本發(fā)明涉及食用菌育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種利用雙向核遷移技術(shù)選育淺黃色金針菇的選育方法。

背景技術(shù)：

金針菇[flammlinavelutipes(fr.)sing.]，英文名為wintermushroom、goldenmushroom，俗稱構(gòu)菌、樸菇、冬菇、毛柄金線菌、凍菌、金菇、益智菇等，在分類學(xué)上隸屬擔(dān)子菌門（basidiomycota）、擔(dān)子菌綱（basidiomycetes）、傘菌目（agaricales）、白蘑科（tricholomataceae）、小火焰菌屬（flammulina），是世界上繼雙孢蘑菇之后的第二大工廠化生產(chǎn)食用菌種類。我國(guó)金針菇商業(yè)化栽培已有30多年的歷史。目前我國(guó)金針菇的主要生產(chǎn)模式已從原來袋栽轉(zhuǎn)變?yōu)槠吭怨S化生產(chǎn)，近年來，隨著市場(chǎng)需求的變化，產(chǎn)品同質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重，通過品種選育方法，選育具有特色的金針菇品種是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。然而，目前我國(guó)金針菇育種中存在的問題：一是我國(guó)現(xiàn)有金針菇品種來源于國(guó)外引進(jìn)或野生馴化種，遺傳背景較窄，很難通過傳統(tǒng)育種方法實(shí)現(xiàn)品種種性改良；二是對(duì)金針菇細(xì)胞質(zhì)遺傳的分析不夠，導(dǎo)致種性恢復(fù)和種性改良工作嚴(yán)重滯后。

食用菌是有性生殖的真核生物，有性生殖的真核生物中的線粒體遺傳對(duì)于生物生長(zhǎng)和發(fā)育來講是至關(guān)重要的，選擇不同細(xì)胞質(zhì)或是線粒體基因突變有時(shí)會(huì)對(duì)真菌子代種質(zhì)性狀產(chǎn)生非常明顯的影響（basse2010）。加拿大著名的真菌學(xué)家布勒（buller1931）在白絨鬼傘中發(fā)現(xiàn)存在布勒現(xiàn)象，即一些擔(dān)子菌的單核菌絲會(huì)被同種雙核菌絲雙核化，后又稱為雙單雜交或非對(duì)稱雜交。之后，雙-單雜交被廣泛應(yīng)用于大型擔(dān)子菌的遺傳和育種研究中。callac等人分析比較了雙孢蘑菇中五種繁衍后代的方式，結(jié)果表明通過布勒現(xiàn)象有5%的可能性獲得具有不同細(xì)胞質(zhì)的有活力的后代（callacetal.,2006）。aanen發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌菌絲單-單雜交時(shí)細(xì)胞核遷移的速度遠(yuǎn)快于細(xì)胞分裂的速度，并提出利用布勒現(xiàn)象可獲得異質(zhì)菌株的實(shí)驗(yàn)方法（aanen,2008）。roberts&gladfelter（2015）和dundon（2016）等人的近期研究結(jié)果也表明真菌細(xì)胞質(zhì)會(huì)對(duì)于細(xì)胞核自治、基因表達(dá)、基因突變與進(jìn)化產(chǎn)生重要影響。上述研究表明：利用申請(qǐng)人已建立的雙向核遷移技術(shù)選育淺黃色金針菇是合理可行的方法之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)目前金針菇生產(chǎn)存在的品種選育問題，提供一種淺黃色金針菇的選育方法，該方法利用我國(guó)金針菇種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)，采用雙向核遷移技術(shù)和單菌絲純化方法，選育出了淺黃色金針菇新品種。

本發(fā)明淺黃色金針菇品種的選育方法，包括如下步驟：

（1）種菇采集選取白色金針菇品種和黃色金針菇品種的典型種菇進(jìn)行孢子印收集；

（2）培養(yǎng)基制備用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml配制pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿和pda斜面培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)皿直徑90mm；

（3）單孢分離從步驟（1）制備的孢子印中用接種環(huán)勾取孢子印，采用稀釋涂布的方法接種于步驟（2）制備的pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，倒置，24℃避光培養(yǎng)3天，在體式顯微鏡下挑取萌發(fā)的單個(gè)孢子轉(zhuǎn)接入pda斜面培養(yǎng)基中；

（4）單核菌絲獲取從步驟（3）制備的pda斜面培養(yǎng)基中挑取單孢菌絲，24℃避光培養(yǎng)8~10天，挑取少許菌絲制片，并置于顯微鏡下鏡檢，剔除有鎖狀聯(lián)合的異核菌絲，獲得單核純單核菌絲；

（5）單核菌絲極性測(cè)定采用常規(guī)單單雜交的方法，依據(jù)單核菌絲間配對(duì)雜交線是否有鎖狀聯(lián)合，對(duì)挑取的無鎖狀聯(lián)合的菌絲進(jìn)行極性測(cè)定，通過多輪配對(duì)最終分別獲得白色和黃色金針菇品種的4個(gè)不同極性類型的單核菌絲；

（6）單單菌株配對(duì)雜交首先將來源于不同雙核菌株的可以配對(duì)的不同極性單核菌株接種于步驟（3）制備的pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中央，24℃避光培養(yǎng)8~10d，觀察每個(gè)菌株的生長(zhǎng)勢(shì)，先將生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株用直徑5mm的打孔器轉(zhuǎn)接于新的pda培養(yǎng)皿一側(cè)2/3處，24℃避光培養(yǎng)3~5d，再在同一pda培養(yǎng)皿的另一側(cè)用同樣的工具和方法接入生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的單核菌株，兩個(gè)菌種塊間相距20-23mm，繼續(xù)培養(yǎng)15~20d；

（7）雙向核遷移與同核異質(zhì)菌株獲得從步驟（6）的菌落中，分別挑取雜交菌落遠(yuǎn)離雜交線的兩邊菌絲置于熒光正置顯微鏡下觀察，將有鎖狀聯(lián)合的菌絲轉(zhuǎn)接于新的pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中央，24℃避光培養(yǎng)8~10d后，在光學(xué)顯微鏡下挑取菌落邊緣的單根菌絲進(jìn)行相應(yīng)菌株純化，進(jìn)而獲得相應(yīng)的分別具有黃色菌株細(xì)胞質(zhì)和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株；

（8）雙-單雜交與細(xì)胞質(zhì)純化將步驟（7）獲得的同核異質(zhì)菌株和相應(yīng)的單核菌株分別接種于pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿a中央，24℃避光培養(yǎng)10d后，先將培養(yǎng)皿a中生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株用直徑5mm的打孔器接種于pda培養(yǎng)皿b的中央，24℃避光培養(yǎng)3~5d，再在pda培養(yǎng)皿b一側(cè)的1/3處，接入在步驟7中遠(yuǎn)離雜交線在該單核菌株一側(cè)獲得的同核異質(zhì)菌株，兩個(gè)菌種塊間相距30-32mm，繼續(xù)培養(yǎng)10~15d后挑取單核菌落遠(yuǎn)離雜交線一側(cè)的菌絲，置于熒光正置顯微鏡下觀察，將有鎖狀聯(lián)合的菌絲分別轉(zhuǎn)接于pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿c的中央，24℃避光培養(yǎng)8~10d后，在光學(xué)顯微鏡下挑取菌落邊緣的單根菌絲進(jìn)行相應(yīng)菌株純化，進(jìn)而獲得相應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步純化的分別具有黃色菌株細(xì)胞質(zhì)和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株；

（9）同核異質(zhì)菌株生物學(xué)差異檢測(cè)與可孕性驗(yàn)證將步驟（8）獲得的同核異質(zhì)菌株采用菌落形態(tài)觀察和分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)生物學(xué)差異，并將相應(yīng)同核異質(zhì)菌株轉(zhuǎn)接于出菇培養(yǎng)基，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的可孕性；

（10）淺黃色金針菇菌株獲取選取步驟（9）出菇試驗(yàn)獲得的同核異質(zhì)菌株子實(shí)體，重復(fù)步驟（1）~（5），從而獲得分別具有白色菌株的細(xì)胞核和黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的單核菌株和黃色菌株的細(xì)胞核和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的單核菌株，然后采用步驟（5）獲得的單核菌絲進(jìn)一步確定新獲得的單核菌株的具體交配類型，并采用已建立的雙向核遷移、純化和鑒定技術(shù)，分別獲得具有白色菌株細(xì)胞核和黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的白核黃質(zhì)菌株，及其相應(yīng)黃色菌株細(xì)胞核和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的黃核白質(zhì)菌株，并依次編號(hào)，之后，對(duì)獲得的白核黃質(zhì)菌株和黃核白質(zhì)菌株進(jìn)行了菌落形態(tài)觀察、分子標(biāo)記鑒定和出菇試驗(yàn)，并測(cè)定其農(nóng)藝學(xué)性狀與栽培性狀，進(jìn)而篩選出符合生產(chǎn)需求的白核黃質(zhì)和黃核白質(zhì)的淺黃色金針菇菌株。

所述步驟（9）中的出菇培養(yǎng)基為：籽殼34.5%，麩皮31%，玉米芯33%，輕質(zhì)碳酸鈣1.5%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：（1）本發(fā)明是一種基于金針菇雜交時(shí)存在的雙向核遷移現(xiàn)象和布勒現(xiàn)象，通過調(diào)節(jié)不同極性單核菌株的活性和菌絲純化，從而實(shí)現(xiàn)菌株間的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)替換，進(jìn)而選育出淺黃色金針菇品種的方法。（2）通過本發(fā)明方法選育的金針菇菌株為淺黃色，抗逆性強(qiáng)，填補(bǔ)了目前金針菇尚無淺黃色菌株的空白，可以進(jìn)一步滿足我國(guó)金針菇產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的特色化品種需求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明種菇采集原始白色金針菇品種。

圖2為本發(fā)明種菇采集原始黃色金針菇品種。

圖3為本發(fā)明單孢菌株萌發(fā)pda斜面培養(yǎng)基。

圖4為本發(fā)明雙向核遷移菌株生長(zhǎng)圖。

圖5為本發(fā)明純化的單根菌絲萌發(fā)。

圖6為本發(fā)明雙核菌株純化和單向核遷移菌株生長(zhǎng)圖。

圖7為本發(fā)明具有黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株菌落形態(tài)圖。

圖8為本發(fā)明具有白色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株菌落形態(tài)圖。

圖9為本發(fā)明同核異質(zhì)菌株srapme4-em12擴(kuò)增圖譜。

圖10為本發(fā)明具有白色菌株細(xì)胞核和黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的白核黃質(zhì)菌株菌落形態(tài)圖。

圖11為本發(fā)明具有黃色菌株細(xì)胞核和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的黃核白質(zhì)菌株菌落形態(tài)圖。

圖12為本發(fā)明白核黃質(zhì)菌株出菇圖。

圖13為本發(fā)明黃核白質(zhì)菌株出菇圖。

圖中：1、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的單核菌株，2、生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株，3、雜交線，4、遠(yuǎn)離雜交線的生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的單核菌株一側(cè)的菌絲，5、遠(yuǎn)離雜交線的生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株一側(cè)的菌絲，6、單核菌株，7、同核異質(zhì)菌株，8、單核菌落遠(yuǎn)離雜交線一側(cè)的菌絲，9、dl2000marker，10、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的單核菌株dna的srapme4-em12擴(kuò)增圖譜，11、具有黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株dna的srapme4-em12擴(kuò)增圖譜，12、具有白色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株dna的srapme4-em12擴(kuò)增圖譜，13、生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株dna的srapme4-em12擴(kuò)增圖譜，14、srapme4-em12擴(kuò)增的差異dna多態(tài)性條帶。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

利用本發(fā)明方法選育淺黃色金針菇品種，包括如下步驟：

（1）種菇采集選取白色金針菇品種（見圖1）和黃色金針菇品種（見圖2）的典型種菇進(jìn)行孢子印收集；

（2）培養(yǎng)基制備用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml配制pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿和pda斜面培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)皿直徑90mm；

（3）單孢分離從步驟（1）制備的孢子印中用接種環(huán)勾取孢子印，采用稀釋涂布的方法接種于步驟（2）制備的pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，倒置，24℃避光培養(yǎng)3天，在體式顯微鏡下挑取萌發(fā)的單個(gè)孢子轉(zhuǎn)接入pda斜面培養(yǎng)基中（見圖3）；

（4）單核菌絲獲取從步驟（3）制備的pda斜面培養(yǎng)基中挑取單孢菌絲，24℃避光培養(yǎng)8~10天，挑取少許菌絲制片，并置于顯微鏡下鏡檢，剔除有鎖狀聯(lián)合的異核菌絲，獲得單核純單核菌絲；

（5）單核菌絲極性測(cè)定采用常規(guī)單單雜交的方法，依據(jù)單核菌絲間配對(duì)雜交線是否有鎖狀聯(lián)合，對(duì)挑取的無鎖狀聯(lián)合的菌絲進(jìn)行極性測(cè)定，通過多輪配對(duì)最終分別獲得白色和黃色金針菇品種的4個(gè)不同極性類型的單核菌絲；

（6）單單菌株配對(duì)雜交首先將來源于不同雙核菌株的可以配對(duì)的不同極性單核菌株接種于步驟（3）制備的pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中央，24℃避光培養(yǎng)8~10d，觀察每個(gè)菌株的生長(zhǎng)勢(shì)，先將生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株用直徑5mm的打孔器轉(zhuǎn)接于新的pda培養(yǎng)皿一側(cè)2/3處，24℃避光培養(yǎng)3~5d，再在同一pda培養(yǎng)皿的另一側(cè)用同樣的工具和方法接入生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的單核菌株，兩個(gè)菌種塊間相距20-23mm，繼續(xù)培養(yǎng)15~20d（見圖4）；

（7）雙向核遷移與同核異質(zhì)菌株獲得從步驟（6）的菌落中，分別挑取雜交菌落遠(yuǎn)離雜交線的兩邊菌絲（見圖4）置于熒光正置顯微鏡下觀察，將有鎖狀聯(lián)合的菌絲轉(zhuǎn)接于新的pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中央，24℃避光培養(yǎng)8~10d后，在光學(xué)顯微鏡下挑取菌落邊緣的單根菌絲進(jìn)行相應(yīng)菌株純化（見圖5），進(jìn)而獲得相應(yīng)的分別具有黃色菌株細(xì)胞質(zhì)和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株；

（8）雙-單雜交與細(xì)胞質(zhì)純化將步驟（7）獲得的同核異質(zhì)菌株和相應(yīng)的單核菌株分別接種于pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿a中央，24℃避光培養(yǎng)10d后，先將培養(yǎng)皿a中生長(zhǎng)勢(shì)弱的單核菌株用直徑5mm的打孔器接種于pda培養(yǎng)皿b的中央，24℃避光培養(yǎng)3~5d，再在pda培養(yǎng)皿b一側(cè)的1/3處，接入在步驟7中遠(yuǎn)離雜交線在該單核菌株一側(cè)獲得的同核異質(zhì)菌株，兩個(gè)菌種塊間相距30-32mm，繼續(xù)培養(yǎng)10~15d后挑取單核菌落遠(yuǎn)離雜交線一側(cè)的菌絲（見圖6），置于熒光正置顯微鏡下觀察，將有鎖狀聯(lián)合的菌絲分別轉(zhuǎn)接于pda無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)皿c的中央，24℃避光培養(yǎng)8~10d后，在光學(xué)顯微鏡下挑取菌落邊緣的單根菌絲進(jìn)行相應(yīng)菌株純化（見圖5），進(jìn)而獲得相應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步純化的分別具有黃色菌株細(xì)胞質(zhì)和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的同核異質(zhì)菌株；

（9）同核異質(zhì)菌株生物學(xué)差異檢測(cè)與可孕性驗(yàn)證將步驟（8）獲得的同核異質(zhì)菌株采用菌落形態(tài)觀察（見圖7，圖8）和分子標(biāo)記技術(shù)（見圖9）檢測(cè)生物學(xué)差異，并將相應(yīng)同核異質(zhì)菌株轉(zhuǎn)接于出菇培養(yǎng)基，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的可孕性；出菇培養(yǎng)基的組成成分為：籽殼34.5%，麩皮31%，玉米芯33%，輕質(zhì)碳酸鈣1.5%；

（10）淺黃色金針菇菌株獲取選取步驟（9）出菇試驗(yàn)獲得的同核異質(zhì)菌株子實(shí)體，重復(fù)步驟（1）~（5），從而獲得分別具有白色菌株的細(xì)胞核和黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的單核菌株和黃色菌株的細(xì)胞核和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的單核菌株，然后采用步驟（5）獲得的單核菌絲進(jìn)一步確定新獲得的單核菌株的具體交配類型，并采用已建立的雙向核遷移、純化和鑒定技術(shù)，分別獲得具有白色菌株細(xì)胞核和黃色菌株細(xì)胞質(zhì)的白核黃質(zhì)菌株，及其相應(yīng)黃色菌株細(xì)胞核和白色菌株細(xì)胞質(zhì)的黃核白質(zhì)菌株，并依次編號(hào)，之后，對(duì)獲得的白核黃質(zhì)菌株和黃核白質(zhì)菌株進(jìn)行了菌落形態(tài)觀察（見圖10，圖11）、分子標(biāo)記鑒定和出菇試驗(yàn)（見圖12，圖13），并測(cè)定其農(nóng)藝學(xué)性狀與栽培性狀，進(jìn)而篩選出符合生產(chǎn)需求的白核黃質(zhì)和黃核白質(zhì)的淺黃色金針菇菌株。