本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種區(qū)分巰基化合物的反應(yīng)型熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光分析法具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好、實(shí)時(shí)檢測(cè)以及對(duì)生物體損傷小等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。醫(yī)學(xué)證明體內(nèi)某些氨基酸濃度的變化與人體健康息息相關(guān)，如cys缺乏導(dǎo)致皮膚損傷、生長緩慢和頭發(fā)脫色等病癥，而hcy濃度的異常則會(huì)引起心血管疾病、骨質(zhì)疏松和炎癥性腸病等。因此對(duì)氨基酸的檢測(cè)和定量十分重要。然而，由于cys、hcy結(jié)構(gòu)相似，活性相近，大多數(shù)探針根據(jù)兩者的五元或六元環(huán)的活性不同實(shí)現(xiàn)對(duì)cys或者h(yuǎn)cy的專一性識(shí)別(aabhabarve,marklowry,jorgeo.escobedo,katherinet.huynh,lovemorehakunaandrobertm,strongin.differencesinheterocyclebasicitydistinguishhomocysteinefromcysteineusingaldehyde-bearingfluorophores.chem.commun.2014,50,8219-8222；hyeyeonlee,yoonpyochoi,sunkyungkim,taejinyoon,zhiqianguo,songyilee,k.m.k.swamy,gyougmikim,jinyonglee,injaeshinandjuyoungyoon.selectivehomocysteineturn-onfluorescentprobesandtheirbioimagingapplications.2014,50,6967-6969；lijuntang,jianzeshi,zhenlonghuang,xiaomeiyan,qiangzhang,kelizhong,shuhuahouandyanjiangbian.anesipt-basedfluorescentprobeforselectivedetectionofhomocysteineanditsapplicationinlive-cellimaging.2016,57,5227-5231.)，但是能夠同時(shí)有效區(qū)分它們的熒光探針還未見報(bào)道。

因此，需要提供一種簡便快速、同時(shí)有效區(qū)分cys、hcy的熒光探針具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種區(qū)分巰基化合物的反應(yīng)型熒光探針，該熒光探針生物相容性好，分子量小，而且可以成功用于細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸和高胱氨酸的成像，對(duì)于一定濃度范圍的巰基化合物的測(cè)定提供了一種簡便快速的方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述反應(yīng)型熒光探針的合成方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述反應(yīng)型熒光探針的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明區(qū)分巰基化合物的反應(yīng)型熒光探針，該熒光探針具有式(i)所示結(jié)構(gòu)：

其中，其中，r1、r2、r3、r4各自獨(dú)立的選自氫﹑1-8個(gè)碳原子的烷基、3-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基中的一種，x獨(dú)立的選自鹵素；或者，其中相鄰的取代基(r1與r4和/或r2與r3)可以成環(huán)，優(yōu)選的，所述成環(huán)為成5-7元環(huán)。

進(jìn)一步，所述的r1、r2、r3、r4中的1-8個(gè)碳原子的烷基分別或者同時(shí)為甲基，乙基，丙基，烯丙基，異丙基，丁基，異丁基，戊基，己基，亞甲基和二亞甲基中的一種；

所述的r1﹑r2、r3、r4中的3-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基分別或者同時(shí)為環(huán)丙烷基，環(huán)丁烷基，環(huán)戊烷基，環(huán)己烷基和環(huán)庚烷基中的一種；

所述鹵素為氟、氯、溴和碘中一種。

本發(fā)明還公開了上述區(qū)分巰基化合物的反應(yīng)型熒光探針的合成方法，包括以下步驟：

1)將帶有r1，r2，r3，r4和x取代基的香豆素-3-羰基化合物和(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基三苯基溴化膦溶于ch2cl2中，攪拌，得到溶液a；

2)在溶液a中加入naoh溶液，攪拌，得到溶液b；

3)在溶液b中加入濃hcl，攪拌，旋干ch2cl2溶劑，得到探針粗品，用柱層析硅膠分離，得到具有式(i)所示的結(jié)構(gòu)的探針。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述帶有r1，r2，r3，r4和x取代基的香豆素-3-羰基化合物和(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基三苯基溴化膦的摩爾比為1:1-1:3。

進(jìn)一步，所述帶有r1，r2，r3，r4和x取代基的香豆素-3-羰基化合物與naoh的摩爾比為1:2-1:8；所述naoh溶液的濃度為0.3g/ml。

進(jìn)一步，所述濃hcl的濃度為1.19g/ml；所述naoh溶液與濃hcl的體積比為1:1-1:5。

在本發(fā)明中，步驟1)所述攪拌的時(shí)間為0.5-1h；步驟2)所述攪拌的時(shí)間為8-10h；步驟3)所述攪拌的時(shí)間為20-30min。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述區(qū)分巰基化合物的反應(yīng)型熒光探針在生物體系中生物活性巰基化合物檢測(cè)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述生物活性巰基化合物為半胱氨酸和高胱氨酸。

進(jìn)一步，所述區(qū)分巰基化合物的反應(yīng)型熒光探針是對(duì)血液、細(xì)胞、生物活組織內(nèi)和病變組織中的半胱氨酸和高胱氨酸的分析檢測(cè)和熒光成像檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果如下：

現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)半胱氨酸和高胱氨酸的熒光探針大都均能與二者反應(yīng)，產(chǎn)生相同的熒光信號(hào)，或者二者其中一個(gè)有熒光信號(hào)，另一個(gè)沒有熒光信號(hào)。本發(fā)明反應(yīng)型熒光探針分子量小，熒光量子產(chǎn)率較高，具有很好的細(xì)胞相容性，與半胱氨酸和高胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)生不同的增強(qiáng)的熒光信號(hào)，通過不同波長激發(fā)能夠同時(shí)檢測(cè)半胱氨酸和高胱氨酸，用一個(gè)探針即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中半胱氨酸和高胱氨酸的檢測(cè)。同時(shí)探針穩(wěn)定性好，制備方法簡單易行。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出在400nm激發(fā)波長下，熒光探針(i-1)對(duì)三種巰基化合物的熒光響應(yīng)圖。

圖2示出在450nm激發(fā)波長下，熒光探針(i-1)對(duì)三種巰基化合物的熒光響應(yīng)圖。

圖3示出熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物活性巰基化合物熒光成像圖。

圖4示出熒光探針(i-5)對(duì)三種巰基化合物的熒光響應(yīng)圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1熒光探針(i-1)的合成

熒光探針(i-1)的合成方法，包括以下步驟：

將0.8mm7-久洛尼定香豆素-3-醛和1mm(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基三苯基溴化膦溶于8ml干ch2cl2中，室溫下攪拌0.5h；然后緩慢加入0.5ml的0.3g/mlnaoh溶液，室溫?cái)嚢?h；再加入1ml的濃hcl，攪拌20min，旋干溶劑，得到橙黃色探針粗品，用柱層析硅膠分離，得到熒光探針(i-1)，esi-ms:m/z[c18h16clno3+h]⁺:330.1。

實(shí)施例2熒光探針(i-2)的合成

熒光探針(i-2)的合成方法，包括以下步驟：

將0.8mm7-n,n-二乙基香豆素-3-醛和1.5mm(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基三苯基溴化膦溶于8ml干ch2cl2中，室溫下攪拌0.6h，然后緩慢加入0.23ml的0.3g/mlnaoh溶液，室溫?cái)嚢?0h；再加入1.15ml的濃hcl，攪拌30min，旋干溶劑，得到橙黃色探針粗品，用柱層析硅膠分離，得到熒光探針(i-2)，esi-ms:m/z[c16h16clno3+h]⁺:306.1。

實(shí)施例3熒光探針(i-3)的合成

熒光探針(i-3)的合成方法，包括以下步驟：

將0.8mm7-n,n-二己基香豆素-3-醛和2mm(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基三苯基溴化膦溶于8ml干ch2cl2中，室溫下攪拌0.8h，然后緩慢加入0.85ml的0.3g/mlnaoh溶液，室溫?cái)嚢?h；再加入0.85ml的濃hcl，攪拌22min，旋干溶劑，得到橙黃色探針粗品，用柱層析硅膠分離，得到熒光探針(i-3)，esi-ms:m/z[c24h32clno3+h]⁺:418.2。

實(shí)施例4熒光探針(i-4)的合成

熒光探針(i-4)的合成方法，包括以下步驟：

將0.8mm6,8-二甲基-7-n,n-二己基香豆素-3-醛和2.4mm(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基三苯基溴化膦溶于8ml干ch2cl2中，室溫下攪拌1h，然后緩慢加入0.7ml的0.3g/mlnaoh溶液，室溫?cái)嚢?.5h；再加入2.1ml的濃hcl，攪拌25min，旋干溶劑，得到橙黃色探針粗品，用柱層析硅膠分離，得到熒光探針(i-4)esi-ms:m/z[c16h16clno3+h]⁺:306.1。

對(duì)比例1熒光探針(i-5)(daietal.analyticachimicaacta900(2015)103e110)

試驗(yàn)例1

400nm激發(fā)波長下，熒光探針(i-1)分別與半胱氨酸(cys)，高胱氨酸(hcy)和還原型谷胱甘肽(gsh)反應(yīng)前后的熒光光譜。

將得到的探針溶于dmso配成1×10^-2m的探針工作溶液，用含20％dmso的pbs稀釋至1μm。分別稱量cys，hcy和gsh溶于pbs溶液，配成1×10^-1m的溶液。用熒光比色皿取2ml以上濃度的探針工作溶液分別與1mm的cys,hcy和gsh的反應(yīng)1h。測(cè)定反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，激發(fā)波長都是400nm.結(jié)果可參見圖1。

從圖1中可以看出探針本身的熒光強(qiáng)度很弱，而跟cys反應(yīng)后，480nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)了240倍，而hcy和gsh分別只增強(qiáng)了12倍和7倍。這個(gè)明顯的對(duì)比說明在400nm激發(fā)波長條件下，探針對(duì)cys有很好的識(shí)別性和選擇性。

試驗(yàn)例2

450nm激發(fā)波長下，熒光探針(i-1)分別與hcy，cys和gsh反應(yīng)前后的熒光光譜。

將得到的探針溶于dmso配成1×10^-2m的探針工作溶液，用含20％dmso的pbs稀釋至1μm。分別稱量hcy，cys和gsh溶于pbs溶液，配成1×10^-1m的溶液。用熒光比色皿取2ml以上濃度的探針工作溶液分別與1mm的cys,hcy和gsh的反應(yīng)1h。測(cè)定反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，激發(fā)波長都是450nm.結(jié)果可參見圖2。

從圖2中可以看出探針本身的熒光強(qiáng)度很弱，而跟hcy反應(yīng)后，543nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)了16倍，而cys只增強(qiáng)了1.2倍，gsh幾乎沒有增強(qiáng)。這個(gè)明顯的對(duì)比說明在450nm激發(fā)波長條件下，探針對(duì)hcy有很好的識(shí)別性和選擇性。

試驗(yàn)例3

通過雙通道法實(shí)現(xiàn)熒光探針(i-1)對(duì)hela細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物的識(shí)別檢測(cè)。

第一組實(shí)驗(yàn)為空白對(duì)照組，在hela細(xì)胞中孵育探針1h，分別在400nm和450nm激發(fā)波長下收集藍(lán)光和橙光通道的細(xì)胞成像。第二組實(shí)驗(yàn)先孵育cys30min再孵育探針1h，分別在400nm和450nm激發(fā)波長下收集藍(lán)光和橙光通道的細(xì)胞成像。第三組實(shí)驗(yàn)先孵育hcy30min再孵育探針1h，分別在400nm和450nm激發(fā)波長下收集藍(lán)光和橙光通道的細(xì)胞成像。第四組實(shí)驗(yàn)先孵育gsh30min再孵育探針1h，分別在400nm和450nm激發(fā)波長下收集藍(lán)光和橙光通道的細(xì)胞成像。

從圖3中觀察，第一組實(shí)驗(yàn)的藍(lán)光和橙光都比較弱，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的巰基化合物濃度低導(dǎo)致與探針反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度弱。第二組實(shí)驗(yàn)外加入了cys，濃度大大增加，并且探針與cys反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)射峰波長主要在藍(lán)光區(qū)域，因此藍(lán)光明顯增強(qiáng)而橙光沒有明顯變化。第三組實(shí)驗(yàn)外加入了hcy，濃度大大增加，并且探針與hcy反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)射峰波長在藍(lán)光和橙光區(qū)域，因此藍(lán)光和橙光都明顯增強(qiáng)。第四組實(shí)驗(yàn)外加了gsh，但是幾乎不與探針反應(yīng)，因此熒光沒有明顯變化。以上結(jié)果證明了探針的確可以通過雙通道法實(shí)現(xiàn)對(duì)cys和hcy識(shí)別檢測(cè)，并且現(xiàn)象明顯，結(jié)果可靠。

試驗(yàn)例4

對(duì)比例1中熒光探針(i-5)與本發(fā)明的結(jié)構(gòu)很類似，然而如圖4所示，利用不同激發(fā)波長，該探針不能將cys和hcy進(jìn)行有效區(qū)分，并且共存的gsh會(huì)對(duì)cys/hcy的檢測(cè)造成一定的干擾。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。