本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種從巴山榧樹中分離出的內(nèi)生菌，命名為黑曲霉bp12±3，該菌株具有高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的特性，還涉及黑曲霉bp12±3在制備治療腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：紫杉醇(taxol)，國際通用名paclitaxel，是上世紀(jì)六十年代美國科學(xué)家從植物太平洋紅豆杉中分離提取的一種二萜類化合物，通過ⅱ-ⅲ臨床驗(yàn)證，證明具有良好的抗腫瘤作用，特別是對(duì)癌癥發(fā)病率較高的卵巢癌、子宮癌、乳腺癌等有特效，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效，是近年來在抗癌領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，已于1992年被美國食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)為治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌的新藥，并已上市。紫杉醇為白色結(jié)晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。分子式為c47h5lnol4，相對(duì)分子量為853.92，溶點(diǎn)為213～216℃(wanimc,taylorhl,wallme,etal.plantantitumoragents.vi.theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromtaxusbrevifolia[j].jamchemsoc,1971,93:2325～2327.)。經(jīng)研究表明，目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性物質(zhì)主要是紫杉烷二萜類化合物，多達(dá)7大類，100多種骨架。這為擴(kuò)大抗腫瘤范圍、半合成新藥，以避免抗藥性提供了更大的開發(fā)領(lǐng)域。紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的唯一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只能結(jié)合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白發(fā)生二聚體反應(yīng)。細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂。因此，紫杉醇能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。經(jīng)測定表明，紫杉醇在紅豆杉屬植物樹皮中的含量約為0.003％-0.069％，每提取1kg紫杉醇，要砍伐大約2000棵樹，即便將全部天然資源采伐，也只能滿足短期需要，且造成對(duì)森林和人類生存環(huán)境以及生物多樣性不可彌補(bǔ)的損失。因此，紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場的關(guān)鍵因素。紫杉醇內(nèi)生真菌的分離，是近年來發(fā)展起來的一種有效解決紫杉醇資源問題的新途徑。內(nèi)生菌(endophyte)一詞由debary(debarya,1866,morphologeandphysiologiederpilze,flechtenandmyxomyceten.engelman,leipzig,1-316.)首先提出，是指生活在植物組織內(nèi)存在的微生物，用以區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌(epiphyte)。petrini(petrinio,fungalendophytesoftreeleaves.in:andrewsjhhiranoandsseds.microbialecologyofleaves.newyorkspringer-verlag.1991,179-197.)將內(nèi)生菌定義為在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌，這個(gè)定義包括那些在其生活史中的某一階段營表面生的腐生菌，對(duì)宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原菌(latentpathogens)和菌根菌。1993年，strobel等從短葉紅豆杉(t.brevifoia)中分離篩選出了一株內(nèi)生真菌(taxomycesandreanae)，發(fā)現(xiàn)它竟然能夠在離體培養(yǎng)的時(shí)候合成紫杉醇，產(chǎn)率達(dá)到24-50μg/l。同時(shí)strobel認(rèn)為，內(nèi)生真菌之所以要合成紫杉醇，可能與抵抗由根部侵入的真菌作用有關(guān)，同時(shí)更好的模擬寄主的化學(xué)環(huán)境，在種間競爭中獲得優(yōu)勢(shì)(stierlea,stierled,strobelg，eta1.,1994,endophytixfungiofpacificyew(taxus—brevifo1ia)asasourceoftaxol,taxanes,andotherpharmacophoresacssymposiumseries.557:64—77.)。這是一個(gè)全新的發(fā)現(xiàn)，無疑富有開創(chuàng)性。此后，各國科學(xué)家們相繼分離得到了多種能夠合成紫杉醇的內(nèi)生真菌，它們的產(chǎn)率高低不等。紫杉醇產(chǎn)生菌的宿主多見于裸子植物紅豆杉科(taxaceae)的紅豆杉屬(taxus)和澳洲紅豆杉屬(austrotaxus)中。前者廣泛分布于歐亞大陸和北美，如中國的東北三省、中原地區(qū)、云南、貴州、四川、西藏以及美國和加拿大等地區(qū)；在寒帶、溫帶及亞熱帶地區(qū)也有分布，極少成林，且生長緩慢。后者僅見于南半球，數(shù)量極少。如此可見，任何與紅豆杉屬植物存在物質(zhì)、能量交換的生物都有可能出現(xiàn)紫杉醇類次生代謝產(chǎn)物的遺傳基因傳遞，尤其是附生菌類最有可能。有研究表明，紅豆杉中的紫杉醇含量與其種屬無明顯的相關(guān)性，而與紅豆杉的產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。所以人們有待于從和紅豆杉有相同環(huán)境要求的其他植物中分離出更多的紫杉醇產(chǎn)生菌，而且紅豆杉樹的主干和側(cè)枝、枝條的樹皮、韌皮部以及皮下部分、根、成熟莖、果實(shí)及葉子中的內(nèi)生真菌的研究已有報(bào)道。野生型真菌產(chǎn)紫杉醇或類似物的含量普遍偏低，其產(chǎn)量均未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。迄今為止，產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌株主要從瀕危物種紅豆杉屬的植物中分離到的，卻忽略了紅豆杉科中其它屬植物。因?yàn)橛醒芯勘砻?，紅豆杉科榧屬植物中也發(fā)現(xiàn)有紫杉烷類化合物，但含量極低，紫杉醇含量低于0.003％，認(rèn)為藥用開發(fā)價(jià)值不大(易官美，邱迎春.榧樹的研究現(xiàn)狀與發(fā)展[j].資源與環(huán)境，2013，29(8)：844-848)。劉艷等從海南粗榧(cephalotaxushainanensisli)中分離到的產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的菌種，主要產(chǎn)生的可能抗腫瘤物質(zhì)是三尖杉酯堿類化合物(劉艷等.海南粗榧內(nèi)生真菌ch1307鑒定及其抗腫瘤活性研究[d].海南大學(xué),2012.蔣春潔.海南粗榧內(nèi)生真菌抗腫瘤活性菌株篩選[d].海南大學(xué),2014.)本發(fā)明從神農(nóng)架國家地質(zhì)森林公園巴山榧樹(紅豆杉科，榧屬；torreyafargesii)組織中分離出一株內(nèi)生真菌；通過高效液相色譜分析和抗腫瘤活性分析，篩選出產(chǎn)生紫杉醇或類似物次生代謝產(chǎn)物的菌種；并通過用液質(zhì)聯(lián)用儀(hplc-ms)進(jìn)行定性檢測，判斷該菌株產(chǎn)生的紫杉烷類化合物為巴卡亭ⅲ(baccatinⅲ)。通過微生物發(fā)酵的方法大量生產(chǎn)紫杉醇，有望改善目前紫杉醇價(jià)格昂貴、供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。即使其產(chǎn)量與植物中紫杉醇含量相當(dāng)或略低，但由于真菌發(fā)酵周期短(10～15天)，發(fā)酵規(guī)?？梢匀藶榭刂疲渖a(chǎn)能力大大優(yōu)于植物材料的生產(chǎn)能力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是在于提供了一種從巴山榧樹中分離出的內(nèi)生菌黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3，該菌株具有高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的特性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種黑曲霉bp12±3的培養(yǎng)方法，通過在培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)l-苯丙氨酸，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量可增長129.84％。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種黑曲霉bp12±3在制備治療腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，經(jīng)試驗(yàn)證明，黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物對(duì)hela腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨著紫杉醇的濃度的升高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：黑曲霉bp12±3的分離篩選，其步驟是：1、將巴山榧樹的根、莖、葉、樹皮分別用無菌水沖洗后，無菌吸水紙吸干，依次經(jīng)75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用無菌水沖洗，用無菌刀將采集到的根、莖和樹皮切成小段，取各部位的材料置于pda固體培養(yǎng)基平皿中，于28℃培養(yǎng)，待上述平皿中接種物切面邊緣長出細(xì)小菌絲，挑取菌絲轉(zhuǎn)接入新的pda固體平板上純化直至為純培養(yǎng)物；2、用菌絲尖端接種法將純化的真菌接種至pda平板上，28℃培養(yǎng)。記錄菌落大小、顏色、菌絲致密程度、菌落邊緣是否整齊、菌落生長速度以及產(chǎn)色素等菌落形態(tài)；3、用瓊脂塊法測定內(nèi)生真菌的抑菌活性：將待測供試細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)用lb培養(yǎng)基活化后，分別涂布于lb固體培養(yǎng)基表面，每個(gè)平皿中接種帶有瓊脂培養(yǎng)基的內(nèi)生菌，37℃培養(yǎng)1-2天，觀察瓊脂塊周圍的抑菌圈，如此獲得了一株同時(shí)具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和大腸桿菌(g-)活性的菌株，記為bp12±3；4、經(jīng)過平皿培養(yǎng)特性觀察該菌株菌落顏色呈暗黑色，菌落反面顏色黃至黃褐色，菌落質(zhì)地為絲絨狀，有放射性溝紋，顯微鏡下觀察，其分生孢子頭呈疏松放射狀，頂囊球形，直徑50-80μm，小梗雙層，?；?4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直徑3-4.5μm，鑒定為黑曲霉(aspergillusniger)，記為bp12±3；5、將菌株黑曲霉bp12±3在pda液體培養(yǎng)基中，180rpm、28℃活化3天，作為種子液，將種子液以5％(v/v)的接種量，接入pda液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)7-9天收獲發(fā)酵液；6、發(fā)酵結(jié)束后，收集濾液，濾液中加入1/3體積的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上層有機(jī)相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去有機(jī)溶劑，獲得脂溶性提取物，其含量約為120mg/l；7、高效液相色譜(hplc)發(fā)現(xiàn)脂溶性提取物中含有與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間基本一致的成分，測得保留時(shí)間為12.08min，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相近，表明其含有紫杉醇或類似物，其相對(duì)百分含量為10.5％；8、液質(zhì)聯(lián)用(hplc-ms)測定代謝抽提物中紫杉醇類似物的結(jié)構(gòu)，表明其母離子da為609.200，子離子da分別為549.200、367.000和427.100，源電壓均為146，碰撞能分別為34、40和40，與紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品完全一致，故判斷黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3產(chǎn)生的紫杉醇類似物為巴卡亭ⅲ。所述的巴山榧樹的組織中分離出來的黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期為2016年6月8日，保藏編號(hào)cctccno.m2016319，其特征是具有高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的特性，發(fā)酵液中巴卡亭ⅲ的含量達(dá)到12.6mg/l，抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。黑曲霉bp12±3高產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的培養(yǎng)方法：在pda培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)l-苯丙氨酸可增加巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)表明添加3.0mg/l的l-苯丙氨酸，可將黑曲霉bp12±3的巴卡亭ⅲ產(chǎn)量增長129.84％。黑曲霉bp12±3在治療抗腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用：通過cck-8法測定黑曲霉bp12±3的發(fā)酵液提取物對(duì)hela細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果表明隨著發(fā)酵液提取物濃度的升高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵液提取物的濃度為11.55μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到62.91％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：1、迄今為止，產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌株主要從瀕危物種紅豆杉屬的植物中分離，本發(fā)明是從巴山榧樹(紅豆杉科，榧屬)組織中分離的內(nèi)生真菌，這是又一例從紅豆杉屬以外的植物中分離到具有產(chǎn)生紫杉醇或類似物能力的植物內(nèi)生真菌，這大大擴(kuò)大了獲取產(chǎn)生紫杉醇或類似物菌種的資源范圍，有利于更廣泛地利用微生物資源。2、有研究報(bào)道，某些植物內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的能力并不穩(wěn)定，往往需要有前體物質(zhì)的存在，而本發(fā)明的植物內(nèi)生菌黑曲霉bp12±3可以非常穩(wěn)定地產(chǎn)生紫杉醇類似物，發(fā)酵液中紫杉醇類似物的粗提取物含量可達(dá)120mg/l，其中紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的相對(duì)百分含量為10.5％，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量約為12.6mg/l，高于現(xiàn)有技術(shù)已公開的產(chǎn)量；以l-苯丙氨酸為前體，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量可增長129.84％。3、采用cck-8試劑法檢驗(yàn)黑曲霉bp12±3對(duì)hela腫瘤細(xì)胞的抑制作用，表明所黑曲霉bp12±3發(fā)酵液的紫杉醇類似物對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨著紫杉醇的濃度的升高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)藥物濃度為0.1155μg/ml時(shí)，抑制率為29.82％，濃度增加到1.155μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到40.27％，當(dāng)濃度增加到11.55μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到62.91％。4、液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定性檢測，判斷該菌株產(chǎn)生的紫杉烷類化合物為巴卡亭ⅲ(baccatinⅲ)。這為擴(kuò)大抗腫瘤范圍、半合成新藥，以避免抗藥性等提供了更大的開發(fā)領(lǐng)域。5、利用本發(fā)明的植物內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇或類似物，可以不受資源、環(huán)境、條件、設(shè)備等的各種限制，短時(shí)間、大規(guī)模進(jìn)行生產(chǎn)。附圖說明圖1為黑曲霉bp12±3的菌苔，菌株bp12±3的菌落顏色呈暗黑色，菌落反面顏色黃至黃褐色，菌落質(zhì)地為絲絨狀，有放射性溝紋。圖2為黑曲霉bp12±3的顯微鏡照片圖，分生孢子頭呈疏松放射狀，頂囊球形，直徑50-80μm，小梗雙層，?；?4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直徑3-4.5μm。圖3為紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，箭頭所示峰為紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品。圖4為黑曲霉bp12±3的代謝抽提物中紫杉醇類似物的色譜圖，箭頭所示峰為紫杉醇類似物。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：巴山榧樹植物內(nèi)生菌的分離1、巴山榧樹材料的預(yù)處理于湖北省神農(nóng)架國家地質(zhì)森林公園采集巴山榧樹的根、莖、葉、樹皮，用無菌水沖洗后，用吸水紙吸干；分別經(jīng)75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然后用無菌水沖洗；將采集到的根、莖和樹皮切成大致約2-3cm的小段，葉片從中間切出剖面。2、巴山榧樹植物內(nèi)生菌的分離取預(yù)處理的各部位的材料置于pda固體培養(yǎng)基平皿，28℃培養(yǎng)，pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，水1000ml，ph自然，加瓊脂(15g/l)為pda固體培養(yǎng)基。3、巴山榧樹植物內(nèi)生菌的純化當(dāng)平皿中接種物切面邊緣長出細(xì)小菌絲時(shí)，挑取菌絲接入新配制pda固體平板上，在pda斜面培養(yǎng)基上純化幾次，直至得到純培養(yǎng)物。實(shí)施例2：內(nèi)生菌bp12±3抑菌活性檢測1、將待測供試細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)用lb液體培養(yǎng)基活化后，分別涂布于lb固體培養(yǎng)基表面；2、切下實(shí)施例1獲得的純化植物內(nèi)生菌瓊脂培養(yǎng)基塊，分別放置接種于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平皿中，37℃培養(yǎng)1-2天，觀察瓊脂塊周圍的抑菌圈，通過上述方法，篩選獲得一株同時(shí)具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和大腸桿菌(g-)活性的菌株，記為bp12±3。實(shí)施例3：內(nèi)生真菌bp12±3的鑒定經(jīng)過平皿培養(yǎng)特性觀察(圖1)，該菌株菌落顏色呈暗黑色，菌落反面顏色黃至黃褐色，菌落質(zhì)地為絲絨狀，有放射性溝紋；顯微鏡下觀察(圖2)，其分生孢子頭呈疏松放射狀，頂囊球形，直徑50-80μm，小梗雙層，梗基(4-6μm)×(2-3μm)，分生孢子球形，直徑3-4.5μm。根據(jù)《中國真菌志第五卷曲霉屬及其相關(guān)有性型》(齊祖同主編，中國真菌志(第五卷)曲霉屬及其相關(guān)有性型[m].北京：科學(xué)出版社，1997，5～10.)可初步鑒定為黑曲霉(aspergillusniger)bp12±3。實(shí)施例4：黑曲霉bp12±3發(fā)酵液中脂溶性物質(zhì)提取1、將實(shí)施例2獲得的植物內(nèi)生菌黑曲霉bp12±3于pda液體培養(yǎng)基中活化(活化條件：28℃，180rpm，培養(yǎng)5-7天)，作為種子液；2、按照5％(v/v)的接種量接入pda液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，培養(yǎng)7-10天；3、過濾收集濾液，濾液中加入1/3體積的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上層有機(jī)相；4、于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35℃除去有機(jī)溶劑，用甲醇溶解粘在壁上的物質(zhì)并揮發(fā)干燥，通過重量法測定發(fā)酵液粗取物含量；其中內(nèi)生菌bp12±3發(fā)酵液粗取物含量平均約為120mg/l。實(shí)施例5：高效液相色譜(hplc)定量檢測黑曲霉bp12±3含紫杉醇類似物代謝活性物質(zhì)1、實(shí)施例4中獲得的脂溶性物質(zhì)及流動(dòng)相處理：將實(shí)施例4獲得的濃縮產(chǎn)物13200r/min離心2min，吸取上清液，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾除去雜質(zhì)，然后同配好的流動(dòng)相(甲醇/水＝65/35，v/v)一起超聲波排氣，時(shí)間分別為3min、10～15min；2、色譜條件為：色譜柱，ods(c18)柱4.6×250mm，5nm；柱溫，常溫；樣品及流動(dòng)相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；樣品進(jìn)樣量，20μl；紫外檢測波長，227nm；3、測得紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(購自sigma)的rt(保留時(shí)間)為13～14min(圖3)；4、在實(shí)施例4制得的脂溶性提取物中發(fā)現(xiàn)與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的rt(保留時(shí)間)相似的成分(圖4)，出峰時(shí)間為12.8min，可將內(nèi)生菌bp12±3代謝活性物質(zhì)鑒定為紫杉醇類似物；5、使用hplc伍豐液相色譜工作站軟件根據(jù)色譜圖測算出bp12±3代謝抽提物中紫杉醇類似物的相對(duì)峰面積為29445.61，相對(duì)百分含量為10.5％。實(shí)施例6：黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物對(duì)hela腫瘤細(xì)胞的抑制作用1、取對(duì)數(shù)生長期的hela細(xì)胞(華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)鋪板，將細(xì)胞按100μl/孔(1～5×103個(gè)細(xì)胞/孔)接種于96孔板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；2、將實(shí)施例4制備的含紫杉醇類似物的黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物配置不同濃度(表1)，取10μl分別加入樣品孔中(1～5×103個(gè)細(xì)胞/孔)，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；3、取出培養(yǎng)板，吸去上清，每孔加入90μl新鮮培養(yǎng)液(含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液)和cck-810μl，同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h；4、用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光值(a450值)，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率計(jì)算：hela細(xì)胞抑制率(ir)＝(對(duì)照孔a值—樣品孔a值)/對(duì)照孔a值×100％(表1)。通過上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉bp12±3發(fā)酵液粗取物對(duì)hela腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，抑制作用與提取物濃度呈正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)藥物濃度為0.1155μg/ml時(shí)，抑制率為29.82％，濃度增加到1.155μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到40.27％，當(dāng)濃度增加到11.55μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到62.91％。表1黑曲霉bp12±3發(fā)酵液提取物對(duì)hela細(xì)胞的抑制作用實(shí)施例7：液質(zhì)聯(lián)用儀(hplc-ms)確定bp12±3發(fā)酵液中紫杉醇類似物為巴卡亭ⅲ1、液相色譜儀器型號(hào)：島津lc-30auplc(1)樣品及流動(dòng)相處理：將實(shí)施例4制備的脂溶性濃縮產(chǎn)物13200r/min離心2min，吸取上清液，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾除去雜質(zhì)，然后同配好的流動(dòng)相(乙腈/水＝65/35，v/v)一起超聲波排氣，時(shí)間分別為3min、10～15min；(2)色譜條件為：色譜柱，ods(c18)柱4.6x250mm，5nm；柱溫，常溫；樣品及流動(dòng)相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；樣品進(jìn)樣量，20μl；紫外檢測波長，227nm；2、質(zhì)譜儀器型號(hào)為absciex4500qqq(三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀)利用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)實(shí)施例4中提取的和實(shí)施例5中初步鑒定的紫杉醇類似物進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定(表2)，表明其母離子da為609.200，子離子da分別為549.200、367.000和427.100，源電壓均為146，碰撞能分別為34、40和40，與紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。由此，可將內(nèi)生菌bp12±3產(chǎn)生的紫杉醇類似物定性為巴卡亭ⅲ。表2巴卡亭ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品及bp12±3紫杉醇類化合物質(zhì)譜分析參數(shù)q1mass(da)q3mass(da)dpcedwell(msec)609.200549.2001463450609.200367.0001464050609.200427.1001464050實(shí)施例8：不同前體物質(zhì)對(duì)黑曲霉bp12±3產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的影響1、配制苯甲酸鈉、乙酸鈉、l-苯丙氨酸3種前體溶液，在0.08mpa下滅菌20min；2、將黑曲霉bp12±3接種于pda液體培養(yǎng)基，28℃，180rpm，發(fā)酵培養(yǎng)至第5天，將3種前體分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中一瓶不加任何前體做為對(duì)照，前體添加量分別為l-苯丙氨酸終濃度3.0mg/l，乙酸鈉終濃度3.5g/l，苯甲酸鈉終濃度32.0mg/l；3、每種發(fā)酵培養(yǎng)基中均補(bǔ)加蔗糖溶液，終濃度5.0g/l；4、培養(yǎng)至第8天，通過實(shí)施例4所述的方法提取黑曲霉bp12±3代謝粗產(chǎn)物并采用高效液相色譜(hplc)對(duì)代謝抽提物中紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ進(jìn)行定性和定量檢測，并計(jì)算紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ增長率，結(jié)果見表3。以l-苯丙氨酸為前體，巴卡亭ⅲ的產(chǎn)量增加最多，增長率為129.84％。結(jié)果表明，l-苯丙氨酸能夠作為一種有效的前體物質(zhì)，用于培養(yǎng)黑曲霉bp12±3并高效生產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ。表3不同前體對(duì)黑曲霉bp12±3產(chǎn)紫杉烷類化合物巴卡亭ⅲ的影響當(dāng)前第1頁12