本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法。

背景技術(shù)：

dna提取是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)，它是不斷發(fā)展的基因芯片檢測(cè)中最基本的方法，也是基因芯片制備、分析和診斷的前提，因此，dna提取是生物學(xué)最基礎(chǔ)的技術(shù)之一。

成功的核酸分離純化需要四個(gè)重要的步驟：組織或細(xì)胞的破碎和裂解、核蛋白復(fù)合體的變性、核酸酶的滅活以及污染物的去除，通過(guò)理想的抽提方法可以獲取高質(zhì)量的靶核酸，同時(shí)沒(méi)有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。

目前，常用的dna提取方法主要有玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法等物理方法，ctab法、異硫氰酸胍法、堿裂解法等化學(xué)方式，以及酶提取法等生物提取方式；根據(jù)核酸分離純化方式的不同有硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂提取等。其中，植物來(lái)源的dna提取方法主要有十六烷基三乙基澳化按(ctab)法、sds法和高鹽低ph法等；細(xì)菌、真菌來(lái)源的dna提取方法為堿裂解法、煮沸法、sds裂解法以及triton-溶菌酶裂解法等；動(dòng)物來(lái)源的dna最為經(jīng)典的提取方法主要有酚抽提法、異丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法，現(xiàn)行的很多方法都是在此基礎(chǔ)上改進(jìn)得來(lái)。

口腔黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，具有代謝旺盛、更新快、易脫落的特點(diǎn)，它由多層細(xì)胞組成，基底層具有旺盛分裂能力，其上皮脫落細(xì)胞雖然細(xì)胞核固縮，但與其他組織細(xì)胞一樣具有完整的基因組dna，從而成為法醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)dna多態(tài)性檢測(cè)分型的生物性檢驗(yàn)材料。既往多采用酚氯仿法或chelex-100等方法，存在酚、氯仿污染或收獲率低、純度不高等缺點(diǎn)。

采用口腔拭子法(口腔脫落細(xì)胞)提取口腔上皮細(xì)胞是一種非介入、無(wú)痛苦、無(wú)創(chuàng)傷、簡(jiǎn)單的dna標(biāo)本采集方法，該方法適用于采集任何年齡段人群的dna樣本，同時(shí)也可應(yīng)用于新生兒、嬰幼兒或老弱病殘者等不便采血人群之用。

目前，口腔拭子dna的提取多采用96孔板磁珠提取，處理口腔拭子樣本時(shí)，需要先將拭子頭剪下放入1.5ml左右離心管中，加入消化液及蛋白酶k，進(jìn)行細(xì)胞的裂解和酶解反應(yīng)后，再轉(zhuǎn)入96深孔板進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。一方面，兩次分步操作的方式增加了操作步驟、造成時(shí)間浪費(fèi)，同時(shí)在樣品轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，也極大的增加了混樣的風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中口腔拭子dna提取樣品易混樣的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種裂解及酶解口腔拭子dna的方法，包括如下步驟：

(1)取細(xì)胞培養(yǎng)板，按照順序一一對(duì)應(yīng)空位，將口腔拭子頭置于深孔板中；

(2)向所述細(xì)胞培養(yǎng)板中加入消化液和蛋白酶k；

(3)密封所述細(xì)胞培養(yǎng)板；

(4)將所述細(xì)胞培養(yǎng)板于振蕩器上充分混勻并水浴處理，得到dna酶解液。

所述細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔板。

所述細(xì)胞培養(yǎng)板為96深孔板。

所述步驟(3)中，使用所述細(xì)胞培養(yǎng)板的專用膠墊進(jìn)行密封。

所述水浴處理步驟的溫度為56℃。

所述消化液為blbuffer。

所述消化液的加入量為500ul。

所述蛋白酶k的加入量為20ul。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，包括如下步驟：

(a)按照所述裂解及酶解口腔拭子dna的方法，得到所述dna酶解液；

(b)將所述dna酶解液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板上，按照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法進(jìn)行后續(xù)的dna提取。

所述步驟(b)中，還包括加入磁珠進(jìn)行提取的步驟。

本發(fā)明所述96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，在處理拭子樣品時(shí)，直接以96深孔板為載體，并處理獲得dna酶解液，可以直接將所述dna酶解液置于新的細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行常規(guī)后續(xù)處理，整個(gè)過(guò)程將從離心管轉(zhuǎn)移時(shí)混樣的風(fēng)險(xiǎn)降到最低，同時(shí)減少操作步驟，節(jié)省了操作時(shí)間。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中96孔板提取口腔拭子dna的操作示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中96孔板提取口腔拭子dna的另一角度操作示意圖；

圖3是本發(fā)明對(duì)比例中單管離心管提取口腔拭子dna的操作示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1

如圖1、2所示，本實(shí)施例所述96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法是以96孔板進(jìn)行，包括如下步驟：

(a)口腔拭子dna的裂解及酶解，具體包括：

(1)取96深孔板為細(xì)胞培養(yǎng)板，按照《樣本提取表》的順序，一一對(duì)應(yīng)空位，使用手術(shù)剪將口腔拭子頭剪下，置于所述96深孔板中；

(2)向所述細(xì)胞培養(yǎng)板中加入500ul的消化液blbuffer和20ul的蛋白酶k；

(3)以所述96深孔板專用膠墊密封所述96深孔板；

(4)將所述96深孔板于振蕩器上充分混勻并控制56℃水浴處理，得到dna酶解液；

(b)將所述dna酶解液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板上，按照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法進(jìn)行后續(xù)的dna提取，具體包括：

(1)加入350ul無(wú)水乙醇，加入30ul磁珠，置于混勻儀上1200rpm，混勻1分鐘；靜置吸附10分鐘，并在靜置第3分鐘、第6分鐘分別混勻1次；

(2)吸附結(jié)束后，混勻磁珠，將深孔板置于磁力架上，至溶液澄清后，撕去膠墊，棄去深孔板內(nèi)上清液，注意不要觸碰到磁珠；

(3)加入600ul已加乙醇的洗滌液bw1，蓋上膠墊，置于混勻儀上1350rpm，混勻1分鐘；并將深孔板置于磁力架上，至溶液澄清后，撕去膠墊，棄去深孔板內(nèi)上清液，注意不要觸碰到磁珠；

(4)加入600ul已加乙醇的洗滌液bw1，蓋上膠墊，按照上述方法再洗滌一次；

(5)隨后加入500ul80％乙醇溶液，蓋上膠墊，按照上述方法洗滌一次；

(6)將96深孔板置于干式加熱器上，40℃烘干5分鐘；

(7)加入50ul洗脫液ce，置于混勻儀上1600rpm，混勻1分鐘，于56℃水浴孵育10分鐘進(jìn)行dna洗脫，并在第5分鐘混勻1次；

(8)孵育結(jié)束后混勻磁珠，置于磁力架上至溶液澄清，吸取上清；使用nanodrop測(cè)定濃度，將濃度填寫到《樣本濃度表》中，于-20℃保存待用。

對(duì)比例

所述對(duì)比例中提取口腔拭子dna的方法與實(shí)施例1相同，其區(qū)別僅在于，如圖3所示，所述步驟(a)中，所述裂解及酶解dna的步驟中，在處理口腔拭子樣本時(shí)，先將口腔拭子頭剪下放入1.5ml左右離心管中，加入相同的消化液及蛋白酶k，在相同條件下，進(jìn)行細(xì)胞的裂解和酶解反應(yīng)，得到所述dna酶解液；待消化完畢后，再轉(zhuǎn)入96深孔板中，按照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法進(jìn)行后續(xù)的dna提取，所述dna提取步驟同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)例

對(duì)上述實(shí)施例1中以96深孔板進(jìn)行操作和對(duì)比例中以現(xiàn)有單管提取口腔拭子的方法中所提取得到的dna樣本濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)比，記錄數(shù)據(jù)如下表1。

表1兩種方法dna樣本濃度和純度對(duì)比

由上表可看出使用96深孔板和單管孵育樣本得到dna樣本的濃度，其純度近似，沒(méi)有顯著的差異，但本發(fā)明所述方法使用96深孔板進(jìn)行dna提取操作相比于單管提取操作能大大的減少操作的時(shí)間、且有效降低轉(zhuǎn)移時(shí)混樣的風(fēng)險(xiǎn)。

以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。