本發(fā)明涉及一種提高spcema對(duì)植物病原菌抗性的方法，還涉及spcema::erbd的植物表達(dá)載體。屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制農(nóng)作物產(chǎn)量提高的重要因素。長(zhǎng)期以來(lái)，廣泛采用的防治手段主要為化學(xué)防治，但由于病原菌變異速度快，會(huì)對(duì)各種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生耐藥性或抗藥性，同時(shí)農(nóng)藥所帶來(lái)的環(huán)境污染和生態(tài)平衡問(wèn)題也不容忽視。因此，為保障食品安全，減少化學(xué)防治方法對(duì)環(huán)境的破壞，急需開(kāi)發(fā)高效并對(duì)環(huán)境安全的植物病害防治手段。

近年來(lái)，基因工程在植物抗病的研究上已經(jīng)取得了初步的進(jìn)展。研究表明，在植物中表達(dá)不同來(lái)源的抗菌肽基因能顯著增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗病性（gaoetal.,2000;jaynesetal,1993;jhaetal.,2009）。但利用抗菌肽獲得的轉(zhuǎn)基因植物材料抗病能力較差，還不能滿足生產(chǎn)的的需要。為獲得高效的植物抗病基因，除繼續(xù)在不同物種中篩選、克隆抗菌肽基因外，利用分子進(jìn)化手段對(duì)抗菌肽進(jìn)行定向改良，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上提高其抗菌效果是一條較為有效的途徑。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不同的抗菌肽具有不同的抑菌機(jī)制，包括結(jié)合并破壞真菌細(xì)胞膜，穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中抑制不同的靶標(biāo)等。因此，與真菌細(xì)胞膜的互著是抗菌肽發(fā)揮抑菌活性的重要步驟。我們?cè)O(shè)想，如能增加抗菌肽在真菌細(xì)胞膜上的富集能力，將提高抗菌肽的抑菌效果。在真菌中，麥角甾醇是細(xì)胞膜上獨(dú)特的脂類(lèi)成分，能夠調(diào)控真菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性，是細(xì)胞生存的關(guān)鍵因子（sanglardetal.,2003）。cema是由殺菌肽ceropina的n-端8個(gè)氨基酸和經(jīng)改造的蜂毒素c-末端組成的陽(yáng)離子抗菌肽，我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步在其n端添加信號(hào)肽獲得了spcema（牛國(guó)清等，２００２）。將spcema導(dǎo)入植物中，可提高植物抗病性，但提高幅度仍有限。在本發(fā)明中，以真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇為靶標(biāo)，利用分子改良手段在現(xiàn)有抗菌肽spcema上添加麥角甾醇結(jié)合域erbd（luccaetal.,1998），提高對(duì)植物病原真菌的靶向性和富集能力，從而達(dá)到理想的抗菌效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高spcema對(duì)植物病原菌抗性的方法，解決目前植物抗病基因工程中抗菌肽的抑菌效果不理想的問(wèn)題，利用分子改良手段在spcema的c末端融合麥角甾醇結(jié)合域erbd，提高抗菌肽在植物病原菌細(xì)胞膜上的靶向性和富集能力，從而進(jìn)一步增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)病原菌的抗性。

本發(fā)明還提供該融合抗菌肽基因的植物表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因煙草材料。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種提高spcema對(duì)植物病原菌抗性的方法，以植物病原真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇為靶點(diǎn)，利用分子改良手段在spcema的c末端融合麥角甾醇結(jié)合域erbd，并獲得相應(yīng)的融合抗菌肽基因；如seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的氨基酸序列，構(gòu)建植物表達(dá)載體。

進(jìn)一步，具體步驟為：由于麥角甾醇結(jié)合域erbd和spcema的分子量小，采用人工合成的方式（常州基宇生物科技有限公司）獲得兩端分別添加bamhi與ecori酶切位點(diǎn)、中間用linker序列連接的融合抗菌肽，并連接于大腸桿菌克隆載體puc57上，命名為puc57-spcema::erbd。隨后，bamhi與ecori酶切puc57-spcema::erbd，回收spcema::erbd片段，并與植物表達(dá)載體進(jìn)行連接，獲得正確的spcema::erbd植物表達(dá)載體。

一種融合抗菌肽基因的轉(zhuǎn)基因煙草材料，利用構(gòu)建的上述植物表達(dá)載體，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后導(dǎo)入野生型煙草中組成性表達(dá)。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明利用分子改良手段在spcema的c末端融合了麥角甾醇結(jié)合域erbd，并獲得一個(gè)新的融合抗菌肽基因。與野生型抗菌肽相比，改良后的抗菌肽能更加有效的抑制植物病原真菌的萌發(fā)及生長(zhǎng)。

2、本發(fā)明將融合抗菌肽基因?qū)胍吧蜔煵葜?，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因煙草。結(jié)果顯示，相比野生型spcema，獲得的spcema::erbd轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)植物病原菌的抗性顯著提高。表明經(jīng)分子改良后的spcema::erbd在植物抗病基因工程中具有較好的應(yīng)用前景。

3、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的抗菌肽已被應(yīng)用到植物抗病基因工程中。然而，天然抗菌肽僅有限提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病原菌的抗性，還不能滿足生產(chǎn)需要。因此，植物抗病基因工程的關(guān)鍵是獲得高效、特異的抗病基因。本發(fā)明中利用植物病原菌細(xì)胞與植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)及組成成份上存在差異，以植物病原真菌細(xì)胞膜上特有的麥角甾醇為靶點(diǎn)，通過(guò)定向改良手段在spcema的c末端融合麥角甾醇結(jié)合域erbd，獲得相應(yīng)的融合抗菌肽，提高其對(duì)植物病原真菌的靶向性和富集能力，在相同濃度下，增強(qiáng)抗菌肽對(duì)病原真菌的抑制效果，同時(shí)減少對(duì)非靶標(biāo)細(xì)胞的危害。

附圖說(shuō)明

圖1spcema::erbd植物表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證；

圖中m2000表示marker2000（bioer公司）m15表示marker15（fermentas公司）；泳道1-5表示不同spcema::erbd植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶bamhi和ecori酶切的結(jié)果。

圖2spcema::erbd植物表達(dá)載體圖譜；

其中g(shù)rp-gusplus-his6代表gusplus報(bào)告基因，該基因在n端融合了grp信號(hào)肽，在c端融合了his6序列標(biāo)簽；nptii代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，具有卡那霉素抗性；camv35s：來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動(dòng)子；lb：t-dna左邊界；rb：t-dna右邊界。

圖3轉(zhuǎn)基因煙草的gus染色；

transgenic代表的是轉(zhuǎn)基因煙草的gus染色結(jié)果；non-transgenic代表的是非轉(zhuǎn)基因煙草的gus染色結(jié)果。

圖4轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)量篩選；

橫坐標(biāo)表示不同轉(zhuǎn)基因煙草的轉(zhuǎn)化子，其中spcema::erbd-4和spcema::erbd-42代表的是spcema::erbd轉(zhuǎn)基因株系，spcema-44和spcema-46代表的是spcema轉(zhuǎn)基因株系，wt表示野生型煙草植株；縱坐標(biāo)表示不同植株中外源基因的相對(duì)表達(dá)水平。

圖5轉(zhuǎn)基因煙草葉片離體抗病性比較；

a：轉(zhuǎn)基因煙草葉片對(duì)大麗輪枝菌的抗性比較；b：轉(zhuǎn)基因煙草葉片對(duì)煙草赤星病的抗性比較。wt表示野生型煙草葉片；spcema表示spcema轉(zhuǎn)基因煙草葉片；spcema::erbd表示spcema::erbd轉(zhuǎn)基因煙草葉片；water表示經(jīng)水處理的野生型葉片。

圖6轉(zhuǎn)基因煙草葉片總蛋白提取液對(duì)油菜黑斑病原菌的抗性比較；

wt表示野生型煙草葉片總蛋白提取液；spcema表示spcema轉(zhuǎn)基因煙草葉片總蛋白提取液；spcema::erbd表示spcema::erbd轉(zhuǎn)基因煙草葉片總蛋白提取液；kpb表示磷酸鹽緩沖液。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明提供一種提高spcema對(duì)植物病原菌抗性的方法，利用分子改良手段將麥角甾醇結(jié)合域erbd，融合到spcema的c末端，其具有如seqidno.1所示的核苷酸序列和如seqidno.2所示的氨基酸序列。

【實(shí)施例1】spcema::erbd基因的獲取

由于麥角甾醇結(jié)合域erbd和spcema的分子量小，采用人工合成的方式（常州基宇生物科技有限公司）獲得兩端分別添加bamhi與ecori酶切位點(diǎn)、中間用linker序列連接的融合抗菌肽，如序列1所示1-165bp為spcema序列；166-189bp為linker序列；190-240bp為erbd序列；241-243bp為終止密碼子序列，如序列2所示1-55aa為spcema編碼；56-63aa為linker編碼；64-80為erbd編碼。并連接于大腸桿菌克隆載體puc57上，命名為puc57-spcema::erbd。

【實(shí)施例2】spcema::erbd植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為驗(yàn)證通過(guò)分子改良后的spcema::erbd能否進(jìn)一步提高植株的抗病能力，于是構(gòu)建了融合抗菌肽的植物表達(dá)載體，步驟如下：

植物表達(dá)載體是由西南大學(xué)生物技術(shù)中心利用pcambia2300和pbi121自主改造而得的一個(gè)雙元表達(dá)的基礎(chǔ)載體。該載體的hptii基因用xhoi單酶切后替換為nptii基因（設(shè)計(jì)引物從pbi121載體中擴(kuò)增獲得，引物設(shè)計(jì)兩端帶xhoi位點(diǎn)），限制性酶切和測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了nptii基因的方向。在pbi121載體中擴(kuò)增獲得camv35s啟動(dòng)子和nos終止子，同時(shí)這兩個(gè)元件兩端也引入了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，這兩個(gè)元件最后分別導(dǎo)入pcambia的多克隆位點(diǎn)，形成camv35s::mcs::nos單元。該植物表達(dá)載體含有1套2×camv35s啟動(dòng)子控制nptii基因的植物表達(dá)元件、1套camv35s啟動(dòng)子控制報(bào)告基因grp-gusplus-his6的植物表達(dá)元件和一套camv35s啟動(dòng)子控制目標(biāo)基因的植物表達(dá)元件，可實(shí)現(xiàn)kan和gus活性的雙標(biāo)記篩選。在多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite，mcs）插入外源基因spcema::erbd，可以實(shí)現(xiàn)spcema::erbd的超量表達(dá)（圖2）。

煙草遺傳轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基

共培養(yǎng)培養(yǎng)基（ph5.4）：ms無(wú)機(jī)+b5有機(jī)+30g/l蔗糖+2.0mg/l6-ba（6-芐氨基嘌呤）+0.1mg/lnaa（吲哚乙酸）+100μmas（乙酰丁香酮）+2g/lgelrite；

篩選培養(yǎng)基（ph5.8）：ms無(wú)機(jī)+b5有機(jī)+30g/l蔗糖+2.0mg/l6-ba（6-芐氨基嘌呤）+0.1mg/lnaa（吲哚乙酸）+400mg/lcef（頭孢噻肟鈉）+100mg/lkm（卡那霉素）+2g/lgelrite；

生根培養(yǎng)基（ph5.8）：ms無(wú)機(jī)+b5有機(jī)+30g/l蔗糖+200mg/lcef（頭孢噻肟鈉）+2g/lgelrite。

【實(shí)施例3】煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

⑴轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌浸染液的制備

分別挑取含融合抗菌肽基因的根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于20mlyeb（5g/l蔗糖，1g/l細(xì)菌用酵母抽提物，10g/l細(xì)菌用胰化蛋白胨，0.5g/lmgso4·7h2o，ph7.0；50mg/lkm（卡那霉素），125mg/lsm（鏈霉素）），28℃、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，然后按5%的比例將菌液接種入20ml不含抗生素的液體yeb，28℃、200rpm培養(yǎng)至od600約為0.8-1.2。收集菌液，離心后棄上清，用同等體積的msb液體重懸菌體，然后將菌液全部收集到一個(gè)無(wú)菌的三角瓶，放在搖床上震蕩培養(yǎng)1h后，即制備成農(nóng)桿菌浸染液。

⑵煙草遺傳轉(zhuǎn)化

參考horsch等（science,asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants,1985,227:1229-1231）的方法，以無(wú)菌苗的幼嫩葉片為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

具體操作為：煙草種子1%次氯酸鈉溶液消毒10min，無(wú)菌自來(lái)水沖洗5-6次，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期于固體萌發(fā)培養(yǎng)培養(yǎng)，待無(wú)菌苗長(zhǎng)至5片葉時(shí)，取幼嫩葉片作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。農(nóng)桿菌浸染液浸染外植體30min后傾去菌液，無(wú)菌吸水紙吸去外植體表面多余菌液，然后接種入鋪有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25℃暗共培養(yǎng)2d。共培養(yǎng)完成后，將外植體接種入篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期培養(yǎng)，每2周繼代一次。產(chǎn)生km抗性幼芽后，將幼芽切下接種入生根培養(yǎng)基，獲得km抗性再生植株。待根長(zhǎng)至3-5cm時(shí)，對(duì)再生植株進(jìn)行g(shù)us染色確認(rèn)，陽(yáng)性植株移栽入溫室生長(zhǎng)成苗。

gus染色液配方

500mg/lx-gluc（x-gluc溶于dmso，濃度為12.5mg/ml），na2edta（0.01mol/l），k3fe(cn)6（0.1mol/l），k4fe(cn)6（0.1mol/l），tritonx-1001%（v/v），pbs緩沖液（0.14mol/lph7）。

【實(shí)施例4】轉(zhuǎn)基因煙草的gus染色

用打孔器在再生煙草植株的幼嫩葉片上取樣，于37℃恒溫箱中進(jìn)行g(shù)us組織化學(xué)染色。3小時(shí)后用75%酒精對(duì)染色后的樣品進(jìn)行脫色，并于體視鏡下拍照。結(jié)果表明，已成功將目的基因轉(zhuǎn)入野生型煙草中（圖3）。

【實(shí)施例5】轉(zhuǎn)基因煙草的表達(dá)量檢測(cè)

為檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)情況，對(duì)溫室中各轉(zhuǎn)化子植株提取rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用rt-pcr進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，并基于bio-radcfxmanager和excel進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)的分析。所用引物為（p1：5’-tgcttccttttcttggttc-3’；p2：5’-caacttcaaagctggcaat-3’）。rt-pcr反應(yīng)體系：5.0μluniversalsybrgreensupermix（bio-rad），4.0μlcdna，0.5μlp1，0.5μlp2，總體積10μl。rt-pcr反應(yīng)參數(shù)：95℃（3min）；40個(gè)循環(huán)：94℃（10sec），56℃（30sec），72℃（30sec）。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)rt-pcr的表達(dá)量檢測(cè)分析，篩選得到了表達(dá)量較高的spcema::erbd和spcema轉(zhuǎn)基因煙草株系各2個(gè)。

為了在同一水平上比較spcema:erbd與野生型抗菌肽spcema的轉(zhuǎn)基因煙草抗病性差異，選取了表達(dá)量水平盡可能一致的spcema::erbd-4和spcema-44植株進(jìn)行抗病鑒定分析。

【實(shí)施例6】轉(zhuǎn)基因煙草葉片離體抗病性比較

首先，檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因煙草葉片對(duì)大麗輪枝菌的抗性。用不帶針頭的1ml注射器在煙草離體葉片上創(chuàng)建輕微的傷口，隨后移液槍吸取10μl濃度為10⁷個(gè)孢子/ml的落葉型大麗輪枝菌的孢子懸浮液注入到傷口處，并在葉柄處包裹上濕潤(rùn)的吸水紙。將處理后的葉片置于塑料筐中，并覆蓋上一層透明薄膜以保持濕度，于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)15天后觀察發(fā)病情況。結(jié)果如圖5a所示，接種病原菌后的野生型煙草葉片發(fā)病嚴(yán)重，接種處的葉片呈現(xiàn)明顯的褐變現(xiàn)象，并出現(xiàn)大量的真菌菌絲，而接種水的野生型煙草葉片未出現(xiàn)任何病癥，排除了由機(jī)械損傷引起葉片病變的可能；野生型spcema轉(zhuǎn)基因煙草有輕微的病變癥狀，接種處的葉片開(kāi)始變褐，同時(shí)可以觀察到少量的大麗輪枝菌菌絲；而相比野生型spcema，spcema::erbd轉(zhuǎn)基因煙草葉片在接種處未發(fā)現(xiàn)明顯的病變及菌絲。表明融合抗菌肽對(duì)大麗輪枝菌具有更強(qiáng)的抗性。

同時(shí)，也進(jìn)行了對(duì)煙草赤星病菌的抗性鑒定。取溫室健康生長(zhǎng)煙草的第三片葉，利用葉片噴施法接種濃度為10⁷個(gè)孢子/ml的煙草赤星病孢子懸浮液，并在葉柄處包裹上濕潤(rùn)的吸水紙。將處理后的葉片置于塑料筐中，并覆蓋上一層透明薄膜以保持濕度，于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)15天后觀察發(fā)病情況。結(jié)果如圖5b所示，接種后的野生型煙草葉片發(fā)病嚴(yán)重，已呈現(xiàn)明顯的枯萎癥狀；野生型spcema轉(zhuǎn)基因煙草輕微發(fā)病，其葉片的邊緣開(kāi)始變色、枯萎；而相比野生型spcema，spcema::erbd轉(zhuǎn)基因煙草葉片上未發(fā)現(xiàn)明顯的病斑。表明融合抗菌肽對(duì)煙草赤星病菌具有更強(qiáng)的抗性。

【實(shí)施例7】轉(zhuǎn)基因煙草植株總蛋白提取液對(duì)病原菌的抗性比較

為了更加直觀的比較spcema::erbd與野生型spcema轉(zhuǎn)基因煙草的抗性差異，利用0.03mpbs緩沖液（ph5.8）提取植株總蛋白進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。bradford法測(cè)定各樣品中總蛋白的含量，并利用蛋白提取液將各植物總蛋白的濃度統(tǒng)一到1mg/ml，隨后比較它們對(duì)油菜黑斑病原菌孢子的抑菌效果。

在滅菌處理的90mm培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上一層大小合適的濾紙，加滅菌水濕潤(rùn)，然后在濾紙上放上兩根牙簽，放上滅菌處理的載玻片。將6μl的煙草蛋白提取液（1mg/ml）、1μl油菜黑斑孢子重懸液（10⁷個(gè)/ml）以及3μlpdb滴加在載玻片的中間，于26℃共培養(yǎng)10h后，進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6）：油菜黑斑孢子在pbs緩沖液和野生型煙草總蛋白提取液中能夠正常萌發(fā)生長(zhǎng)；在野生型spcema轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白提取液中，絕大部分的孢子能夠正常萌發(fā)，但其菌絲的生長(zhǎng)受到了抑制；而融合抗菌肽轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白提取液能夠明顯抑菌孢子的萌發(fā)。上述結(jié)果表明，麥角甾醇結(jié)合域的添加能夠進(jìn)一步提高spcema對(duì)油菜黑斑病原菌孢子的抑菌效果。

sequencelisting

<110>西南大學(xué)

<120>一種提高spcema對(duì)植物病原菌抗性的方法及轉(zhuǎn)基因煙草材料

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>243

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>seqidno.1所示的核苷酸序列

<400>1

atggagaagaagtctcttgctggcttgtgcttccttttcttggttctttttgttgctcaa60

gaaattgtggtgactgaagctaagtggaagttgttcaagaagatcggtatcggtgctgtt120

ttgaaggttttgactactggattgccagctttgaagttgaccaagggtggttctggtggt180

ggttctggttttaagttgagagctaagattaaggttagattgagagctaagattaagttg240

tag243

<210>2

<211>80

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>seqidno.2所示的氨基酸序列

<400>2

mekkslaglcflflvlfvaqeivvteakwklfkkigigavlkvlttglpalkltkggsgg60

gsgfklrakikvrlrakikl80