片和葉柄，經(jīng)消毒除菌后獲得所述用于第二菌種侵染的外植體。進(jìn)一步地，所述獲得的經(jīng)消毒滅菌的柴胡幼苗的葉片和葉柄置于無(wú)激素ms培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)0～3天后，獲得用于第二菌種侵染的外植體；優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)0、1、2或3天。更進(jìn)一步地，所述消毒除菌的方法包括：采用75％的酒精浸泡30～50s，20％的次氯酸鈉(naclo)溶液封閉處理5-10min，無(wú)菌水沖洗3～5次。優(yōu)選地，所述第二菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌sw101。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述發(fā)根農(nóng)桿菌包含外源基因或插入有外源基因的質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為pk2gw7。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所用菌株的菌液od值為0.8～1.2。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所用菌株的菌液od值為0.8、1或1.2。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(3)中，所述搖培浸染的時(shí)間為20～25min。在本發(fā)明一實(shí)施例中，當(dāng)所述步驟(3)取a)步驟時(shí)，所用菌株為發(fā)根農(nóng)桿菌a4、accc10060、accc15834、sw101中的一種或多種。進(jìn)一步地，當(dāng)所述步驟(3)取a)步驟時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)間為3、4或5天。在本發(fā)明一實(shí)施例中，當(dāng)所述步驟(3)取b)步驟時(shí)，所用菌株為發(fā)根農(nóng)桿菌sw101。進(jìn)一步地，當(dāng)所述步驟(3)取b)步驟時(shí)，交替培養(yǎng)4、5、6或7天。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(4)中，抑菌培養(yǎng)基為含500mg/l的頭孢噻肟鈉(或car)的ms培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除本發(fā)明實(shí)施例所示示例之外，還可以采用其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的抑菌培養(yǎng)基，比如采用400或300mg/l的頭孢噻肟鈉(或car)的ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(4)中，黑暗培養(yǎng)20～30天后獲得誘導(dǎo)的毛狀根。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(4)中，獲得的誘導(dǎo)的毛狀根，每30天繼代一次，共抑菌處理90～100天，轉(zhuǎn)入普通培養(yǎng)基中(如無(wú)頭孢噻肟鈉(或卡納)的ms液體培養(yǎng)基)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)(具體地，150rpm黑暗培養(yǎng))，獲得大量誘導(dǎo)的毛狀根。本發(fā)明第三方面提供了一種提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)效率的方法在北柴胡毛狀根誘導(dǎo)、遺傳轉(zhuǎn)化、基因功能研究和/或北柴胡代謝產(chǎn)物(優(yōu)選地，為次級(jí)代謝產(chǎn)物，更優(yōu)選地，為由藥用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物)生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明第四方面提供了一種提高北柴胡毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法在北柴胡毛狀根誘導(dǎo)、遺傳轉(zhuǎn)化、功能基因研究和/或北柴胡毛狀根代謝產(chǎn)物(優(yōu)選地，為次級(jí)代謝產(chǎn)物，更優(yōu)選地，為由藥用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物)生產(chǎn)中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明基于對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、侵染菌液od值、共培養(yǎng)時(shí)間等條件的摸索，確認(rèn)了提高發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染效率的最佳組合條件。并給出了sw101誘導(dǎo)北柴胡毛狀根、以及a4、accc10060、accc15834誘導(dǎo)北柴胡毛狀根的最佳誘導(dǎo)條件。相比傳統(tǒng)的10％左右毛狀根誘導(dǎo)率，本發(fā)明提供的技術(shù)方案獲得的毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)70％-85％。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了提高北柴胡毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化效率的技術(shù)方案，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以獲得80％以上的外源基因轉(zhuǎn)化率，為北柴胡功能基因研究和/或北柴胡毛狀根代謝產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化提供了更好、更高效、更簡(jiǎn)便的選擇。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染北柴胡外植體產(chǎn)生發(fā)根照片；圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的北柴胡毛狀根培養(yǎng)60天后生長(zhǎng)狀況；圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的pcr擴(kuò)增載體卡納抗性基因片段的電泳結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明?？梢岳斫獾氖?，若無(wú)特殊說(shuō)明，本發(fā)明采用試劑均采用商品化試劑。本發(fā)明英文縮寫(xiě)的中文釋義如下：cef：頭孢霉素、頭孢噻肟鈉；6-ba：6-芐氨基腺嘌呤；as：乙酰丁香酮；iaa：吲哚乙酸。實(shí)施例1本發(fā)明實(shí)施例提供了一種提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)效率的方法，包括如下步驟：一、外植體的獲得1、北柴胡干種子，用自來(lái)水沖洗浮塵，再用滅菌蒸餾水沖洗幾遍；2、之后步驟在超凈臺(tái)操作：用75％的酒精浸泡30～50s；3、20％的次氯酸鈉(naclo)溶液封閉處理15min，無(wú)菌水沖洗干凈3～5次；4、將消毒后的種子用無(wú)菌濾紙吸干水分，普通ms培養(yǎng)基于25℃黑暗培養(yǎng)，每2-3天，轉(zhuǎn)出染菌種子，8-9天之后基本無(wú)染菌現(xiàn)象，培養(yǎng)至14天左右，種子開(kāi)始萌發(fā)；5、切去幼苗根部，至繼代培養(yǎng)基中(ms+6-ba2.5mg/l+iaa2.5mg/l+30g/l蔗糖+5g/l植物凝膠)，獲得無(wú)菌無(wú)根的分化小苗，即為后續(xù)用于侵染的外植體。二、發(fā)根農(nóng)桿菌活化1、發(fā)根農(nóng)桿菌接種于含50mg/l利福平(rif)的lb培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)2天；2、挑取單菌落，于含50mg/l利福平的lb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩暗培養(yǎng)24h；3、按1∶100稀釋菌液，繼續(xù)搖培至od600＝0.8～1.2，5000r·min-1離心10min，收集菌體；4、用等體積的ms+200μmas液體培養(yǎng)基重懸沉淀，供侵染用。三、發(fā)根農(nóng)桿菌侵染(毛狀根誘導(dǎo))1、將步驟一所得的外植體置于重懸液中在100rpm25℃搖培20～25min；2、轉(zhuǎn)入ms培養(yǎng)基，黑暗共培養(yǎng)3～5d；3、共培養(yǎng)后的外植體于含500mg/lcef(或car)ms培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)，20-30d后選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的根系，即為誘導(dǎo)的不同毛狀根根系；4、每30d繼代一次，共抑菌處理90-100d，轉(zhuǎn)入無(wú)cef(或car)的ms液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)(150rpm黑暗培養(yǎng))。本發(fā)明實(shí)施例提供的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染北柴胡外植體產(chǎn)生發(fā)根照片如圖1所示；北柴胡毛狀根培養(yǎng)60天后生長(zhǎng)狀況如圖2所示。經(jīng)過(guò)分析，本發(fā)明實(shí)施例提供了的提高北柴胡毛狀根誘導(dǎo)效率方法，誘導(dǎo)結(jié)果相比現(xiàn)有方法(10％的毛狀根誘導(dǎo)率)獲得了意料不到的效果：70％～85％的外植體可以誘導(dǎo)出毛狀根(即毛狀根誘導(dǎo)效率達(dá)到70％以上)，且每個(gè)外植體上毛狀根數(shù)目在5～10條。替換實(shí)施例1為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明提供了如下替換實(shí)施例1，替換實(shí)施例1將實(shí)施例1的步驟一至三中某些條件替換，其他不變，相應(yīng)的測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)表1(d：天；min：分鐘；h：小時(shí))：表1.表1中，所述預(yù)培養(yǎng)具體為將實(shí)施例1步驟一、“外植體的獲得”第5點(diǎn)“獲得無(wú)菌無(wú)根的分化小苗，即為后續(xù)用于侵染的外植體”替換為：“獲得的無(wú)菌無(wú)根的分化小苗，置于無(wú)激素ms培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)0～3天后，獲得后續(xù)用于菌種侵染的外植體；具體地，預(yù)培養(yǎng)0、1、2或3天”。若使用的外植體為“葉片和葉柄”，而非實(shí)施例1所述“無(wú)根分化小苗”時(shí)，所述“葉片和葉柄”的獲取方法為：取土壤中栽培的柴胡幼苗的葉片和葉柄，經(jīng)消毒除菌后用于侵染，消毒除菌方法：用75％的酒精浸泡30～50s，20％的次氯酸鈉(naclo)溶液封閉處理5-10min，無(wú)菌水沖洗3～5次。注：注射法是將菌液注射到小苗各部位，然后直接在誘導(dǎo)發(fā)根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。由表1可知：基于替換實(shí)施例1中各條件摸索，初步確認(rèn)發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染效率主要與菌株、侵染菌液od值、共培養(yǎng)時(shí)間等因素相關(guān)。替換實(shí)施例2為了更進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明提供了如下替換實(shí)施例2，替換實(shí)施例2將實(shí)施例1的步驟一至三中某些條件替換，其他不變，相應(yīng)的測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)表2、3(d：天；min：分鐘；h：小時(shí))：表2.表3.由表2、3可知，od值過(guò)高或過(guò)低均影響發(fā)根率；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均影響發(fā)根率。對(duì)比實(shí)施例為了更進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明提供了如下對(duì)比實(shí)施例，對(duì)比實(shí)施例將實(shí)施例1的步驟一中某些條件替換，其他不變，相應(yīng)的測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)表4：表4.配方誘導(dǎo)分化結(jié)果ms+kt0.5mg/l+30g/l蔗糖+5g/l植物凝膠增值率約為1:1ms+6-ba2.5mg/l+iaa2.5mg/l+30g/l蔗糖+5g/l植物凝膠增值率約為1:5ms+6-ba0.5mg/l+iaa0.5mg/l+30g/l蔗糖+5g/l植物凝膠增值率約為1:2ms+6-ba5mg/l+iaa.5mg/l+30g/l蔗糖+5g/l植物凝膠增值率約為1:10但幼苗出現(xiàn)玻璃化由表4確定了本發(fā)明實(shí)施例1步驟一的實(shí)驗(yàn)條件，即表格4中第2組條件。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例提供了一種提高北柴胡毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，包括如下步驟：一、毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化一、感受態(tài)細(xì)胞的制備：取菌種，劃線接種于含50mg/l利福平的lb培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2天；挑取單菌落，于含50mg/l利福平的lb液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩暗培養(yǎng)24h；按1∶50稀釋菌液，繼續(xù)搖培至od600＝0.6，將菌液冰浴15min，分裝于1.5ml無(wú)菌離心管中，5000rpm4℃離心5min；棄上清，將菌體重懸于600μl冰預(yù)冷的0.05mol/l無(wú)菌cacl2中，冰浴30min，5000rpm4℃離心10min；棄上清，將菌體重懸于100μl冰預(yù)冷的0.05mol/l無(wú)菌cacl2中；-80℃保存，供轉(zhuǎn)化用；二、凍融法轉(zhuǎn)化：1、將帶有外源基因的質(zhì)粒(本實(shí)例為pk2gw7，invitrogen)加入到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰上放置30min；液氮中速凍5min，37℃溫浴5min，再冰浴2min；加入700μllb液體培養(yǎng)基，28℃搖培12h，6000rpm離心3min；棄上清，保留100μl菌液，槍頭混勻，用涂布器均勻涂布于含質(zhì)粒相應(yīng)抗性的抗生素(本實(shí)例為卡納)和50mg/l利福平的lb平板上，28℃倒置培養(yǎng)2d至出現(xiàn)單菌落；2、挑取單菌落，28℃、180r/min振蕩暗培養(yǎng)24h，菌液pcr證實(shí)轉(zhuǎn)化成功；3、選擇1個(gè)轉(zhuǎn)化成功的單菌落，擴(kuò)大菌的培養(yǎng)量，用于毛狀根誘導(dǎo)；誘導(dǎo)步驟參見(jiàn)實(shí)施例1及替換實(shí)施例1-2的步驟三；分別獲得本發(fā)明實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)步驟；三、pcr驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效果：1、毛狀根基因組dna快速提?。喝￠L(zhǎng)約2cm毛狀根樣品于離心管中，加入20μl0.2mnaoh溶液，使用高通量組織研磨器4000rpm工作10s，間歇10s，共3次，破碎后，3500rpm離心1min，加490μl0.1mtris-hcl，渦旋振蕩，3500rpm離心1min，取1.5μl上清液用于pcr擴(kuò)增。2、以毛狀根基因組dna為模板，擴(kuò)增質(zhì)粒載體(本實(shí)例為pk2gw7)特有的卡納抗性基因片段，以未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒菌株誘導(dǎo)的毛狀根作為對(duì)照(ck)，引物序列(寶生物合成)k-2f:actgggcacaacagacaatc(seqidno.1)，k-2r:cttcagcaatatcacgggtag(seqidno.2)。pcr體系(10μl)及程序：primstarhs(生工):5μl，模板:1.5μl，引物各0.5μl，ddh20:2.5μl。程序：95℃，5min，(98℃10s，58℃5s，72℃20s)35循環(huán)，72℃5min。本發(fā)明實(shí)施例2將載體pk2gw7(invitrogen)轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，按照實(shí)施例1及替換實(shí)施例1-2步驟三的方法進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌侵染北柴胡外植體，采用pcr擴(kuò)增載體上的卡納抗性基因，鑒別毛狀根的產(chǎn)生，可得出此法毛狀根誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率達(dá)70％-85％。圖3為按照實(shí)施例1步驟三的方法進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌侵染北柴胡外植體時(shí)，實(shí)施例2pcr擴(kuò)增載體卡納抗性基因片段的電泳結(jié)果，m:dna分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)，泳道1-7：轉(zhuǎn)基因毛狀根根系，ck：未攜帶pk2gw7載體的毛狀根根系。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12