本發(fā)明屬于植物分子育種學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種野生亞麻種子總dna提取方法。

背景技術(shù)：

目前植物總dna提取方法有ctab法，sds法，高鹽低ph值法等。亞麻總dna提取常用方法為高鹽低ph法，該方法常以莖葉為提取原材料。由于野生亞麻種子發(fā)芽率低，人工條件育苗獲得幼莖需要5個(gè)月時(shí)間，如果提取原料為多年生野生種，那么獲得所需的提取材料會(huì)更加困難，提取工作也受時(shí)間的限制。因此利用種子提取dna的方法便可以打破這種限制。由于野生亞麻種皮上的果膠質(zhì)遠(yuǎn)大于莖葉，故而提取難度較莖葉大。故本專利在前人研究基礎(chǔ)之上，著重解決利用野生亞麻種子提取總dna，既達(dá)到高濃度、高純度、大量提取的目的，又能克服提取時(shí)間的限制，滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供了一種野生亞麻種子總dna提取方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種野生亞麻種子總dna提取方法，包括如下步驟：

步驟1、用液氮將研缽和杵預(yù)冷，取0.25g野生亞麻種子置于研缽中，迅速研磨至粉末狀，之后向研缽中加入65℃的提取緩沖液10ml，在水浴鍋中繼續(xù)研磨至充分混勻，得到野生亞麻種子勻漿；

步驟2、將步驟1制得的野生亞麻種子勻漿用尼龍網(wǎng)兜過濾；

步驟3、將步驟2過濾后的濾液用1.5ml離心管分裝，每個(gè)離心管內(nèi)濾液容積為0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管，水浴后將離心管冷卻至室溫后，以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；

步驟4、將步驟3得到的上清液加入0.33體積的5mol/l的醋酸鉀溶液，混勻后置于0℃冰浴保持30min，以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；

步驟5、將步驟4得到的上清液加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后的溶液在-20℃條件下靜置2h得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質(zhì)分離，留懸浮物待用；

步驟6、將步驟5得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后在-20℃條件下靜置8～10h，得到的溶液中加人300μl超純水稀釋，稀釋后加5μlrna酶，混勻后置于水浴鍋中37℃水浴1h，得到溶液待用；

步驟7、將步驟6得到的溶液加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后在-20℃條件下靜置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質(zhì)分離，留懸浮物待用；

步驟8、將步驟7得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加25～50μl超純水混勻后，得到野生亞麻種子總dna，置于-80℃保存；

步驟9、將步驟8得到的野生亞麻種子總dna利用瓊脂糖檢測(cè)條帶完整性及純度，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟1中所述的提取緩沖液的配方為每1000ml緩沖液中含有100mmol醋酸鈉、50mmol乙二胺四乙酸二鈉、500mmol氯化鈉、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸鈉。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟2中的尼龍網(wǎng)兜過濾用紗布過濾代替。尼龍網(wǎng)兜過濾可用紗布代替，但會(huì)影響產(chǎn)量，如果不要求大量提取，可以用紗布替代。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟3中的水浴鍋中放置浮漂。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟4中醋酸鉀溶液的ph值為4.8。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟5中混勻后的溶液在室溫下靜置8～10h后得到混合物。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟5中的混合物在室溫下以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，得到沉淀物待用。步驟5中的混合物中沒有沉淀出現(xiàn)，則采用離心分離的方法得到沉淀物，用來代替微提取器吸取沉淀。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟7中的混合物在室溫下以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，得到沉淀物待用。步驟7中的混合物中沒有沉淀出現(xiàn)，則采用離心分離的方法得到沉淀物，用來代替微提取器吸取沉淀。

本發(fā)明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，經(jīng)液氮研磨之后，再用緩沖液研磨，使dna充分溶于緩沖液中而不被破壞，有益效果是加大了dna的產(chǎn)率。而經(jīng)過過濾的dna提取緩沖液在提取初期就先去掉一部分果膠質(zhì)，直接降低了dna的粘稠度。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)試劑無毒，提取量大，解決了無法獲得或者獲取莖葉材料困難的難題，打破dna提取在時(shí)間上限制，只要有種子且需要dna時(shí)，隨時(shí)可以提取。

附圖說明

附圖1為具體實(shí)施方式一野生亞麻種子總dna提取的電泳檢測(cè)對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：

一種野生亞麻種子總dna提取方法，包括如下步驟：

步驟1、用液氮將研缽和杵預(yù)冷，取0.25g野生亞麻種子置于研缽中，迅速研磨至粉末狀，之后向研缽中加入65℃的提取緩沖液10ml，在水浴鍋中繼續(xù)研磨至充分混勻，得到野生亞麻種子勻漿；

步驟2、將步驟1制得的野生亞麻種子勻漿用尼龍網(wǎng)兜過濾；

步驟3、將步驟2過濾后的濾液用1.5ml離心管分裝，每個(gè)離心管內(nèi)濾液容積為0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管，水浴后將離心管冷卻至室溫后，以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；

步驟4、將步驟3得到的上清液加入0.33體積的5mol/l的醋酸鉀溶液，混勻后置于0℃冰浴保持30min，以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；

步驟5、將步驟4得到的上清液加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后的溶液在-20℃條件下靜置2h得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質(zhì)分離，留懸浮物待用；

步驟6、將步驟5得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后在-20℃條件下靜置8h，得到的溶液中加人300μl超純水稀釋，稀釋后加5μlrna酶，混勻后置于水浴鍋中37℃水浴1h，得到溶液待用；

步驟7、將步驟6得到的溶液加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后在-20℃條件下靜置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質(zhì)分離，留懸浮物待用；

步驟8、將步驟7得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加25μl超純水混勻后，得到野生亞麻種子總dna，置于-80℃保存；

步驟9、將步驟8得到的野生亞麻種子總dna利用瓊脂糖檢測(cè)條帶完整性及純度，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟1中所述的提取緩沖液的配方為每1000ml緩沖液中含有100mmol醋酸鈉、50mmol乙二胺四乙酸二鈉、500mmol氯化鈉、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸鈉。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟3中的水浴鍋中放置浮漂。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟4中醋酸鉀溶液的ph值為4.8。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，附圖1為本實(shí)施方式野生亞麻種子總dna提取的電泳檢測(cè)對(duì)比圖，其中第1泳道為15000bp的dnamarker，第2、3、4泳道為本方法莖葉提取，第5、6、7、8為本方法種子提取，第9、10、11、泳道為3％ctab法。圖1電泳圖是dna提取液經(jīng)過稀釋5倍之后上樣獲得的。從電泳圖上可以看出種子總dna的提取量最大，條帶清晰無雜質(zhì)，提取dna長(zhǎng)度位于maker之上，提取的dna較完整，rna添加量適合，無污染，達(dá)到分子生物學(xué)要求，莖葉的提取量較低，條帶比較模糊，未達(dá)到分子生物學(xué)要求。3％ctab法沒有檢測(cè)出條帶。

具體實(shí)施方式二：

一種野生亞麻種子總dna提取方法，包括如下步驟：

步驟1、用液氮將研缽和杵預(yù)冷，取0.25g野生亞麻種子置于研缽中，迅速研磨至粉末狀，之后向研缽中加入65℃的提取緩沖液10ml，在水浴鍋中繼續(xù)研磨至充分混勻，得到野生亞麻種子勻漿；

步驟2、將步驟1制得的野生亞麻種子勻漿用紗布過濾；

步驟3、將步驟2過濾后的濾液用1.5ml離心管分裝，每個(gè)離心管內(nèi)濾液容積為0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管，水浴后將離心管冷卻至室溫后，以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；

步驟4、將步驟3得到的上清液加入0.33體積的5mol/l的醋酸鉀溶液，混勻后置于0℃冰浴保持30min，以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；

步驟5、將步驟4得到的上清液加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后的溶液在室溫下靜置2h后得到的混合物，在室溫下以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，得到的沉淀物待用；

步驟6、將步驟5得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后在-20℃條件下靜置8h，得到的溶液中加人300μl超純水稀釋，稀釋后加5μlrna酶，混勻后置于水浴鍋中37℃水浴1h，得到溶液待用；

步驟7、將步驟6得到的溶液加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后在-20℃條件下靜置2h，得到的混合物，在室溫下以轉(zhuǎn)速10000r/min，離心10分鐘，得到的沉淀物待用；

步驟8、將步驟7得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后，得到野生亞麻種子總dna，置于-80℃保存；

步驟9、將步驟8得到的野生亞麻種子總dna利用瓊脂糖檢測(cè)條帶完整性及純度，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟1中所述的提取緩沖液的配方為每1000ml緩沖液中含有100mmol醋酸鈉、50mmol乙二胺四乙酸二鈉、500mmol氯化鈉、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸鈉。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟3中的水浴鍋中放置浮漂。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟4中醋酸鉀溶液的ph值為4.8。

本實(shí)施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，表1列舉了不同方法提取dna的分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

表1不同方式提取dna分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表

從表1中明確看出，利用種子提取的dna濃度達(dá)到217ng/ul，濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他方法，該方法od260/od280為1.808，接近理論值1.80，表明提取的dna沒有蛋白質(zhì)污染，滿足分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要。