本發(fā)明屬于物種鑒定及中藥材真?zhèn)舞b別技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法。

背景技術(shù)：

白僵蠶(bombyxmori)，蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶(bombyxmorilinnaeus)4～5齡的幼蟲(chóng)感染(或人工接種)白僵菌beauveriabassiana(bals.)vuillant而致死的干燥體(國(guó)家藥典委員會(huì)，2015)。白僵蠶中的白僵菌是一類(lèi)寄生于昆蟲(chóng)的病原真菌，據(jù)ncbi最新數(shù)據(jù)報(bào)道，將白僵菌歸類(lèi)于：雙核亞界(dikarya)、子囊菌門(mén)(ascomycota)、盤(pán)菌亞門(mén)(pezizomycotina)、糞殼菌綱(sordariomycetes)、肉座菌亞綱(hypocreonycetidae)、肉座菌目(hypocreales)、蟲(chóng)草菌科(cordycipitaceae)、蟲(chóng)草屬(cordceps)。

白僵蠶作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有降血糖、降血脂、抗癌、抗驚厥、抗凝、抑菌、鎮(zhèn)靜催眠、美白等多種藥理作用，從而使得其在臨床治療上具有重要的作用。目前農(nóng)戶(hù)養(yǎng)殖僵蠶所帶來(lái)的收益是很可觀的，可以作為農(nóng)民致富的好途徑(張偉基，2016)。然而，由于僵蠶具有重要的藥理作用和良好的經(jīng)濟(jì)效益，使得一些商家為了獲得更多利益，開(kāi)始用假冒和不合格僵蠶充當(dāng)合格僵蠶。目前傳統(tǒng)的偽品僵蠶大多為用石灰水將死家蠶摻白加工而成(趙啟有，1998)，也有將地蠶冒充正品僵蠶使用(胡大澤等，2003)，近年來(lái)，出現(xiàn)了新的偽品黑死蠶和空心僵蠶。由于偽品僵蠶的外觀、顯微等均與正品相似，難以應(yīng)用常規(guī)方法進(jìn)行有效鑒別，為了杜絕該類(lèi)現(xiàn)象的出現(xiàn)，其真?zhèn)舞b別在白僵蠶質(zhì)量評(píng)定工作上顯得尤為重要。

目前現(xiàn)行的僵蠶質(zhì)量鑒定方法主要包括兩種，一是物理鑒定方法，包括外觀鑒別和顯微觀察(徐國(guó)均等，1996；國(guó)家藥典委員會(huì)，2015)、微量升華法(黃曉雪，2005)、sds-page(邱乙，2014)、灰色關(guān)聯(lián)度分析法(李峰，2011)、紫外指紋圖譜(冀憲領(lǐng)，2006)、紅外指紋圖譜(冀憲領(lǐng)，2007)、高效液相色譜法(王更先，2006)等方法對(duì)僵蠶藥材質(zhì)量進(jìn)行鑒定；二是分子鑒定方法，主要是賈靜(2016)等基于coi序列和its序列分別對(duì)僵蠶藥材的基原物種家蠶和白僵菌進(jìn)行鑒定，從而對(duì)白僵蠶的質(zhì)量及品質(zhì)進(jìn)行鑒定。其中，分子鑒定具有更準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，應(yīng)用前景更好。

目前對(duì)僵蠶中白僵菌真?zhèn)舞b定方面，一直缺少特異驗(yàn)證白僵菌的引物，缺乏一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有僵蠶真?zhèn)舞b定技術(shù)的缺陷和不足，完成對(duì)廣東株白僵菌線粒體全基因組序列的高通量測(cè)序，比較白僵菌線粒體基因序列在地理種屬上的差異，發(fā)現(xiàn)白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯；并基于白僵菌線粒體rps3基因序列設(shè)計(jì)引物，尋找特異擴(kuò)增真菌白僵菌的引物，提供一種特異鑒定白僵菌的分子標(biāo)記方法，從而快速鑒別僵蠶中白僵菌的真?zhèn)?，為中藥材僵蠶臨床用藥安全工作上提供分子技術(shù)支持。

本發(fā)明的目的是提供白僵菌的核糖體蛋白基因rps3序列。

本發(fā)明另一目的是提供一組鑒定驗(yàn)證僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚囊锝M。

本發(fā)明再一目的是提供一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法。

本發(fā)明的再一目的是提供一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚脑噭┖小?/p>

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明人在完成對(duì)廣東株白僵菌線粒體全基因組測(cè)序和13個(gè)蟲(chóng)草科物種的線粒體全基因組生物信息學(xué)比較分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯，并基于廣東株白僵菌線粒體的rps3基因序列設(shè)計(jì)篩選得到了1對(duì)能特異檢測(cè)白僵菌的引物。

一組鑒定驗(yàn)證僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚囊锝M，為引物對(duì)f935和r1385，序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示。

所述引物組在鑒定驗(yàn)證僵蠶中白僵菌真?zhèn)沃械膽?yīng)用，在構(gòu)建快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法中的應(yīng)用，以及在制備快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚脑噭┖兄械膽?yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法，以待測(cè)中藥材白僵蠶總dna為模板，利用引物組f935/r1385進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)pcr擴(kuò)增結(jié)果有無(wú)清晰的500bp目的電泳條帶來(lái)判斷待測(cè)中藥材白僵蠶樣品中是否含有白僵菌。

進(jìn)一步優(yōu)選地，還可繼續(xù)對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步確定結(jié)果。

其中，優(yōu)選地，所述白僵蠶總dna的提取方法為：先將白僵蠶預(yù)處理成粉末后，進(jìn)行總dna提??；所述預(yù)處理是指：用65～75％乙醇擦拭白僵蠶表面后，放于30～40℃環(huán)境中使酒精揮發(fā)，再粉碎磨粉。

具體更優(yōu)選地，所述白僵蠶總dna的提取方法為：先用70％乙醇擦拭白僵蠶表面后，放于37℃環(huán)境中使酒精揮發(fā)，再用高速多功能粉碎機(jī)磨粉；然后加入液氮充分研磨，使用真菌基因組快速提取試劑盒抽提總dna，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另外，優(yōu)選地，所述pcr的反應(yīng)體系為：2xtaqmastermix25μl，10pmol/μl的上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o2μl。

優(yōu)選地，所述pcr的反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。

一種包含有上述的引物對(duì)f935和r1385的快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚脑噭┖?，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述試劑盒還可以包含有以待測(cè)中藥材白僵蠶總dna為模板，利用引物組f935/r1385進(jìn)行pcr擴(kuò)增所需的試劑。

該試劑盒的使用方法如上所述快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法。

本發(fā)明在完成對(duì)廣東株白僵菌線粒體全基因組測(cè)序和13個(gè)蟲(chóng)草科物種的線粒體全基因組生物信息學(xué)比較分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯，并基于廣東株白僵菌線粒體全基因序列設(shè)計(jì)合成引物，最終篩選出了1對(duì)能特異檢測(cè)白僵菌的引物。并利用12株地理株系白僵菌以及市售僵蠶樣品進(jìn)行引物有效性驗(yàn)證，完成了對(duì)設(shè)計(jì)引物特異性、有效性的驗(yàn)證，建立了高效、快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明基于對(duì)廣東株白僵菌線粒體全基因組測(cè)序結(jié)果和13個(gè)蟲(chóng)草科物種的線粒體全基因組生物信息學(xué)比較分析，以及對(duì)12株不同地理株系白僵菌rps3基因進(jìn)行多序列對(duì)比分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位點(diǎn)存在堿基的替換現(xiàn)象，因此選擇基因rps3作為白僵菌線粒體全基因組的分子標(biāo)記應(yīng)用于中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)舞b別，為僵蠶的真?zhèn)舞b別提供了理論基礎(chǔ)。

同時(shí)，通過(guò)提取廣東株白僵菌基因組總dna，構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)，采用lluminahiseq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序；denovo的方法將測(cè)序數(shù)據(jù)組裝成完整的白僵菌線粒體基因組序列?；趶V東株白僵菌線粒體全基因序列設(shè)計(jì)篩選出了1對(duì)能特異檢測(cè)白僵菌的引物，特異性好、靈敏度高，從而為不同產(chǎn)地市售僵蠶中基原白僵菌真?zhèn)舞b別的提供新的分子鑒定方法。

利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的這對(duì)特異鑒定白僵菌的引物對(duì)不同產(chǎn)地市售僵蠶中白僵菌真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，最終通過(guò)pcr擴(kuò)增、電泳、測(cè)序及數(shù)據(jù)對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，為僵蠶中白僵菌的分子鑒定提供了實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)，為中藥材僵蠶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化提供新方法。

附圖說(shuō)明

圖1為12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對(duì)結(jié)果。

圖2為12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對(duì)結(jié)果。

圖3為12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對(duì)結(jié)果。

圖4為廣東株白僵菌線粒體基因結(jié)構(gòu)圖。

圖5為廣東株白僵菌近源物種所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

圖6為基于廣東株白僵菌線粒體rps3基因設(shè)計(jì)的引物組f935/r1385的pcr擴(kuò)增結(jié)果。注：m為dl2000dnamarker；1：實(shí)驗(yàn)室保存株白僵菌b.bassiana，2：廣東英德株白僵菌b.bassiana，3：廣西南寧株白僵菌b.bassiana，4：廣東英德株白僵菌血清型b.bassiana(serum_types)，5：廣東英德株灰僵菌isariajavanica，6：曲霉aspergillusnomius，7：鐮刀霉fusariumproliferatum，8：水空白對(duì)照組。

圖7為基于引物組f935/r1385的12株地理株系白僵菌的pcr擴(kuò)增結(jié)果。注：m：marker2000dl；1：實(shí)驗(yàn)室保存株，2：廣西中平株，3：廣西中平浪洞村株，4：廣東茂名株，5：廣東化州株，6：廣西宜州石別株，7：廣西環(huán)江株，8：廣東翁源硝村株，9：廣西南寧株，10：廣東微生物研究所生防株，11：廣東英德株，12：湖南瀘溪株，13：水空白組。

圖8為基于12株地理株系白僵菌rps3基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

圖9為引物組f935/r1385對(duì)不同產(chǎn)地僵蠶的pcr擴(kuò)增結(jié)果。注：m：marker2000dl；1-41號(hào)為不同產(chǎn)地市售僵蠶；a、b號(hào)為水空白組。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。

除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1白僵菌特異引物設(shè)計(jì)

1、發(fā)明人基于線粒體全基因組學(xué)分析法，比較了包括白僵菌在內(nèi)的13個(gè)蟲(chóng)草科物種的線粒體全基因組序列基因結(jié)構(gòu)，找到了1個(gè)白僵菌差異蛋白編碼基因rps3，該基因?yàn)榫幋a核糖體蛋白s3的基因，核糖體蛋白s3是核糖體40s小亞基的組成蛋白，具有核糖體外功能，在dna損傷修復(fù)、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

同時(shí)，應(yīng)用clustalx1.81軟件12株不同地理株系白僵菌rps3基因進(jìn)行多序列對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12株不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位點(diǎn)存在堿基的替換現(xiàn)象(12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對(duì)結(jié)果如圖1、2、3所示。圖1、2、3是依次連續(xù)的)。

因此，選擇基因rps3作為白僵菌線粒體全基因組的分子標(biāo)記應(yīng)用于中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)舞b別。

2、對(duì)廣東株白僵菌線粒體全基因組進(jìn)行測(cè)序

廣東株白僵菌線粒體基因結(jié)構(gòu)圖如圖4所示。廣東株白僵菌線粒體為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，堿基全長(zhǎng)為29922bp，gc比例為27.26％，含有42個(gè)編碼基因(15個(gè)蛋白編碼基因、25個(gè)trna、2個(gè)rrna)，不含gap區(qū)域。

具體方法如下：

s1.廣東株白僵菌菌種的繁殖與分離純化

配置pda培養(yǎng)基，采用劃線法繁殖、分離純化廣東株白僵菌菌種；制備廣東株白僵菌單菌落。

s2.提取廣東株白僵菌基因組總dna

取適量白僵菌單菌落菌絲，加入液氮充分研磨，使用康為世紀(jì)真菌dna提取試劑盒按照其操作說(shuō)明提取病葉總dna。

s3.構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)

s4.illuminahiseq2500平臺(tái)測(cè)序

s5.質(zhì)量檢測(cè)

為保障后續(xù)分析的可靠性，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的檢測(cè)和數(shù)據(jù)篩選，檢測(cè)的內(nèi)容包括：數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)，測(cè)序數(shù)據(jù)量、測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量、gc比例分布、測(cè)序正確率等；同時(shí)基于檢測(cè)結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：測(cè)序數(shù)據(jù)q20(正確率在99％以上的堿基的比例)不小于90％，q30(正確率在99.9％以上的堿基比例)不小于83％。

s6.線粒體基因組序列捕獲

根據(jù)已經(jīng)發(fā)布的近緣物種線粒體基因組序列，基于dna序列對(duì)比的方法，在總dna測(cè)序數(shù)據(jù)中分離測(cè)序樣品的線粒體基因組序列。

s7.基因組組裝與驗(yàn)證

根據(jù)線粒體基因組數(shù)據(jù)的overlap關(guān)系，將測(cè)序的dna序列片段，組裝成完整的線粒體基因組。并通過(guò)測(cè)序質(zhì)量和測(cè)序深度驗(yàn)證組裝的正確性。

s8.基因組注釋

基因組的注釋先從trna開(kāi)始，利用mitfi，trnascan-se(v1.21)和arwen對(duì)trna進(jìn)行注釋?zhuān)_保trna注釋的準(zhǔn)確性；編碼基因和rrna基因的注釋?zhuān)瑫r(shí)基于blastn&blastx(2.2.28+)的方法共同進(jìn)行，通過(guò)對(duì)比結(jié)果確定具體的基因序列后，再將其翻譯成蛋白質(zhì)序列并注釋以驗(yàn)證基因組注釋是否正確。

s9.進(jìn)化分析

采用raxml(v8.1.5)軟件最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值為1000；采用的最優(yōu)核苷酸模型是gtr+g+i，最優(yōu)核苷酸模型為cprev+i+g+f。

s10.生物信息分析結(jié)果匯總

白僵菌線粒體基因組采用illuminahiseq2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，構(gòu)建pe測(cè)序文庫(kù)，最終匯總測(cè)序數(shù)據(jù)。

進(jìn)一步地，根據(jù)測(cè)序及數(shù)據(jù)對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖5所示，確定了廣東株白僵菌的種屬歸類(lèi)。

3、引物設(shè)計(jì)

基于完成的廣東株白僵菌線粒體rps3基因高通量測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)了多組引物，經(jīng)過(guò)初步篩選，確定了表1所示的6對(duì)引物組進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表1基于白僵菌線粒體rps3基因設(shè)計(jì)引物及序列信息

4、引物驗(yàn)證

(1)建立pcr擴(kuò)增體系和程序，如下所示：

表2pcr反應(yīng)體系(50μl體系)

pcr反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。

(2)pcr擴(kuò)增

以表1所示的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，引物組ⅰ，即引物組f935/r1385，能夠特異性的檢測(cè)白僵菌。

引物組f935/r1385的pcr擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示，泳道8(水空白對(duì)照)未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，說(shuō)明pcr反應(yīng)過(guò)程無(wú)污染現(xiàn)象，反應(yīng)結(jié)果可靠，pcr擴(kuò)增結(jié)果得到目的片段大小在500bp左右的電泳條帶?；趶V東株白僵菌線粒體rps3基因設(shè)計(jì)的引物組f935/r1385能夠?qū)Π捉┚?泳道1、2、3)及白僵菌血清型(泳道4)進(jìn)行擴(kuò)增，而不能對(duì)灰僵菌(泳道5)、曲霉(泳道6)、鐮刀霉(泳道7)等真菌進(jìn)行擴(kuò)增，則引物組f935/r1385可作為快速鑒別白僵菌的特異引物。

實(shí)施例212株地理株系白僵菌rps3基因的pcr擴(kuò)增

1、以12株地理株系白僵菌dna為模板，利用引物組f935/r1385進(jìn)行pcr擴(kuò)增，進(jìn)一步驗(yàn)證引物的有效性。

2、結(jié)果如圖7所示，泳道13(水空白對(duì)照)未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，說(shuō)明pcr反應(yīng)過(guò)程無(wú)污染現(xiàn)象，反應(yīng)結(jié)果可靠。12株地理株系白僵菌的pcr擴(kuò)增結(jié)果均得到了清晰的電泳條帶，目的片段大小均在500bp左右。通過(guò)圖7完成了對(duì)引物的有效性驗(yàn)證，該引物組f935/r1385可以作為鑒定白僵菌的特異引物。

3、進(jìn)一步地，還可繼續(xù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步確定結(jié)果?；?2株地理株系白僵菌rps3基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖8所示。

實(shí)施例3基于引物組f935/r1385鑒別市售僵蠶樣品中白僵菌的真?zhèn)?/p>

1、實(shí)驗(yàn)方法

(1)市售僵蠶總dna提取

樣品預(yù)處理：用70％乙醇擦拭白僵蠶表面后，放在玻璃皿中，并于37℃烘箱中使酒精揮發(fā)，用高速多功能粉碎機(jī)磨粉，裝于25ml滅菌塑料管中備用。

取適量僵蠶粉末，加入液氮充分研磨，使用購(gòu)自上海生工生物工程有限公司的真菌基因組快速提取試劑盒抽提白僵菌菌絲體總dna，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)不同產(chǎn)地市售僵蠶中白僵菌真?zhèn)舞b別

以中藥材僵蠶全基因組dna為模板，利用引物組f935/r1385進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

2、pcr擴(kuò)增結(jié)果如圖9所示，通過(guò)引物組f935/r1385對(duì)不同產(chǎn)地僵蠶的pcr擴(kuò)增結(jié)果可以看出，根據(jù)有無(wú)清晰的500bp目的電泳條帶，則可以判斷市售產(chǎn)地僵蠶樣品中是否含有白僵菌，從而對(duì)不同產(chǎn)地市售僵蠶中白僵菌的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。

3、進(jìn)一步地，還可繼續(xù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步確定結(jié)果，為僵蠶中白僵菌真?zhèn)舞b別的分子鑒定方法提供依據(jù)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真?zhèn)蔚姆肿予b定方法

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>引物f935

<400>1

agtgaattttccagatag18

<210>2

<211>18

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<213>引物r1385

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