本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同步提取植物rna和多糖的方法。

背景技術(shù)：

富含保健或藥用多糖的藥材，特別是生境要求嚴(yán)格并生長緩慢的珍惜中藥材，由于糖對提取rna質(zhì)量的不良影響和樣品少而限制了這類藥材的研發(fā)和應(yīng)用。在這類藥材的研究中，也由于需要繁殖大量的材料取樣而增加了研發(fā)的人工、物料和時(shí)間的投入及費(fèi)用。因此，在通過植物育種增加這類藥材生長速度、糖含量和環(huán)境適應(yīng)性的同時(shí)，發(fā)展高效的生物技術(shù)，利用較少的樣品量完成多目標(biāo)的檢測和研究對該領(lǐng)域生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展乃至藥材的發(fā)掘和使用具有重要意義。

在中藥材研發(fā)中，基因表達(dá)和糖含量的動(dòng)態(tài)變化及可能的相關(guān)性通常通過相同處理?xiàng)l件下不同樣品或樣品的不同部位分別提取rna和糖，并將rna的分析結(jié)果及糖分析結(jié)果相互對照，作為該處理?xiàng)l件下糖含量和基因表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行分析并得出結(jié)論。但是，這種不同組織或部位的rna及糖的分別提取造成基因表達(dá)和糖含量的時(shí)空錯(cuò)位：不但不能嚴(yán)格地作為rna和糖在同一組織中（即原位）的真實(shí)對應(yīng)關(guān)系，而且也造成取材的浪費(fèi)以及對研究的微尺寸級別的限制。因此，發(fā)展一種嚴(yán)格意義上的原位的基因表達(dá)和糖含量的對應(yīng)的研究技術(shù)必須以同一處理的、同一樣品的、原位的rna和糖提取為基礎(chǔ)。

富含糖的植物材料經(jīng)常造成rna提取的阻礙，不僅影響rna提取的量，而且也影響rna提取和分離的最終質(zhì)量，因此，在實(shí)踐中改進(jìn)糖類植物樣品rna的高效提取方法具有重要技術(shù)和實(shí)用意義。目前尚未有高效的同步提取原位植物樣品rna和糖的技術(shù)。

在實(shí)施本專利技術(shù)時(shí)，培養(yǎng)基中所含的糖對糖含量影響可以是顯著的，因此沖洗掉或用其他方式剔除培養(yǎng)基及培養(yǎng)基中的糖和附加物對獲得測定結(jié)果正確性和穩(wěn)定性都是必要的。

用本發(fā)明提取的糖含量和傳統(tǒng)提取糖的方法要首先做好傳統(tǒng)提取的結(jié)果，最好是以大量的材料作出誤差較小的糖含量平均值，然后進(jìn)行同步提取的糖提取和測試，使結(jié)果誤差控制在測試設(shè)定的閾值，并存在穩(wěn)定的比例關(guān)聯(lián)關(guān)系。另外，根據(jù)每一種材料提取多糖的傳統(tǒng)方法提取結(jié)果和同步提取結(jié)果所測定的關(guān)聯(lián)比例系數(shù)可以不同，應(yīng)盡量獨(dú)立測試，按種類建立關(guān)聯(lián)比例系數(shù)，計(jì)算得出同步多糖提取的量值。由此，使同步提取技術(shù)實(shí)施時(shí)，植物樣品材料的量只要滿足提取rna，就可以滿足同步提取糖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同步提取植物rna和多糖的方法。該技術(shù)可作為完全對應(yīng)的嚴(yán)格意義上原位的基因表達(dá)和糖含量的對應(yīng)的研究技術(shù)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)同一處理的、同一樣品的、原位的rna和糖提取以及其分離和純化，使得精確的原位和瞬時(shí)檢測和同步研究糖的代謝動(dòng)態(tài)和基因表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1、傳統(tǒng)多糖提取步驟：

1）精確稱取待提取多糖的植物樣品材料，稱重，60℃48h烘干，稱重。（注意：樣品材料或烘干后稱其干重，或鮮重稱重后根據(jù)“多糖含量計(jì)算中干重的換算”方法計(jì)算其干重。一般植物樣品材料干重掌握在0.02g-0.04g之間，相應(yīng)植物樣品材料在研磨后的體積應(yīng)沒于提取液液面之下至少1/2處以下，否則要根據(jù)料液比例進(jìn)行相應(yīng)提取液的增減，以減少誤差和避免不可操作性）。烘干的植物樣品材料置于研缽中研磨成粉末轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，加1ml的mili-qh2o，沸水浴30min；

2）置離心機(jī)常溫，7830rpm/min，離心15min，取上清液轉(zhuǎn)至20ml刻度管；

3）沉淀加1mlmili-qh2o，沸水浴30min，7830rpm/min，離心15min，取上清液轉(zhuǎn)至20ml刻度管，該步驟重復(fù)一次；

4）1mlmili-qh2o漂洗殘?jiān)?830rpm/min，離心15min，取上清液轉(zhuǎn)至20ml刻度管；

5）上清液用mili-qh2o定容置10ml；

6）加5ml石油醚于溶液中，臺式恒溫振蕩器常溫200rpmmin-1，10min；7700rpm/min，離心15min，棄上層溶液；

7）下層溶液加氯仿:正丁醇溶液2ml，氯仿:正丁醇體積比5:1，混勻至乳濁狀，靜置分層10min后，7700rpm/min，離心10min；

8）取50μl上層溶液置20ml離心管中，mili-qh2o定容至2ml；

9）加1ml9wt.%苯酚溶液，搖勻；加5ml濃硫酸，搖勻，室溫下靜置30min，7700rpm/min，離心10min；

10）取3ml上清液于比色皿中，以mili-qh2o為對照，于分光光度計(jì)485nm處比色。

11）根據(jù)吸光值y、植物樣品干重w和標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax-b（x為糖濃度mg/l）計(jì)算得到所測植物樣品材料的多糖含量p1=[(y+b)/a*10*40*10^-3*10^-3]/干重（b1）*100。

12）多糖含量計(jì)算中干重的換算：在以傳統(tǒng)方法提取多糖時(shí)，精確稱量待提取多糖的植物樣品鮮重（a1）并放入精確稱量重量（w1）的容器中，烘干后稱量整體重量（w2），減除容器重量（w1），得到該植物樣品的干重（b1，b1=w2-w1）。根據(jù)c1=b1/a1計(jì)算出該植物樣品的干重/鮮重比例（c1），重復(fù)2-10次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差；至誤差在可允許范圍內(nèi)為衡量該稱重技術(shù)的成熟度。取平均值作為換算干重和鮮重比例的系數(shù)（c1）。

2、同步提取rna和多糖的方法步驟：

一種同步提取植物rna和多糖的方法，將水溶性rna提取液加入經(jīng)研磨或裂解處理后的植物樣品中，充分混合，經(jīng)離心，取上清液作為rna樣品進(jìn)行進(jìn)一步rna分離和純化；其剩余的液體和植物樣品殘留物作為糖提取樣品，進(jìn)一步進(jìn)行糖的提取和純化。

（1）提取植物rna的方法如下：

1）將經(jīng)液氮研磨成粉末狀的樣品轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，按每50-100mg樣品中加入1mltranszolup，經(jīng)勻漿儀混勻，室溫靜置5min；

2）接著按每使用1mltranszolup加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩30s，室溫孵育3min；

3）1000xg、4℃離心15min，rna在上層無色水相；

4）轉(zhuǎn)移約所用tranzolup試劑的50%上清液于新的離心管中，每使用1mltranzolup加入0.5ml異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫孵育10min；

5）10000xg、4℃離心10min，去上清，管側(cè)和管底形成膠裝沉淀；

6）加1ml由depc處理水所配制的75%乙醇，每使用1mltranzolup至少加入1ml75%乙醇，劇烈渦旋；

7）7500xg、4℃離心5min；

8）去上清（為了更好地控制rna中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇），室溫晾干沉淀5min；

9）沉淀溶于50-100μlrnasefreewater中；

10）55℃-60℃孵育10min；

11）保存rna于-70℃。

（2）提取植物多糖的方法如下：

1）將完成rna提取后殘?jiān)皬U夜收集在15ml離心管內(nèi)，加1ml的mili-qh2o，沸水浴30min；

2）置離心機(jī)常溫，7830rpm/min，離心15min，取上清液轉(zhuǎn)至20ml刻度管；

3）沉淀加1mlmili-qh2o，沸水浴30min，7830rpm/min，離心15min，取上清液至20ml刻度管，該步驟重復(fù)一次；

4）沉淀加1mlmili-qh2o漂洗殘?jiān)?830rpm/min離心15min，取上清液至20ml刻度管；

5）上清液用mili-qh2o定容置10ml；

6）加5ml石油醚于溶液中，臺式恒溫振蕩器常溫200rpmmin-1，10min；7700rpm/min，離心15min，棄上層溶液；

7）下層溶液加氯仿:正丁醇溶液2ml，氯仿:正丁醇體積比5:1，混勻至乳濁狀，靜置分層10min后，7700rpm/min，離心10min；

8）取50μl上層溶液置20ml離心管中，mili-qh2o定容至2ml；

9）加1ml9wt.%苯酚溶液，搖勻；加5ml濃硫酸，搖勻，室溫下靜置30min，7700rpm/min，離心10min；

10）取3ml上清液于比色皿中，以雙蒸水為空白對照于分光光度計(jì)485nm處比色。

11）根據(jù)吸光值y、植物樣品干重w和標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax-b（x為糖濃度mg/l）計(jì)算得到所測植物樣品材料的多糖含量p2=[(y+b)/a*10*40*10^-3*10^-3]/干重（b1）*100。

12）以同步提取rna和多糖的方法提取時(shí)，在rna和多糖提取前精確稱量植物樣品鮮重（a2），多糖同步提取中樣品干重質(zhì)量（b2）根據(jù)b2=a2*c1計(jì)算。多糖含量以常規(guī)多糖提取的測量值（p1）為標(biāo)準(zhǔn)，將同步提取法的多糖測量值（p2）與p1作出各種樣品的比例系數(shù)（c2,c2=p2/p1）,并以此算出同步提取方法多糖的測量讀數(shù)相當(dāng)于傳統(tǒng)方法提取多糖的多少量。每種樣品都進(jìn)行重復(fù)測試，取平均值，并至誤差在可允許范圍內(nèi)為衡量該提取步驟和技術(shù)的成熟度。

用本發(fā)明提取的糖含量和傳統(tǒng)提取糖的方法要首先做好傳統(tǒng)提取的結(jié)果，最好是以大量的材料作出誤差較小的糖含量平均值，然后進(jìn)行同步提取的糖提取和測試，使結(jié)果誤差控制在測試設(shè)定的閾值，并存在穩(wěn)定的比例關(guān)聯(lián)關(guān)系。另外，根據(jù)每一種材料提取多糖的傳統(tǒng)方法提取結(jié)果和同步提取結(jié)果所測定的關(guān)聯(lián)比例系數(shù)可以不同，應(yīng)盡量獨(dú)立測試，按種類建立關(guān)聯(lián)比例系數(shù)，計(jì)算得出同步多糖提取的量值。由此，使同步提取技術(shù)實(shí)施時(shí)，植物樣品材料的量只要滿足提取rna，就可以滿足同步提取糖。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：由于所提取的植物多糖和rna來源于同一個(gè)完全相同的植物材料，因此本發(fā)明為原位實(shí)時(shí)的糖動(dòng)態(tài)和基因表達(dá)的研究提供了時(shí)間、空間、物質(zhì)完全對應(yīng)的精確方法。同時(shí)，由于用同樣的材料同步提取rna和多糖，并且不必增加除了提取rna之外的被提取植物材料的量，因此避免了提取多糖需要另外提供的植物材料，從而節(jié)省了植物材料的取材，特別是像霍山石斛這種珍稀植物種類同時(shí)又是生長極其緩慢的植物材料，節(jié)省了近50%的人力、物力、財(cái)力，包括實(shí)驗(yàn)室資源和運(yùn)行投入，因此，本發(fā)明所提供的方法也是簡便、高效、環(huán)保的方法。

附圖說明

圖1：rna凝膠電泳示rna提取質(zhì)量。a：分子標(biāo)尺，b：原球莖rna，c：試管苗rna。

圖2：糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。a：標(biāo)準(zhǔn)曲線1（原球莖多糖測定）；b：標(biāo)準(zhǔn)曲線2（試管苗多糖測定）。

圖3：傳統(tǒng)提取糖及rna同步提取糖含量比例的關(guān)聯(lián)系數(shù)。a：原球莖多糖關(guān)聯(lián)系數(shù)；b：試管苗多糖關(guān)聯(lián)系數(shù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

植物材料：石斛原球莖

技術(shù)步驟：

1）將經(jīng)液氮研磨成粉末狀的樣品轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，按每80mg樣品中加入1mltranszolup，經(jīng)勻漿儀混勻，室溫靜置5min；

2）接著按每使用1mltranszolup加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩30s，室溫孵育3min；

3）1000xg，4℃離心15min，rna在上層無色水相；

4）轉(zhuǎn)移約所用tranzolup試劑的50%上清液于新的離心管中，每使用1mltranzolup加入0.5ml異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫孵育10min；

5）10000xg，4℃離心10min，去上清，管側(cè)和管底形成膠裝沉淀；

6）加1ml由depc處理水所配制的75%乙醇（每使用1mltranzolup至少加入1ml75%乙醇），劇烈渦旋；

7）7500xg，4℃離心5min；

8）去上清（為了更好地控制rna中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇），室溫晾干沉淀（約5min）；

9）沉淀溶于100μlrnasefreewater中；

10）60℃孵育10min；

11）進(jìn)行rna質(zhì)量檢測（如圖1b），保存rna樣品于-70℃。（至此，rna提取步驟結(jié)束）

12）將完成rna提取后殘?jiān)皬U夜收集在15ml離心管內(nèi)，加1ml的mili-qh2o，沸水浴30min；

13）置離心機(jī)常溫，7830rpm/min，離心15min，取上清液轉(zhuǎn)至20ml刻度管；

14）沉淀加1mlmili-qh2o，沸水浴30min，7830rpm/min離心15min，取上清液至20ml刻度管，該步驟重復(fù)一次；

15）沉淀加1mlmili-qh2o漂洗殘?jiān)?830rpm/min離心15min，取上清液至20ml刻度管；

16）上清液用mili-qh2o定容置10ml；

17）加5ml石油醚于溶液中，臺式恒溫振蕩器常溫200rpmmin^-1，10min；7700rpm/min，離心15min，棄上層溶液；

18）下層溶液加氯仿:正丁醇溶液2ml，氯仿:正丁醇體積比5:1，混勻至乳濁狀，靜置分層10min后，7700rpm/min，離心10min；

19）取50μl上層溶液置20ml離心管中，mili-qh2o定容至2ml；

20）加1ml9wt.%苯酚溶液，搖勻；加5ml濃硫酸，搖勻，室溫下靜置30min，7700rpm/min，離心10min；

21）取3ml上清液于比色皿中，以空白為對照，于分光光度計(jì)485nm處比色。

22）取石斛對應(yīng)糖提取方式進(jìn)行糖的測定，同時(shí)將相同培養(yǎng)條件下的同等培養(yǎng)物進(jìn)行本專利所述rna、糖同步提取方法，并根據(jù)糖提取量與同步提取糖含量做對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2a），根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出同步提取糖的糖含量表觀度數(shù)值，并通過同步提取與傳統(tǒng)提取的多糖比例關(guān)聯(lián)系數(shù)（圖3a）算出同步提取方法提取的糖的含量。

用本發(fā)明提取的糖含量和傳統(tǒng)提取糖的方法要首先做好傳統(tǒng)提取的結(jié)果，最好是以大量的材料作出誤差較小的糖含量平均值，然后進(jìn)行同步提取的糖提取和測試，使結(jié)果誤差控制在測試設(shè)定的閾值，并存在穩(wěn)定的比例關(guān)聯(lián)關(guān)系。另外，根據(jù)每一種材料提取多糖的傳統(tǒng)方法提取結(jié)果和同步提取結(jié)果所測定的關(guān)聯(lián)比例系數(shù)可以不同，應(yīng)盡量獨(dú)立測試，按種類建立關(guān)聯(lián)比例系數(shù)，計(jì)算得出同步多糖提取的量值。由此，使本技術(shù)步驟1）中所述在液氮環(huán)境中研磨成粉末的材料的量只要滿足提取rna，就可以滿足同步提取糖。

實(shí)施例二

植物材料：石斛試管苗

技術(shù)步驟：提取測定步驟同實(shí)施例一，按照同步提取rna的方式，以凝膠電泳檢測rna提取質(zhì)量（圖1c）。

1）糖標(biāo)曲的制作：精密稱取蔗糖干燥樣品100mg，去離子水定容1000ml，分別取0.05ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml加水mili-qh2o定容至2ml，再依次加1ml9%苯酚溶液，搖勻，然后加5ml濃硫酸搖勻，室溫下靜置30min，待冷卻至室溫，7700rpm/min，離心10min；以mili-qh2o空白為對照，在485nm波長下比色測定吸光值，制作糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）按傳統(tǒng)提取多糖和同步提取兩種方式各測得糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2b）。

3）以上述糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制做方式，測試樣品糖含量，建立多糖比例關(guān)聯(lián)系數(shù)（圖3b），得到同步提取多糖含量的量值。

4）根據(jù)每一種材料按上述步驟獲得各材料的rna和多糖，并計(jì)算得到多糖含量的量值。

實(shí)施例三

植物材料：固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)的石斛愈傷組織

技術(shù)步驟：同實(shí)施例一，但需將培養(yǎng)物在去離子水中（室溫下）經(jīng)振蕩器充分震蕩除去培養(yǎng)基。檢測rna質(zhì)量，測得多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測得多糖比例關(guān)聯(lián)系數(shù)。根據(jù)每一種材料提取多糖的傳統(tǒng)方法提取結(jié)果和同步提取結(jié)果所測定的比例計(jì)算得出同步多糖提取的量值。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。