本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，具體而言，涉及一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法、引物及其應用和試劑盒。

背景技術：

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)感染可以引起豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)。prrs的主要特征癥狀是引起母豬的繁殖障礙(包括懷孕母豬的流產，產死胎、木乃伊胎和弱仔等)及各個年齡段豬的間質性肺炎性呼吸障礙等。該病最早是1987年發(fā)現(xiàn)于美國，1995年首次在我國出現(xiàn)，此后在全國大部分省市蔓延，目前已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。特別是2006年爆發(fā)的由nsp2基因部分缺失的高致病性prrsv變異株(highlypathogenicprrsv，hp-prrsv)感染引起的以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的“無名高熱”，更是給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了十分慘重的損失。及時、準確地診斷該病，是采取有效防控措施、減少經濟損失的基礎。國際上根據(jù)prrsv的分離地、抗原性、致病性和基因組的差異將prrsv分為美洲型和歐洲型，而我國主要流行的為美洲型毒株。目前，我國流行的prrsv又包括經典美洲株和高致病性美洲株。另外，prrsv的病毒含量可以反應豬群的整體感染狀況。因此臨床上急需一種能夠快速定量檢測prrsv的方法。

傳統(tǒng)的檢測prrsv的方法包括病毒的分離與鑒定、病毒中和試驗(virusneutralizationtest，vnt)、免疫過氧化物酶單層試驗(immunoperoxidasemonolayerassay，ipma)、間接免疫熒光抗體實驗(indirectimmunofluorescentantibodytest，ifa)、免疫組織化學技術(immunohistochemistry，ihc)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)及膠體金免疫層析技術(goldimmunochromatographyassay，gica)等。這些方法基本都非常耗時耗力而且敏感性較低，不太適合臨床上大批樣本的檢測。隨后發(fā)展起來的反轉錄pcr(reversetranscriptasepolymerasechainreaction，rt-pcr)和熒光定量pcr(realtimert-pcr)等分子生物學技術與傳統(tǒng)方法相比具有特異性強、靈敏性高、檢測時間短及重復性好等優(yōu)點。但是這些方法均是對病毒的定性或半定量檢測，而且實驗結果判斷依賴于檢測人員豐富的經驗，在特異性和敏感性上依舊存在一定局限性，容易出現(xiàn)假陰性和假陽性結果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述引物在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的絕對定量檢測中的應用。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述引物在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期診斷和/或防疫中的應用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法，其包括：

將pcr預混液形成微滴，并進行ddpcr反應；

其中，上述pcr預混液含有seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物。

一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物，其包括seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物。

上述用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的絕對定量檢測中的應用。

上述用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期診斷和/或防疫中的應用。

一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其包括上述用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法，其采用seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物并基于染料法ddpcr技術對prrsv進行絕對定量檢測，其檢測的靈敏度高于熒光定量pcr技術(10倍)；而且本發(fā)明提供的ddpcr方法可直接定量，不用設置標準曲線，根據(jù)檢測結果可以直接確定待測樣本中prrsv病毒的拷貝數(shù)，極大的簡化了操作步驟，而且特異性好、靈敏度高(最低可檢測10個病毒拷貝數(shù))。在臨床上可以更加快速、準確的實現(xiàn)對prrsv感染的診斷，同時還能對prrsv病毒含量進行絕對定量，有利于進一步合理制定豬場的防控治療措施。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例4提供的ddpcr最佳退火溫度的優(yōu)化結果；

圖2為本發(fā)明實施例4提供的不同退火溫度下每μl反應體系中陽性微滴數(shù)和每個反應管中的總微滴數(shù)；

圖3為本發(fā)明實施例5提供的ddpcr最適引物濃度的優(yōu)化結果；

圖4為本發(fā)明實施例6提供的ddpcr特異性檢測的分析結果；

圖5為本發(fā)明實施例7提供的采用qrt-pcr檢測prrsv的標準曲線；

圖6為本發(fā)明實施例7提供的qrt-pcr和ddpcr檢測結果的相關性分析。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。

下面對本發(fā)明實施例的一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法、引物及其應用和試劑盒進行具體說明。

微滴式數(shù)字化pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)是近年來發(fā)展起來的新一代pcr技術，其原理是通過無限稀釋形成油包水的微滴，從而將pcr反應分配至20000個納升級別的微滴中進行。pcr反應結束后，通過微滴分析儀檢測每個微滴的熒光信號，含有熒光信號的微滴判為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，計算得出靶分子的起始拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)的定量pcr相比，ddpcr不需要建立標準曲線就能實現(xiàn)靶分子的絕對定量檢測，而且具有特異性強、靈敏度高(最低可檢測單拷貝的靶分子)、定量準確等優(yōu)點。ddpcr已逐漸成為分子生物學研究中的重要工具，并已經應用于產前診斷、癌癥早期診斷和多種疫病的定量檢測等領域。將ddpcr技術用于prrsv的檢測，在臨床上可以更加快速、準確的實現(xiàn)對prrsv感染的診斷，同時還能對prrsv病毒含量進行絕對定量，有利于進一步合理制定豬場的防控治療措施。

一方面，本發(fā)明提供了用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法，其包括以下步驟：

(1)待測樣品病毒rna的提取及cdna的合成

上述待測樣品可以為組織病料或臨床血液樣本、也可以是病毒的細胞培養(yǎng)物。

例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述待測樣品為病毒的細胞培養(yǎng)物，例如為prrsv經典株bj-4和prrsv高致病性毒株hn07-1的marc-145的細胞培養(yǎng)物。

當上述待檢樣品為組織病料或細胞培養(yǎng)物時，上述“待測樣品病毒rna的提取”可為：將上述待測樣品進行研磨勻漿(細胞培養(yǎng)物不需要此過程)，反復凍融3次；將上述待測樣品于4℃離心機，12000g離心5min；抽取離心上清液，采用商品化病毒rna提取試劑盒進行rna提取，同時利用反轉錄試劑盒進行cdna的合成。

當上述待測樣品為血液或組織液等液體樣品時，上述“待測樣品病毒rna的提取”可為：將上述待測樣品室溫靜置1個小時后，吸取上清于4℃離心機，5000g離心5min；抽取離心上清液，采用商品化病毒rna提取試劑盒進行rna提取，同時利用反轉錄試劑盒進行cdna的合成。

需要說明的，在其他的實施例中，也可以直接采用已經合成好的cdna樣品進行后續(xù)的ddpcr反應，本步驟為可選步驟，可根據(jù)實際情況進行選擇。

(2)配置pcr預混液，將pcr預混液形成微滴，并進行ddpcr反應

例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，將pcr預混液加入至微滴發(fā)生卡中，用微滴生產油包裹pcr預混液，制備出微滴，然后將微滴轉入96孔pcr板，熱封后于pcr儀中進行ddpcr擴增反應。

其中，上述pcr預混液含有seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物。

進一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述正向引物和上述反向引物在上述pcr預混液中的濃度均為120-130nm。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述正向引物和上述反向引物在上述pcr預混液中的濃度均為124-126nm。更優(yōu)選地，上述正向引物和上述反向引物在上述pcr預混液中的濃度均為125nm

控制引物在合適的濃度范圍內可降低反應體系中的本底信號，有利于提高檢測結果的準確性。將正向引物和反向引物在pcr預混液中的濃度控制為125nm，可以使得ddpcr反應體系中基礎熒光值最低，使得檢測結果可讀性強、準確性高。

需要說明的是，上述pcr預混液還含有待測樣品的cdna模板以及ddpcrsupermix(含有熒光染料，例如evagreen、sybrgreen等可嵌入雙鏈dna的熒光染料)。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實施方案中，pcr預混液由按如下成分比例配制得到：2×evagreenddpcrsupermix10μl，正向引物和反向引物各125nm，待測樣品的cdna模板(模板用量大于0ng，小于200ng)，補滅菌水至總體積20μl。

當然，pcr預混液的體積可根據(jù)實際情況設置，可以是10μl、50μl、100μl或者200μl等，其均屬于本發(fā)明的保護范圍。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應的退火溫度為52-60℃；更優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應的退火溫度為54-56℃。再優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應的退火溫度為55℃。

進一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應的反應程序為：94-96℃預變性4-6分鐘；94-96℃變性8-10秒鐘，54-56℃退火28-32秒鐘，70-74℃延伸28-32秒鐘，共38-42個循環(huán)；70-74℃總延伸4-6分鐘；96-99℃，8-12分鐘。

進一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應的反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性10秒鐘，54-56℃退火30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共40個循環(huán)；72℃總延伸5分鐘；98℃10分鐘，結束反應。

再進一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，上述ddpcr反應的反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性10秒鐘，55℃退火30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共40個循環(huán)；72℃總延伸5分鐘；98℃10分鐘，結束反應。

(3)將擴增后的微滴放入微滴分析儀中，用軟件(例如quantasoft軟件)進行檢測分析

在本發(fā)明的一些實施方案中，可以利用quantasoft軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算樣品中病毒rna的拷貝數(shù)。

待測樣本檢測結果的判定方法為：

(1)陽性：標本檢測結果≥1個拷貝；

(2)陰性：標本檢測結果<1拷貝。

綜上，本發(fā)明提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法，基于染料法數(shù)字pcr，采用seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物并結合ddpcr技術對prrsv進行絕對定量檢測，其檢測的靈敏度略高于熒光定量pcr技術(10倍)；而且本方法可直接定量，不用設置標準曲線，根據(jù)檢測結果可以直接確定待測樣本中prrsv病毒的拷貝數(shù)，極大的簡化了操作步驟，而且特異性好、靈敏度高(最低可檢測10個病毒拷貝數(shù))。在臨床上可以更加快速、準確的實現(xiàn)對prrsv感染的診斷，同時還能對prrsv病毒含量進行絕對定量，有利于進一步合理制定豬場的防控治療措施。

另一方面，本發(fā)明提供了一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物，其包括seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物。

另一方面，本發(fā)明提供了上述用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的絕對定量檢測中的應用。

另一方面，本發(fā)明提供了上述用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期診斷和/或防疫中的應用。

本發(fā)明提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物具有特異性好、靈敏度高的特點，可應用于ddpcr平臺對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進行定量檢測，以及用于對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期診斷和/或防疫。此外，將該引物用于疫苗生產質量控制中也屬于本發(fā)明的保護范圍；另外，本發(fā)明提供的引物也可以用于普通pcr平臺進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒的相關檢測。

另一方面，本發(fā)明提供了一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其包括上述用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物。

進一步地，上述試劑盒還包括：ddpcrsupermix、ddh2o、豬繁殖與呼吸綜合征病毒cdna陽性標準品和微滴生成油中的一種或多種。

本發(fā)明提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒可以結合ddpcr技術或普通pcr技術簡單、方便地對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進行定量檢測，且具有特異性好、靈敏度高的特點。

以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

(1)主要儀器

cfx96熒光定量pcr儀、c1000梯度pcr擴增儀、qx200微滴數(shù)字pcr儀、dg8cartridge、微滴生成儀、px1熱封儀均為bio-rad公司。nanodrop2000超微量分光光度計為thermofisherscientific公司。高速冷凍離心機；常溫離心機為eppendorf公司。

(2)材料和試劑

trizol購于invitrogen公司。反轉錄試劑盒、病毒rna/dna提取試劑盒、sybrrt-pcr試劑盒均購于大連takara公司。evagreenddpcrsupermix、dropletgenerationoilforevagreen購于bio-rad公司。

實施例1

本實施例提供了一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法，其包括以下步驟：

1.1待測樣品病毒rna的提取及cdna的合成

待測樣品可以為組織病料或臨床血液樣本、也可以是病毒的細胞培養(yǎng)物。

當上述待檢樣品為組織病料或細胞培養(yǎng)物時，可參考如下方法提取病毒rna：將待測樣品進行研磨勻漿(細胞培養(yǎng)物不需要此過程)，反復凍融3次。將待測樣品于4℃離心機，12000g離心5min。抽取離心上清液，采用商品化病毒rna提取試劑盒進行rna提取，同時利用反轉錄試劑盒進行cdna的合成。

當上述待測樣品為血液或組織液等液體樣品時，可參考如下方法提取病毒rna：將待測樣品室溫靜置1個小時后，吸取上清于4℃離心機，5000g離心5min。抽取離心上清液，采用商品化病毒rna提取試劑盒進行rna提取，同時利用反轉錄試劑盒進行cdna的合成。

1.2配置pcr預混液，將pcr預混液形成微滴，并進行ddpcr反應

1.2.120μl的pcr預混液包括：2×evagreenddpcrsupermix10μl，正向引物(堿基序列如seqidno:1所示)和反向引物(堿基序列如seqidno:2所示)各125nm，待測樣品的cdna模板(含量大于0ng，小于200ng)，補滅菌水至總體積20μl。但需要說明的是，在其他的實施例中，各引物的濃度可以是120、122、124、126、128、130nm中的任意一種，只要在120-130nm的范圍內即可。

1.2.2將pcr預混液加入至微滴發(fā)生卡中制備微滴，然后將微滴轉入96孔pcr板，熱封后于pcr儀中進行ddpcr擴增反應。

1.2.3ddpcr反應的反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性10秒鐘，55℃退火30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共40個循環(huán)；72℃總延伸5分鐘；98℃10分鐘，結束反應。但需要說明的是，在其他的實施例中，退火溫度也可以是52℃、52.5℃、53.6℃、57.1℃、58.7℃、59.6℃以及60℃中的任意一種，只要在52-60℃的范圍即可。

1.3將擴增后的微滴放入微滴分析儀中，進行檢測分析

利用quantasoft軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算樣品中病毒rna的拷貝數(shù)。待測樣本檢測結果的判定方法為：

(1)陽性：標本檢測結果≥1個拷貝；(2)陰性：標本檢測結果<1拷貝。

實施例2

本實施例的提供了一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物，其包括其包括seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物。該引物針對美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒設計，適用于在ddpcr技術平臺上定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

本發(fā)明實施例提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物具有特異性好、靈敏度高的特點，可應用于ddpcr平臺對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進行定量檢測，以及用于對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期診斷和/或防疫。

實施例3

本實施例提供了一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其包括實施例5所述的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物。

需要說明的是，在其他的實施例中，該試劑盒還可包括：ddpcrsupermix(含ddpcr反應緩沖液、dntps、taq酶、熒光染料)、ddh2o、陽性標準品(含豬繁殖與呼吸綜合征病毒cdna的質粒)和微滴生成油中的一種或多種。

本發(fā)明實施例提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒可以結合ddpcr技術或普通pcr技術簡單、方便地對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進行定量檢測，且具有特異性好、靈敏度高的特點。

實施例4

在ddpcr平臺上優(yōu)化prrsvpcr反應的最佳退火溫度。

(1)在ddpcr平臺上配制如下ddpcr預混液：2×evagreenddpcrsupermix10μl，正向引物(seqidno:1)和反向引物(seqidno:2)各200nm，陽性質粒(10⁵/μl，含豬繁殖與呼吸綜合征病毒cdna序列)1μl，補滅菌水至總體積20μl。共做8個重復孔。

(2)在dg8cartridge上加入dropletgenerationoilforevagreen(微滴生產油)70μl；然后利用微滴生成儀生成微滴；將生成的微滴緩慢轉入96孔板相應位置，并用px1熱封儀于180℃封膜5s。

(3)將封好膜的96孔板轉入c1000梯度pcr擴增儀中進行pcr擴增。反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性10秒鐘，52-60℃(儀器自動分布8個溫度梯度)退火30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共40個循環(huán)；72℃總延伸5分鐘；98℃10分鐘結束反應。

(4)pcr擴增結束后將96孔板放入qx200微滴數(shù)字pcr儀的微滴熒光檢測儀進行熒光檢測，根據(jù)每管反應體系中陽性熒光微滴的數(shù)量和陽性微滴與陰性微滴之間的差異確定最佳退火溫度。結果如圖1和圖2所示(圖中：藍色代表陽性微滴(positive)，灰色代表陰性微滴(negative))。

圖1和圖2的結果顯示，在各個退火溫度(52℃、52.5℃、53.6℃、55.2℃、57.1℃、58.7℃、59.6℃、60℃)下均能產生大于10000的總微滴數(shù)，符合分析要求。雖然各個退火溫度下陽性微滴與陰性之間的差異相差不大，但是在退火溫度為55.2℃時的陽性微滴數(shù)明顯高于其他溫度(如圖2所示)，由此確定采用seqidno:1和seqidno:2所示的引物進行ddpcr反應最佳的退火溫度為55℃。

實施例5

在ddpcr平臺上優(yōu)化prrsvpcr反應的最適引物濃度。

為了進一步優(yōu)化pcr反應的最適引物濃度，在ddpcr平臺上配制如下反應混合液：2×evagreenddpcrsupermix10μl，正向引物(seqidno:1)和反向引物(seqidno:2)各(500nm、250nm、125nm)，陽性質粒(10⁴/μl)1μl，補滅菌水至總體積20μl。同一反應體系中，正反向引物濃度相同。

同時做相應無模板的空白對照(ntc)，檢驗陰性微滴基礎熒光值及反應體系的污染情況。根據(jù)每管反應體系陽性微滴與陰性微滴之間的差異及無模板陰性微滴的基礎熒光值確定最適引物濃度。結果如3所示。

圖3的結果顯示，在三種引物濃度條件下陽性微滴數(shù)基本一致，而在引物濃度為125nm時陽性微滴與陰性微滴之間的差異最大，且無模板陰性微滴的基礎熒光值最低，因此確定各引物的最適濃度為125nm，此時具有更低的本底信號，有利于提高檢測結果的準確性。

實施例6

特異性檢測

為了驗證實施例1提供的ddpcr方法在檢測prrsv中的特異性，利用prrsv的hn07-1和bj-4作為陽性模板，用其他幾種豬場中常見的病毒(csfv、pcv2、prv)的dna或者反轉錄的cdna為模板進行檢測，同時用prrsv陰性模板和無模板對照來檢測實施例1提供的ddpcr方法的特異性。結果如圖4所示(圖中：hn07-1代表hp-prrsv，bj-4代表經典prrsv，prrsv-代表prrsv陰性臨床樣本；csfv+為豬瘟病毒、pcv2+為豬圓環(huán)病毒ii型、prv+為豬偽狂犬病毒；ntc為無模板對照)。

圖4的結果顯示，只有在prrsv的hn07-1和bj-4陽性組產生了陽性微滴，在其他病毒陽性組(csfv+、pcv2+、prv+)，prrsv陰性組(prrsv-)和無模板對照組(ntc)均無陽性微滴產生，表明本發(fā)明實施例1提供的ddpcr方法具有較好的特異性，可對prrsv進行特異性檢測。

實施例7

靈敏度檢測

利用qrt-pcr和ddpcr分析不同prrsv的拷貝數(shù)

為了驗證實施例1提供的ddpcr方法在檢測prrsv中的靈敏度，利用實時熒光pcr技術，采用標準曲線方法，對不同拷貝數(shù)的prrsv進行相對定量。同時利用實施例1提供的ddpcr方法檢測相同的prrsv模板。分別計算樣品中prrsv拷貝數(shù)。結果圖5(圖中：a為bj-4的標準曲線，b為hn07-1的標準曲線)和表1所示。

圖5的結果顯示，采用qrt-pcr方法在10²～10⁶copies/μl拷貝數(shù)范圍內能達到較高的擴增效率并呈現(xiàn)較好的線性(bj-4的r²＝0.9971，hn07-1的r²＝0.9997)，但在拷貝數(shù)低于10copies/μl的prrsv時，cq值大于40(如表1)，結果準確度降低。

但是實施例1提供的ddpcr方法在低拷貝數(shù)(hn07-1為2.6×10¹copies/μl，bj-4為10copies/μl)時仍能較好的檢測出prrsv，且空白對照和陰性對照均未有陽性微滴(如表1)，說明實施例1提供的ddpcr方法具有較高的靈敏度，比qrt-pcr方法高10倍。

表1

對prrsv的qrt-pcr和ddpcr結果進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈線性相關，如圖6所示(圖中：a為qrt-pcr和ddpcr檢測bj-4的相關性分析，b為qrt-pcr和ddpcr檢測hn07-1的相關性分析)，bj-4和hn07-1的相關系數(shù)分別為0.99和0.982。

以上檢測結果證明了本發(fā)明的提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法和引物(包括seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物)特異性好、靈敏度高、可直接定量prrsv病毒拷貝數(shù)，檢測結果準確可靠。

綜上，本發(fā)明實施例提供的用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法、引物和試劑盒，其采用seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物并基于染料法微滴式數(shù)字pcr技術對prrsv進行絕對定量檢測，其檢測的靈敏度高于熒光定量pcr技術(10倍)；此外，本發(fā)明實施例提供的ddpcr方法可直接定量，不用設置標準曲線，根據(jù)檢測結果可以直接確定待測樣本中prrsv病毒的拷貝數(shù)，極大的簡化了操作步驟，而且特異性好、靈敏度高(最低可檢測10個病毒拷貝數(shù))。在臨床上可以更加快速、準確的實現(xiàn)對prrsv感染的診斷，可應用于在豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期診斷、防疫、疫苗質量控制等領域中，同時還能對prrsv病毒含量進行絕對定量，有利于進一步合理制定豬場的防控治療措施。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>河南大學

<120>一種用于絕對定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ddpcr方法、引物及其應

用和試劑盒

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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