本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白、編碼基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禾谷孢囊線蟲(heteroderaavenae)是一種固著型植物內(nèi)寄生線蟲，主要危害小麥大麥燕麥等禾本科植物的根系，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，分布廣泛。目前已經(jīng)在我國的河南、安徽、山東、青海、寧夏、陜西等13個(gè)省市地區(qū)發(fā)現(xiàn)和報(bào)道(蘇致衡,黃文坤,鄭國棟,張宏嘉,劉淑艷,彭德良.北京地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲病發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查.植物保護(hù),2013,(01):116-120.)(趙洪海,楊遠(yuǎn)永,彭德良,劉峰.小麥禾谷孢囊線蟲在山東省的分布新報(bào)道和發(fā)生特點(diǎn)淺析.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,(04):261-266.)(趙杰,鈕緒燕,張管曲,彭德良,康振生.陜西省中南部地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲的發(fā)生與分布.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,(06):181-185.)(黃文坤,葉文興,王高峰,龍海波,歐師琪,彭德良.寧夏地區(qū)禾谷孢囊線蟲的發(fā)生與分布.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,(01):74-77.)(陳新,周洪友,馬璽.內(nèi)蒙古中西部地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲的發(fā)生分布.植物保護(hù),2009,(05):114-117.)(侯生英,彭德良,王愛玲,黃文坤,耿貴工,張貴.青海省小麥孢囊線蟲病調(diào)查初報(bào).青海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,(05):84-86.)(楊傳廣,吳慧平,檀根甲,王月英.安徽省小麥孢囊線蟲田間分布及危害調(diào)查.植物保護(hù),2008,(02):107-110.)。該種線蟲適應(yīng)低溫，通常在冬季之前就可開始侵染，侵染后的幼蟲在寄主體內(nèi)過冬，并在第二年開春后繼續(xù)侵染和發(fā)育，一年只發(fā)生一代(向桂林,宋志強(qiáng),梁旭東,胡小斌,亓竹冉,王暄,李紅梅.禾谷孢囊線蟲的田間侵染規(guī)律及垂直分布研究.麥類作物報(bào),2013,(04):789-794.)。

由于禾谷孢囊線蟲寄主范圍窄、侵染周期長、研究背景不明，其致病機(jī)制研究相對較落后。隨著效應(yīng)蛋白作為病原物致病機(jī)制的關(guān)鍵因素的持續(xù)研究開發(fā)，禾谷孢囊線蟲相關(guān)研究也得到進(jìn)一步增長(彭德良.重要植物線蟲致病相關(guān)基因研究進(jìn)展.中國植物病理學(xué)會(huì).中國植物病理學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.中國植物病理學(xué)會(huì):,2006:10.)。隨著基因表達(dá)和功能研究相關(guān)技術(shù)的成熟，rna表達(dá)定量、定位分析、rnai等均可應(yīng)用到禾谷孢囊線蟲中(黃文坤,彭德良,彭煥.rna干擾技術(shù)在植物寄生線蟲中的應(yīng)用.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,(01):170-175.)。借鑒于其它植物寄生線蟲的研究方法，禾谷孢囊線蟲效應(yīng)蛋白的研究已取得長足的進(jìn)步，例如內(nèi)切葡聚糖酶、細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白、膜聯(lián)蛋白等一些具有明顯促進(jìn)寄生作用的效應(yīng)蛋白在禾谷孢囊線蟲中被發(fā)現(xiàn)(龍海波.小麥禾谷孢囊線蟲β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶和細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白基因的克隆及功能分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2012.)，并且這些被發(fā)現(xiàn)的基因可應(yīng)用于寄主介導(dǎo)的rna干擾或異位表達(dá)以抑制病原線蟲的侵入危害。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白及其編碼基因，從表達(dá)時(shí)間上來看，主要集中在侵染前二齡、侵染后二齡第1天。而從表達(dá)部位來看，其主要集中在食道腺細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)表明該基因在禾谷孢囊線蟲寄生致病過程中發(fā)揮重要作用，可作為植物抗線蟲工程的靶標(biāo)基因。

一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

編碼禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白的基因。

編碼禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白的基因，其核苷酸序列如seqidno：2所示。

禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白在禾谷孢囊線蟲防控中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用為將ha-62292蛋白作為禾谷孢囊線蟲的寄主防御反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，用于激活寄主免疫反應(yīng)增強(qiáng)對線蟲抗性，或者獲得在寄主中的ha-62292蛋白的受體蛋白，轉(zhuǎn)移到不含有該種受體蛋白的寄主中以獲得抗性。

本發(fā)明的序列表ha-62292蛋白，長度為218個(gè)氨基酸；如seqidno：1所述；編碼該蛋白的基因長度為654個(gè)核苷酸，其序列如seqidno：2所示。上述蛋白來源于禾谷孢囊線蟲，但來源于其它孢囊線蟲甚至根結(jié)線蟲的此蛋白也屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。此蛋白可通過生物技術(shù)直接人工合成，先合成其編碼基因，連接到表達(dá)載體后再導(dǎo)入生物體內(nèi)表達(dá)得到。

上述編碼基因的雜交探針、dsrna、重組表達(dá)載體、干擾載體、重組病毒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物或組織、重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。雜交探針和dsrna列于序列表中序列3和序列4、5、6、7，其中dsrna片段有四個(gè)，表達(dá)載體和干擾載體的構(gòu)建建立在相應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)基礎(chǔ)上，具體可為單獨(dú)或者多個(gè)組合使用的誘導(dǎo)型、增強(qiáng)型、組成型、組織特異型，并且伴隨有合適的篩選標(biāo)記，例如抗性、化學(xué)發(fā)光或染色、熒光。轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物可以是細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞系。

ha-62292蛋白在禾谷孢囊線蟲病害防控中的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)的功能應(yīng)用研究常用rna干擾、體內(nèi)異位表達(dá)等基于編碼基因操作的方法，本發(fā)明使用rna干擾有效影響了基因的表達(dá)水平，并且在線蟲的寄生致病能力方面表現(xiàn)出差異。此差異建立在對禾谷孢囊線蟲敏感的寄主上，例如大麥goldenpromise。

ha-62292基因的應(yīng)用主要包括

(d1)在線蟲不同發(fā)育階段表達(dá)水平變化

(d2)在線蟲不同組織部位表達(dá)水平

孢囊線蟲不同階段其表達(dá)的蛋白質(zhì)有差異，并且反映在編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平上。在涉及到對寄主的寄生致病和抗逆方面，往往在寄生過程的前期表達(dá)，而與自生發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，其編碼基因很可能在后期表達(dá)。此外編碼基因在線蟲的轉(zhuǎn)錄表達(dá)部位也與其應(yīng)用有關(guān)，例如食道腺細(xì)胞中表達(dá)的蛋白很可能與寄生植物有關(guān)，而在頭感器或者表皮中表達(dá)則可能與尋找寄主或者抑制寄主免疫反應(yīng)有關(guān)。本發(fā)明提供的ha-62292基因，從表達(dá)時(shí)間上來看，主要集中在侵染前二齡、侵染后二齡第1天。而從表達(dá)部位來看，其主要集中在食道腺細(xì)胞中。

本發(fā)明涉及到的寄主品種包括但不限于大麥goldenpromise，也可為其它感病麥類作物，例如小麥和燕麥。本發(fā)明通過基因沉默，將針對ha-62292基因設(shè)計(jì)的dsrna片段(如seqidno：4、5、6)分別導(dǎo)入禾谷孢囊線蟲體內(nèi)，結(jié)果顯示，4個(gè)dsrna片段rna干擾后線蟲侵入根內(nèi)的數(shù)量相比對照明顯上升，推測此基因可能與激活寄主免疫反應(yīng)有關(guān)。

根據(jù)基因沉默結(jié)果推測，該基因編碼的蛋白可能在被寄主識(shí)別后激活相應(yīng)的免疫反應(yīng)，而該基因也可能屬于無毒基因。無毒基因表達(dá)產(chǎn)物在寄主中往往有固定的受體，該受體行使抗病作用，可通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等蛋白互作研究技術(shù)挖掘受體蛋白和其編碼基因，再將編碼基因轉(zhuǎn)化至不含該種受體的感病寄主中獲得對相應(yīng)線蟲的抗性。本發(fā)明對于孢囊線蟲致病機(jī)理研究以及抗線蟲植物制備具有重大價(jià)值。

附圖說明

圖1為發(fā)育表達(dá)定量分析，結(jié)果顯示，ha-62292基因表達(dá)主要集中在侵染前二齡和侵染后二齡第1天，數(shù)據(jù)收集自三次獨(dú)立重復(fù)。

圖2為侵染前二齡幼蟲組織表達(dá)定位，結(jié)果顯示，ha-62292基因表達(dá)主要集中在食道腺細(xì)胞中。

圖3為rna干擾顯示ha-62292基因表達(dá)被干擾后二齡幼蟲侵入根內(nèi)的數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果表明，被干擾后二齡幼蟲侵入根內(nèi)的數(shù)量明顯上升。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中所用到的試劑如無特別說明均為國產(chǎn)分析純，所用方法如無特別說明均按照試劑盒使用說明書進(jìn)行，涉及到rna的實(shí)驗(yàn)所用試劑耗材均經(jīng)過depc處理。

實(shí)施例1：ha-62292蛋白及其編碼基因的分離

使用trizol(ambion)試劑盒提取禾谷孢囊線蟲總rna，dnasetreatmentandremovalreagents(ambion)處理后使用iiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr反轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)合成cdna。并以此cdna為模板，pcr擴(kuò)增基因序列，所用試劑為maxdnapolymerase高保真酶(takara)，引物序列為：5'-gatttgttgtccgcagtgcctttg-3'，5'-gccaaaggcactgcggacaacaaa-3'。將擴(kuò)增得到的片段純化后連接測序。測序結(jié)果顯示其包含有序列表中seqidno：2所示的開放閱讀框，編碼seqidno：1的蛋白質(zhì)序列，并分別將該蛋白質(zhì)序列和基因序列命名為ha-62292蛋白和ha-62292基因。

實(shí)施例2：ha-62292基因的發(fā)育表達(dá)變化

酶解法收集不同發(fā)育階段的禾谷孢囊線蟲，使用trizol(ambion)試劑盒提取總rna，dnasetreatmentandremovalreagents(ambion)處理后使用iiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr反轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)合成cdna。并以此cdna為模板，real-timepcr檢測不同階段表達(dá)水平變化，所用pcr試劑為selectmastermix(appliedbiosystems)，引物為5'-ctacaaagcggcgggaaat-3'，5'-atgcaccagaataatctgaacagc-3'，內(nèi)參基因?yàn)間apdh，內(nèi)參基因引物為5'-agcggcacagaacatcatcc-3'，5'-ggtcctccgtgtagcccaaa-3'。結(jié)果表明此基因表達(dá)水平主要集中在侵染前二齡、侵染后二齡第1天。

實(shí)施例3：ha-62292基因的組織表達(dá)定位

以禾谷孢囊線蟲線蟲cdna為模板，maxdnapolymerase高保真酶(takara)和引物5'-cttcttgctcattgccctaa-3'、5'-aaattctcgcccatccct-3'pcr擴(kuò)增，回收純化得到的擴(kuò)增片段，并以此為模板，pcrdigprobesynthesiskit(roche)和反義引物作單引物擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物為雜交探針。雜交方法參考文獻(xiàn)dej.m.boeryy,geertsmant,ericl.davis,thomasj.baum(1998)in-situhybridizationtomessengerrnainheteroderaglycines.journalofnematology30:309-312.雜交結(jié)果顯示，此基因表達(dá)定位在禾谷孢囊線蟲的食道腺細(xì)胞中。

實(shí)施例4：ha-62292基因rna干擾

以禾谷孢囊線蟲cdna為模板，maxdnapolymerase高保真酶(takara)和下表引物擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并以此為模板，hiscribet7quickhighyieldrnasynthesiskit(neb)試劑盒做體外轉(zhuǎn)錄，megaclear^tmkitpurificationforlargescaletranscriptionreactions(ambion)純化轉(zhuǎn)錄得到的dsrna后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照下表配制浸泡體系，無dsrna體系為陰性對照

浸泡條件為黑暗16℃緩慢搖動(dòng)36h。浸泡后接種大麥，每個(gè)50ml離心管中3棵大麥，接種線蟲400，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，接種后的大麥培養(yǎng)在16度光照培養(yǎng)箱中。接種后第8天酸性品紅染色統(tǒng)計(jì)根中線蟲數(shù)量。結(jié)果顯示，4個(gè)dsrna片段rna干擾后線蟲侵入根內(nèi)的數(shù)量相比對照明顯上升，推測此基因可能與激活寄主免疫反應(yīng)有關(guān)。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白、編碼基因及其應(yīng)用

<130>pp17066-zwb

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>218

<212>prt

<213>ha-62292蛋白序列

<400>1

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ilealaileprotyrasnvaltrpalaleuseralaglyglyargval

202530

servalleuasncyshisasnasntyrargserglnleualalysgly

354045

thralaaspasnlysserglylysmetproalaglyserasnleuile

505560

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65707580

aspglycyssermetserhisserserserserglnargglnglymet

859095

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115120125

glypheaspglnserleuvalleuasnmetasnglupheasnlysgly

130135140

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145150155160

cysalaleualaargcysproserserglntrpglnthrtrpvalval

165170175

cysargtyrlysalaalaglyasnmetleuasnglumetvaltyrlys

180185190

lysglythralacysserglycysserasptyrserglyalasercys

195200205

asnasnalaasnglyleucysvalvalpro

210215

<210>2

<211>654

<212>dna

<213>ha-62292基因序列

<400>2

atggaactccactcaaaagttgtctgcttcttcttgctcattgccctaattgctattcct60

tacaatgtttgggcactttctgctggcggtcgcgtgtcggtgcttaattgtcacaacaat120

tatcgttcccaattggccaaaggcactgcggacaacaaatccggcaaaatgccggctggt180

agcaatttgatagagctaaaatatttgaatgaacatgagaagggtgcacagagctgggcc240

gacggttgctcaatgtcccactcgagttcatcacaacgccaagggatgggcgagaatttg300

tacatgtcaagttcatctaccatttcggaagctgaggcgctcaaacaagcttgtgacatg360

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<210>3

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<212>dna

<213>ha-62292基因雜交探針序列

<400>3

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tcgcgtgtcggtgcttaattgtcacaacaattatcgttcccaattggccaaaggcactgc120

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<210>4

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<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列1

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gtcggtgcttaattgtcacaacaattatcgttcccaattggccaaaggcactgcggacaa120

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<210>5

<211>181

<212>dna

<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列2

<400>5

gctttgaccaaagcctggtgctgaacatgaacgagttcaacaagggcatcggacattgga60

gccagcaagcgtgggccaaaactgctcaaattggttgtgccttggcacgatgtcccagct120

cccaatggcaaacatgggttgtgtgccgctacaaagcggcgggaaatatgttgaacgaaa180

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<210>6

<211>255

<212>dna

<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列3

<400>6

gccctaattgctattccttacaatgtttgggcactttctgctggcggtcgcgtgtcggtg60

cttaattgtcacaacaattatcgttcccaattggccaaaggcactgcggacaacaaatcc120

ggcaaaatgccggctggtagcaatttgatagagctaaaatatttgaatgaacatgagaag180

ggtgcacagagctgggccgacggttgctcaatgtcccactcgagttcatcacaacgccaa240

gggatgggcgagaat255

<210>7

<211>211

<212>dna

<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列4

<400>7

gcctggtgctgaacatgaacgagttcaacaagggcatcggacattggagccagcaagcgt60

gggccaaaactgctcaaattggttgtgccttggcacgatgtcccagctcccaatggcaaa120

catgggttgtgtgccgctacaaagcggcgggaaatatgttgaacgaaatggtctacaaaa180

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