本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-56573基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禾谷孢囊線蟲(cerealcystnematodes，簡稱ccns)對小麥生產(chǎn)具有嚴重威脅，在世界范圍內(nèi)38個國家發(fā)生危害，我國自從1991年首次在湖北被發(fā)現(xiàn)以來，在不到30年的時間內(nèi)，已經(jīng)在我國包括河南，河北，西藏，新疆等16個省市地區(qū)發(fā)現(xiàn)。ccn在我國80％的小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，涵蓋了我國主要小麥產(chǎn)區(qū),尤以黃淮麥區(qū)危害最嚴重，危害面積達6000余萬畝，年產(chǎn)量損失在23％-50％以上，嚴重地塊減產(chǎn)達73％-89％，甚至毀種絕收，而且有不斷加速蔓延趨勢[pengdl,nicoljm,lih,hous,lih,chens,map,lih,andrileyit.currentknowledgeofcerealcystnematode(heteroderaavenae)onwheatinchina.in'cerealcystnematodes:status,researchandoutlook.'editeredbyitriley,jmnicolandaadababat.2009:29-34；彭德良,subbotins,moensm.小麥禾谷孢囊線蟲(heteroderaavenae)的核糖體基因(rdna)限制性片段長度多態(tài)性研究.植物病理學(xué)報.2003,33:323-329；趙洪海，楊遠永，彭德良，劉峰.小麥禾谷孢囊線蟲在山東省的分布新報道和發(fā)生特點淺析.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2011,28:17-22]。

rnai(rnainterference)是指內(nèi)源或外源雙鏈rna(double-strandrna,dsrna)導(dǎo)入細胞后特異性地導(dǎo)致其同源基因沉默的現(xiàn)象。rnai首先是在模式線蟲秀麗小桿線蟲(caenorhabditiselegans)發(fā)現(xiàn)(firea,xusq,montgomerymk,kostassa,driverse,mellocc.potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedrnaincaenorhabditiselegans.nature.1998,391:806-811)。rnai分為活體內(nèi)干擾(invivornai)和活體外干擾(invitrornai)。目前，活體外rnai在固著性內(nèi)寄生線蟲的應(yīng)用主要針對于二齡幼蟲，而二齡幼蟲主要是在體內(nèi)呈遷移狀態(tài)，并無取食行為，但在神經(jīng)刺激物質(zhì)(主要包括章魚胺、間苯二酚和羥色胺等)的作用下，可以引起線蟲的口針頻繁的抽動，有利于線蟲對外源物質(zhì)的取食(bakhetiam,charltonwl,urwinpe,mcphersonmj,atkinsonhj.rnainterferenceandplantparasiticnematodes.trendsinplantscience.2005,10:362-367)。urwin等(2002)使用了章魚胺作為刺激誘導(dǎo)物，首次通過浸泡法將dsrna導(dǎo)入至大豆孢囊線蟲h.glycines和馬鈴薯白線蟲globoderapallida二齡幼蟲體內(nèi)，并引發(fā)了沉默效應(yīng)，成功的沉默了若干線蟲靶標基因。該研究證明了植物寄生線蟲與模式秀麗小桿線蟲具有相同的rnai效應(yīng)，同時也表明了rnai可以用于植物寄生線蟲基因功能的研究(urwinpe,lilleycj,atkinsonhj.ingestionofdouble-strandedrnabypreparasiticjuvenilecystnematodesleadstornainterference.molecularplant-microbeinteractions.2002,15:747-752)。chen等(2005)通過進一步改善浸泡刺激體系，以馬鈴薯金線蟲g.rostorchiensis側(cè)器分泌的蛋白基因gr-ams-1為靶標進行敲除沉默，導(dǎo)致了g.rostorchiensis二齡幼蟲對寄主的定位能力下降(chenq,rehmans,smantg,jonesjt.functionalanalysisofpathogenicityproteinsofthepotatocystnematodegloboderarostochiensisusingrnai.molecularplant-microbeinteractions.2005,18:621-625.)。通過dsrna沉默β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶寄生基因，是禾谷孢囊線蟲幼蟲侵入根的能力下降，證明了β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶是線蟲是線蟲寄生過程中的重要蛋白(longh,pengh,huangw,wangg,gaob,moensm,pengd.identificationandmolecularcharacterizationofanewβ-1,4-endoglucanasegene(ha-eng-1a)inthecerealcystnematodeheteroderaavenae.eurjplantpathol.2012,134:391-400)。

線蟲致死基因的篩選對線蟲防控具有重要意義。目前針對模式生物秀麗小桿線蟲基因組及致死基因的研究比較全面，alkharouf等利用發(fā)育突變和rnai致死表型在h.glycines中鑒定出了rnai致死基因[alkharoufnw,klinkvp,matthewsbf.identificationofheteroderaglycines(soybeancystnematode)cdnasequenceswithhighidentitytothoseofcaenorhabditiseleganshavinglethalmutantorrnaiphenotypes.expparasitol.2007,115:247-258]。隨后，在寄生線蟲pratylenchusthornei中鑒定到多個rnai致死表型基因(nicolp,gillr,fosu-nyarkoj,jonesmgk.denovoanalysisandfunctionalclassificationofthetranscriptomeoftherootlesionnematode,pratylenchusthornei,after454gsflxsequencing.internationaljournalforparasitology2012,42:225-237)，為植物寄生線蟲的防控與抗性育種奠定堅實基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-56537基因，與禾谷孢囊線蟲的生長發(fā)育有關(guān)，可利用該基因沉默，用于禾谷孢囊線蟲的防控。

禾谷孢囊線蟲的ha-56537基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

針對上述基因合成的ha-56573-dsrna1，ha-56573-dsrna2及ha-56573-dsrna3片段，其核苷酸序列分別為seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4所示。

所述的禾谷孢囊線蟲的ha-56537基因設(shè)計的dsrna片段在防治禾谷孢囊線蟲中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，為將禾谷孢囊線蟲的ha-56537基因設(shè)計合成的dsrna片段取食到禾谷孢囊線蟲體內(nèi)，抑制禾谷孢囊線蟲發(fā)育，從而防控禾谷孢囊線蟲侵染寄主。

本發(fā)明通過禾谷孢囊線蟲rna-seq數(shù)據(jù)與c.elegans基因組中具有rnai致死表型基因比對，從中篩選出同源基因，其核苷酸序列如seqidno：1。

含有上述ha-56537基因的重組表達載體、干擾載體、重組病毒、dsrna、轉(zhuǎn)基因細胞系、轉(zhuǎn)基因植物或組織、重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。含有ha-56537的基因的重組表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體，病毒載體，細菌表達載體及酵母表達載體等。含有ha-56537基因的載體構(gòu)建過程中，可以單獨或者多個組合使用誘導(dǎo)型、增強型、組成型、組織特異型啟動子。載體可以包括抗生素或抗化學(xué)試劑的抗性篩選標記，也可以含有產(chǎn)生顏色變化的酶，比如gus，或者發(fā)光標記蛋白，例如紅色或綠色熒光蛋白，便于后續(xù)轉(zhuǎn)化子的篩選。構(gòu)建的載體可以轉(zhuǎn)化細菌，真菌及單雙子葉植物，具體可以為大腸桿菌，酵母，煙草，擬南芥及小麥，大麥。

本發(fā)明針對ha-56537基因序列，篩選特定區(qū)域合成dsrna，通過體外干擾的方法測定dsrna處理對線蟲活性，侵染能力和完成生活史的影響，驗證基因的致死功能。本發(fā)明具有致死效果的靶基因ha-56537，在dsrna處理后，雌蟲量下降65.81％?？梢詰?yīng)用于線蟲防控，具體為利用ha-56537基因序列或者基因片段構(gòu)建表達dsrna或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)rna的干擾載體，或者重組病毒，用于小麥或大麥轉(zhuǎn)基因植株，沉默禾谷孢囊線蟲ha-56537基因，使其侵染能力下降，不能完成生活史，達到線蟲防控目的。

附圖說明

圖1為dsrna的合成。其中1：egfp對照dsrna；2：ha-56573-dsrna1；3：ha-56573-dsrna2；4：ha-56573-dsrna3

圖2熒光顯微鏡觀察小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲對異硫氰酸熒光素fitc的取食效果。

其中s：口針；pl：咽腔；m：食道球。

圖3ha-56573-dsrna1，ha-56573-dsrna2及ha-56573-dsrna3處理的線蟲在接種50天后的白雌蟲量，其中ck和egfp為對照

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。申請人也可以對公從發(fā)放。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

實施例1、rnai致死表型基因的篩選

對禾谷孢囊線蟲進行轉(zhuǎn)錄組測序，與wormbase數(shù)據(jù)庫(http://www.wormbase.org/)收集的c.elegans中rnai表型致死數(shù)據(jù)庫進行同源的序列比對。鑒定小麥禾谷孢囊線蟲中與c.elegans同源(e-valueof≤1.0e-40)且具有rnai致死表型的基因。從ncbi數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載植物蛋白(embryophytaproteindatabase，ncbitxid3193)、脊椎動物蛋白(craniataproteindatabase，ncbitxid89593)及昆蟲蛋白(insectproteindatabase，ncbitxid6960)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)收集到的這蛋白質(zhì)序列分別建立本地的核酸數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用本地blast將小麥禾谷孢囊線具有rnai表型致死的候選基因分別進行tblastx或blastx分析(e-value≤1.0e-5)。獲取小麥禾谷孢囊線蟲轉(zhuǎn)錄組中與這些物種的基因無同源序列的rnai表型致死的基因。從中篩選了5個表型穩(wěn)定，具有胚胎致死(embembryoniclethal)和幼蟲致死(larvallethal)的候選靶標序列(表1)。ha-56537基因序列如seqidno：1所示。針對靶基因序列設(shè)計合成基因特異引物，并且在特異引物5′端引入t7啟動子序列taatacgactcactataggg，合成dsrna模板并純化。按照hiscribe^tmrnaitranscriptionkit的說明書進行，具體步驟如下：rnase-free水24μl，10×transcriptionbuffer4μl，20×ribonucleotidesolutionmix2μl，dna模板6μl(上步所獲的pcr產(chǎn)物，1μg)，20×hmvmix2μl，t7rnapolymerase2μl，總體積40μl。將各反應(yīng)物混勻后，置于pcr儀中42℃溫育反應(yīng)4h，合成dsrna，dsrna處理過程在實施例2中詳述。dsrna處理結(jié)果表明ha-56573基因在dsrna處理后雌蟲量顯著下降，其他4個基因沒有顯著下降(表2)，因此篩選ha-56573基因進行進一步的功能驗證分析，如實施例2。

表1：小麥禾谷孢囊線蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選的5個與秀麗小桿線蟲rnai致死表型同源的序列

表2：dsrna處理的小麥禾谷孢囊線蟲在接種50天后的白雌蟲量

實施例2、體外rnai干擾驗證ha-56573功能

1.dsrna的合成，設(shè)計擴增目的片段的特異引物：

ha-56573f1：5’-ggagccattctttgctcaag-3’；

ha-56573r1：5’-ttctgtaccgcttccgattc-3’

ha-56573f2：5’-acctcaacagggacaaatcg-3’；

ha-56573r2：5’-tcatctgttcctccaactcc-3’

ha-56573f3：5’-gaatcggaagcggtacagaa-3’；

ha-56573r3：5’-cgatttgtccctgttgaggt-3’

并且在特異引物5′端引入t7啟動子序列taatacgactcactataggg。合成dsrna模板并純化用于下一步實驗。按照hiscribe^tmrnaitranscriptionkit的說明書進行，具體步驟如下：rnase-free水24μl，10×transcriptionbuffer4μl，20×ribonucleotidesolutionmix2μl，dna模板6μl(上步所獲的pcr產(chǎn)物，1μg)，20×hmvmix2μl，t7rnapolymerase2μl，總體積40μl。將各反應(yīng)物混勻后，置于pcr儀中42℃溫育反應(yīng)4h，合成ha-56573-dsrna1(使用基因特異引物ha-56573f1與ha-56573r1擴增，序列為seqidno：2)，或者ha-56573-dsrna2(使用基因特異引物ha-56573f2與ha-56573r2擴增，序列為seqidno：3)，或者ha-56573-dsrna3(使用基因特異引物ha-56573f3與ha-56573r3擴增，序列為seqidno：2)。取1μl產(chǎn)物進行電泳檢測(圖1)

2.收集新鮮孵化的小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲，用depc處理水清洗3次后，用0.25×m9buffer清洗2遍并存置于該溶液中，隨時備用。

3.為了觀察二齡幼蟲的吞咽效果，首先使用異硫氰酸熒光素(fitc)作為示蹤物質(zhì)，配制含有fitc的0.25×m9buffer溶液，具體各成分及濃度包括：1mg/mlfitc；3mm亞精胺；50mm章魚胺；0.05％明膠，各成分終濃度使用0.25×m9溶液調(diào)節(jié)。加入線蟲懸浮液(約1000頭)，至終體積200μl，黑暗環(huán)境16℃輕微震蕩浸泡36h，萊卡熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(圖2)。

4.為了干擾靶標基因，配制含有dsrna的沉默溶液，具體各成分及濃度包括：實施例2中擴增獲得的ha-56573-dsrna1或者ha-56573-dsrna2或者ha-56573-dsrna：3mg/ml；3mm亞精胺；50mm章魚胺；0.05％明膠，各成分終濃度使用0.25×m9溶液調(diào)節(jié)。加入線蟲懸浮液(約8000頭)，至終體積300μl，黑暗環(huán)境16℃輕微震蕩浸泡36h。

5.對照實驗采用含有非線蟲基因的綠色熒光蛋白基因egfp-dsrna(ck1)和不含有dsrna的溶液(ck2)，其他成分以及浸泡條件與dsrna處理實驗相同。

6.接種實驗表面消毒的小麥種子(溫麥19)在黑暗環(huán)境室溫催芽兩天后，種于含有滅菌沙土的50ml離心管中。每個處理用3個離心管，每個離心管中3顆小麥苗，6天后，進行接種實驗，在侵泡刺激取食dsrna后36h之后分別取樣接種溫麥19小麥幼苗，每管接種300頭二齡幼蟲，16℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗分為3組，接種實驗重復(fù)三次。

7.小麥根組織內(nèi)線蟲染色

收獲接種后第10天的小麥根，采用酸性品紅染色法進行根染色，顯微鏡下觀察線蟲侵染效率，結(jié)果表明線蟲侵染率無顯著差異。

8.統(tǒng)計各處理雌蟲數(shù)量

接種50天后，使用80目篩收集各處理白雌蟲數(shù)量，統(tǒng)計dsrna處理對線蟲發(fā)育的影響，結(jié)果表明ha-56573-dsrna1，ha-56573-dsrna2及ha-56573-dsrna3處理后，雌蟲量與對照相比分別下降38.5％，65.81％，53.8％，如圖3所示，表明ha-56573可作為靶標基因用于線蟲防控。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所

<120>禾谷孢囊線蟲ha-56573基因及其應(yīng)用

<130>pp17067－zwb

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>835

<212>dna

<213>禾谷孢囊線蟲ha-56573基因

<400>1

acgggcagctgaacgcacccgaatttgcggattttgagcgaattgtgcgcgcacgcgcag60

tcgaaacgtcgaaaaaggcactgaaagtggtggacacggatgggaacaacgcactgacaa120

tggacgaggccaagaaaatcgcctttgaacattacggatttgatgaagtgacattggagc180

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<210>2

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<212>rna

<213>ha-56573-dsrna1序列

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<211>216

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<213>ha-56573-dsrna2序列

<400>3

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<210>4

<211>204

<212>rna

<213>ha-56573-dsrna3序列

<400>4

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