本發(fā)明公開了一種親水性多肽純化的方法，屬于蛋白質(zhì)與多肽純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
所謂多肽，它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一種化合物。它由氨基酸構(gòu)成，但與蛋白質(zhì)又有所不同，屬于它們之間的中間物質(zhì)。氨基酸能夠彼此以肽鍵相互連接的化合物稱作肽。一種肽含有的氨基酸少于10個(gè)就被稱為寡肽，超過的就稱為多肽，氨基酸為50多個(gè)以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。多肽生物活性高，它能調(diào)節(jié)各種生理活動(dòng)和生化反應(yīng)。到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和分離出100多種存在于人體的肽，對(duì)于多肽的研究和利用，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)了一個(gè)空前的繁榮景象。
近幾十年來，對(duì)于多肽的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，現(xiàn)在的科學(xué)家已經(jīng)對(duì)多肽有了清醒的認(rèn)識(shí)。多肽對(duì)人體具有非常重要的不可替代的調(diào)節(jié)作用，這種作用幾乎涉及到人體的所有生理活動(dòng)。
在進(jìn)行普通藥物動(dòng)力學(xué)研究中，hplc是技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛的分析手段。在蛋白多肽藥物的實(shí)驗(yàn)研究或產(chǎn)業(yè)化中，hplc都是主要的分離純化工具。但鑒于蛋白多肽藥物結(jié)構(gòu)的特殊性，特別一些小分子多肽。由于序列短而且很多親水性氨基酸，所以在常規(guī)hplc上幾乎沒有保留，對(duì)后期的分離純化造成一定的難度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種親水性多肽純化的方法，主要解決現(xiàn)在hplc用于小分子多肽分離時(shí)存在在常規(guī)hplc上幾乎沒有保留，對(duì)后期的分離純化造成一定的難度的技術(shù)問題。本發(fā)明的思路是：采用凝膠色譜和氨基柱反相色譜兩步分離純化，從而實(shí)現(xiàn)最終產(chǎn)品的分離得到高純度的肽。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種親水性多肽純化的方法，包括以下步驟：
第一次凝膠色譜純化步驟：
（1）將多肽樣品加純?nèi)胨谐晹嚢枞芙庵敝脸吻?，用微孔濾膜過濾；
（2）將多肽樣品加入到預(yù)裝好的凝膠柱中，上樣量為1-5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設(shè)置合適的流速洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置；
第二次氨基柱純化步驟：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統(tǒng)，洗脫流動(dòng)相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調(diào)ph至4.2±0.02），流動(dòng)相b相為乙腈；
（2）設(shè)置洗脫梯度、流速及檢測(cè)波長；
（3）收集目標(biāo)餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重。
所述微孔濾膜為0.45μm水系微孔濾膜。所述的凝膠為交聯(lián)葡聚糖，比如sephadexg的g-10、g-15等。所用氨基柱為luna氨基柱。所述多肽序列中親水氨基酸占比超過50%。所述多肽分子量不大于600da。
本發(fā)明的有益效果是：通過采用凝膠色譜和氨基柱反相色譜兩步分離純化，有效的解決了親水性多肽在反相幾乎不保留無法分離。同時(shí)有效的提高了工作效率，減少有機(jī)溶劑用量，節(jié)省成本。除了采用凝膠色譜和氨基柱反相色譜兩步分離純化這個(gè)思路，在采用具體參數(shù)設(shè)定時(shí)，是否有哪些參數(shù)設(shè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員不容易想到的，并帶來特定的技術(shù)效果。有益效果的描述多多益善，并最好用數(shù)據(jù)說話。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
樣品名：(β-asp)-asp結(jié)構(gòu)式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品(β-asp)-asp加純?nèi)胨谐晹嚢枞芙庵敝脸吻?，?.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預(yù)裝好的凝膠柱g-10中，上樣量為2倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設(shè)置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統(tǒng)，洗脫流動(dòng)相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調(diào)ph至4.2±0.02），流動(dòng)相b相為乙腈；
（2）設(shè)置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測(cè)波長為215nm；
（3）收集目標(biāo)餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計(jì)算回收率為38.21%。
實(shí)施例2
樣品名：orn-asp結(jié)構(gòu)式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品orn-asp加純?nèi)胨谐晹嚢枞芙庵敝脸吻?，?.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預(yù)裝好的凝膠柱g-15中，上樣量為1.5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設(shè)置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統(tǒng)，洗脫流動(dòng)相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調(diào)ph至4.2±0.02），流動(dòng)相b相為乙腈；
（2）設(shè)置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測(cè)波長為215nm；
（3）收集目標(biāo)餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計(jì)算回收率為37.56%。
實(shí)施例3
樣品名：β-asp-orn結(jié)構(gòu)式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品β-asp-orn加純?nèi)胨谐晹嚢枞芙庵敝脸吻?，?.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預(yù)裝好的凝膠柱g-10中，上樣量為2.5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設(shè)置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統(tǒng)，洗脫流動(dòng)相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調(diào)ph至4.2±0.02），流動(dòng)相b相為乙腈；
（2）設(shè)置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測(cè)波長為215nm；
（3）收集目標(biāo)餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計(jì)算回收率為39.27%。
實(shí)施例4
樣品名：β-asp-δ-orn結(jié)構(gòu)式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品β-asp-δ-orn加純?nèi)胨谐晹嚢枞芙庵敝脸吻澹?.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預(yù)裝好的凝膠柱g-15中，上樣量為3倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設(shè)置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統(tǒng)，洗脫流動(dòng)相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調(diào)ph至4.2±0.02），流動(dòng)相b相為乙腈；
（2）設(shè)置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測(cè)波長為215nm；
（3）收集目標(biāo)餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計(jì)算回收率為38.68%。
實(shí)施例5
樣品名：orn-δ-orn結(jié)構(gòu)式：
第一次凝膠色譜純化：
（1）將樣品orn-δ-orn加純?nèi)胨谐晹嚢枞芙庵敝脸吻?，?.45μm水系微孔濾膜過濾；
（2）將樣品加入到預(yù)裝好的凝膠柱g-15中，上樣量為5倍柱床體積；
（3）加入無鹽水作為洗脫液，設(shè)置流速為4ml/min洗脫分離樣品；
（4）樣品純度大于90%的收集在一起放置。
第二次氨基柱純化：
（1）將上述收集的樣品上樣至反相色譜系統(tǒng)，洗脫流動(dòng)相a相為磷酸緩沖液（取磷酸二氫鉀13.61g，加入500ml溶解后加入氨水5.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，用磷酸調(diào)ph至4.2±0.02），流動(dòng)相b相為乙腈；
（2）設(shè)置洗脫梯度b為40-60%，30min、流速為30ml/min、檢測(cè)波長為215nm；
（3）收集目標(biāo)餾分；
（4）將收集餾分凍干稱重，計(jì)算回收率為38.37%。