本發(fā)明屬于功能酶篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酯酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂類水解酶(lipolyticenzymes，ec3.1.1.x)是α/β水解酶家族的一員，可催化酯鍵的水解和合成，并廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。根據(jù)脂類水解酶催化底物脂肪酸鏈長(zhǎng)短的不同，可將其分為酯酶(esterase，ec3.1.1.1)和脂肪酶(lipase，ec3.1.1.3)。脂類水解酶在水相中可催化水解反應(yīng)的進(jìn)行，在有機(jī)體系中可催化轉(zhuǎn)酯、酯合、酯交換和氨解等多種反應(yīng)的進(jìn)行。脂類水解酶作用高效，反應(yīng)條件溫和，并且反應(yīng)過程中不需要輔酶的添加，不僅如此，脂類水解酶還具有高的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，它已成為工業(yè)生產(chǎn)的重要催化劑，如食品加工、洗滌劑、醫(yī)藥、精細(xì)化工等行業(yè)。

工業(yè)化對(duì)脂類水解酶需求的日益增長(zhǎng)，也促進(jìn)了篩選方法的不斷完善和發(fā)展。其中宏基因組文庫構(gòu)建法是通過抽提特定環(huán)境中所有微生物基因組dna，并進(jìn)行基因分析和克隆的一種手段。據(jù)報(bào)道，在自然界中，約99％的微生物處于不可培養(yǎng)狀態(tài)，因此構(gòu)建宏基因組文庫可以使自然界中的微生物資源得以充分的利用，宏基因組文庫成為獲得優(yōu)良性狀酶催化劑的一種高效手段。

蝦青素(astaxanthin)，也被稱為蝦黃質(zhì)、蝦黃素和龍蝦殼色素，類胡蘿卜素的一種，分子式為c40h52o4，是一種萜類不飽和化合物。蝦青素分布十分廣泛，特別是蝦蟹等水生動(dòng)物中，是這類生物的主要色素，如龍蝦等海產(chǎn)品紅潤(rùn)的肉色，即蝦青素在體內(nèi)的積累而成。蝦青素不穩(wěn)定，易被氧化，氧化后的產(chǎn)物為蝦紅素(as-tacene)。大量研究表明，蝦青素具有良好的生理功能，如抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等，分子結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，使得蝦青素成為自然界最強(qiáng)的抗氧化劑。蝦青素因其良好的生物學(xué)功能，已被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)。目前，蝦青素的制備主要有化學(xué)合成法和生物獲取法兩種，其中化學(xué)合成的蝦青素已被美國(guó)食品與藥物管理局(fda)明確禁止進(jìn)入保健市場(chǎng)，這是因?yàn)榛瘜W(xué)合成的蝦青素在結(jié)構(gòu)、生理功能和應(yīng)用等方面與天然蝦青素存在明顯的差異，而且化學(xué)合成過程中不可避免的引入雜質(zhì)，影響了蝦青素使用的安全性。生物中獲取蝦青素的方法包括：①?gòu)乃a(chǎn)品加工的下腳料，如蝦殼、蟹殼中提??；②培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素；③培養(yǎng)微藻(雨生紅球藻)生產(chǎn)蝦青素。其中，蝦殼蟹殼和雨生紅球藻內(nèi)的蝦青素主要以復(fù)雜的蝦青素酯的形式存在，而不同的蝦青素酯的功能又存在差異，這就限制了這兩種來源的蝦青素的進(jìn)一步高值化利用。通過將蝦青素酯進(jìn)行水解，制備出的游離蝦青素具有廣泛的應(yīng)用。一方面，游離蝦青素可通過連接特定脂肪酸，制備具有特定功能的蝦青素酯，另一面，游離蝦青素可以用于與蝦青素酯的功能比較研究。不僅如此，制備出高純度的游離蝦青素，還可以用作標(biāo)準(zhǔn)品。

目前水解蝦青素酯制備游離蝦青素的方法，主要采用皂化法，但皂化過程使用了大量的堿和有機(jī)溶劑，破壞了環(huán)境，造成了浪費(fèi)，不僅如此，堿的使用，還會(huì)使蝦青素遭到破壞，產(chǎn)生蝦紅素等副產(chǎn)物。另一種是采用酯酶或脂肪酶水解法，這為蝦青素酯的水解提供了一條新的思路。但目前存在的脂類水解酶水解法仍存在處理量小和轉(zhuǎn)化率低等問題，因此尋找新型脂類水解酶將其應(yīng)用于游離蝦青素的制備中，顯得至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型酯酶，以及利用該酯酶的水解活性高效催化水解蝦青素酯來制備游離蝦青素的方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種酯酶，該酯酶包含有：

1)氨基酸序列為seqidno:1的酶；

2)在1)中取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，由1)所衍生的，具有1)中酯酶功能的酶；

編碼上述酯酶的基因，其一種核苷酸序列為seqidno:2；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體攜帶有編碼上述酯酶的基因；

本發(fā)明還提供重組宿主，用于重組表達(dá)上述的酯酶；

本發(fā)明的酯酶用于制備催化水解蝦青素酯來制備游離蝦青素。

其一種具體制備方法，是使用酯酶粉水解雨生紅球藻油和/或蝦油來制備游離蝦青素。

本發(fā)明的酯酶可催化蝦青素酯的水解生成游離蝦青素，在催化水解48h后，使大部分的蝦青素酯得以水解，水解度可達(dá)99％以上，體現(xiàn)了該酯酶在天然游離蝦青素制備上的潛能。

附圖說明

圖1：不同脂類水解酶催化蝦青素酯水解的示意圖；

圖2：本發(fā)明的酯酶est3-14進(jìn)化樹分析及多重序列比對(duì)示意圖；

圖3：本發(fā)明的酯酶est3-14的sds-page電泳圖。泳道0是蛋白marker，泳道1是表達(dá)后菌體破碎液上清，泳道2是表達(dá)后菌體破碎液沉淀，泳道3是純化后的est3-14；

圖4：est3-14酶學(xué)性質(zhì)研究。圖a是est3-14底物碳鏈長(zhǎng)度的偏好性，圖b是est3-14的最適溫度，圖c是est3-14的最適ph，圖d是表面活性劑對(duì)est3-14酯酶活力的影響；

圖5：est3-14催化蝦青素酯水解的hplc結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明用到了分子生物學(xué)和酶催化領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)該發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1：新型酯酶的異源表達(dá)及蝦青素酯水解酶的篩選

對(duì)構(gòu)建的海洋淤泥宏基因組文庫進(jìn)行測(cè)序后，通過序列功能分析，我們從中找到了一些具有假定脂類水解酶活性的目的片段。挑選部分脂類水解酶片段(est3-14，x1，x2，x3，x4，x5，x6)進(jìn)行異源表達(dá)，載體使用pet-28a(+)，宿主采用bl21(de3)。

對(duì)上述宏基因組來源的脂類水解酶工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，50ml發(fā)酵液離心去除上清，菌體先利用0.9％nacl溶液進(jìn)行沖洗，后使用6mltris-hcl緩沖液(100mm，ph7.5)進(jìn)行復(fù)溶，并于冰浴下進(jìn)行超聲破碎。破碎液上清用于水解蝦青素酯功能的驗(yàn)證，水解反應(yīng)體系如下：0.5％雨生紅球藻油，0.5ml無水乙醇，6ml破碎液上清。將反應(yīng)混合液置于37℃水浴搖床中震蕩孵育48h后，使用萃取液(異丙醇/二氯甲烷＝1:1)進(jìn)行反復(fù)抽提，并進(jìn)行tlc法檢測(cè)生成的游離蝦青素。tlc結(jié)果(圖1)顯示，脂類水解酶est3-14具有水解蝦青素酯制備游離蝦青素的能力，而x1，x2，x3，x4，x5，x6這6種脂類水解酶無法水解蝦青素酯。

實(shí)施例2：酯酶est3-14基因序列分析

脂類水解酶est3-14的家族分類，使用文獻(xiàn)已報(bào)道的方法來進(jìn)行，使用mega6.0軟件構(gòu)建est3-14與其他家族脂類水解酶的進(jìn)化樹，clustalx軟件用于對(duì)脂類水解酶進(jìn)行多序列比對(duì)，espript3.0(http://espript.ibcp.fr/espript/espript/)用于比對(duì)序列的輸出。如圖2a所示，est3-14屬于脂類水解酶第v家族，并具有典型的催化三聯(lián)體ser(115位)，asp(237位)，his(363位)(圖2b)。該酶與genbank中已報(bào)道蛋白的氨基酸相似度最高僅為51％(acidimicrobiumsp.)。

實(shí)施例3：酯酶est3-14的純化

重新對(duì)酯酶est3-14進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，通過離心收集菌體，并使用滅菌生理鹽水清洗菌體一次。清洗結(jié)束后，使用含有10mm咪唑的tris-hcl緩沖液(ph8.0,100mm)復(fù)溶菌體，并置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上進(jìn)行超聲破碎，破碎液上清用于酯酶est3-14的純化。該純化過程采用鎳柱(1ml，qiagen，hilden，germany)來進(jìn)行，蛋白的梯度洗脫使用含有不同濃度咪唑(20mm-500mm)的tris-hcl緩沖液(ph8.0，100mm)。洗脫后的溶液分別進(jìn)行收集，并使用超濾濃縮管(～10kda)進(jìn)行濃縮脫鹽，并進(jìn)行蛋白電泳分析及脂肪酶/酯酶酶活檢測(cè)。

上述酯酶est3-14的蛋白凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，條帶0是蛋白marker，條帶1是菌體破碎液上清，條帶2是菌體破碎液沉淀，條帶3是純化后的est3-14。

實(shí)施例4：酯酶est3-14酶學(xué)性質(zhì)研究

經(jīng)實(shí)施例3純化后的酯酶est3-14，用作酶學(xué)性質(zhì)研究。

(1)酯酶est3-14底物特異性研究

對(duì)est3-14的最適底物進(jìn)行探索，該過程選用不同碳鏈長(zhǎng)度的pnp酯(c2，c4，c8，c10，c12，c14，c16)：pnpacetate(pnpa)，pnpbutyrate(pnpb)，pnpcaprylate(pnpc)，pnpdecanoate(pnpd)，pnplaurate(pnpl)，pnpmyristate(pnpm)和pnppalmitate(pnpp)。最適碳鏈長(zhǎng)度下的活性定義為100％，其他碳鏈長(zhǎng)度下的活性以對(duì)最高活性的百分比表示。如圖4a所示，est3-14的底物譜廣泛，對(duì)c2-c16的pnp酯都有水解活性，其中est3-14對(duì)c4(pnpb)的水解活性最高，對(duì)碳鏈長(zhǎng)度>10的pnp酯水解活性較弱，說明est3-14是一個(gè)酯酶。

(2)酯酶est3-14最適溫度

酯酶est3-14的最適溫度，通過在不同溫度(20，25，30，35，40，45，50℃)下孵育反應(yīng)，并檢測(cè)吸光值a405來確定。最適溫度下的活性定義為100％，其他溫度下的活性以對(duì)最高活性的百分比表示。由結(jié)果(圖4b)可以看出，溫度<40℃時(shí)，隨著溫度的升高，酯酶活性逐漸升高，溫度>40℃后，隨著溫度升高，酯酶活性逐漸降低，est3-14的最適溫度為40℃。

(3)酯酶est3-14最適ph

ph對(duì)酯酶est3-14活性的影響，使用不同ph的不同緩沖液來檢測(cè)。該過程使用的緩沖液包括：100mm檸檬酸緩沖液(ph4.0-6.0)，100mm磷酸鈉緩沖液(ph6.0-8.0)，100mmtris-hcl緩沖液(ph8.0-9.0)和100mmna2co3-nahco3緩沖液(ph9.0-10.0)。最適ph下的活性定義為100％，其他ph下的活性以百分比來表示。結(jié)果(圖4c)顯示，est3-14在ph為9的na2co3-nahco3緩沖液中顯示出最高的水解活性，并且較之酸性條件，est3-14在堿性條件下顯示出更高的水解活性，說明est3-14屬于一個(gè)典型的堿性酯酶。(4)表面活性劑對(duì)酯酶est3-14活性的影響

為了檢測(cè)表面活性劑對(duì)酯酶est3-14的影響，我們通過向反應(yīng)液中添加不同的表面活性劑(終濃度0.5％)來測(cè)定，其中使用的試劑包括：sds，tritonx-100，tween20，tween60和tween80。反應(yīng)液中未添加表面活性劑時(shí)測(cè)得的活性定義為100％，添加了表面活性劑的以百分比表示。結(jié)果如圖4d所示，通過與未添加表面活性劑的樣品對(duì)比，發(fā)現(xiàn)tritonx-100、tween20、tween60和tween80都對(duì)酯酶酶活的提高具有促進(jìn)作用，其中tween20對(duì)酯酶est3-14水解活性的提高最大，提高了22.7％，sds則對(duì)est3-14的活性具有顯著的抑制效果。

(5)金屬離子對(duì)酶活的影響

金屬離子對(duì)酯酶est3-14活性的影響，通過向反應(yīng)體系中添加終濃度為1mm和10mm的金屬離子(cocl2，kcl，licl，feso4，fecl3，mncl2，cacl2，mgcl2，zncl2和nicl2)以及na2-edta來測(cè)定。未添加金屬離子和na2-edta的作為對(duì)照，其活性定義為100％，結(jié)果如下表所示。

外部添加金屬離子，并未對(duì)est3-14水解活性的提高起到顯著的促進(jìn)作用，在1mm金屬離子的添加量下，co²⁺和k⁺對(duì)酶活的提高有輕微的促進(jìn)作用，酶活分別提高到107.9％和105.6％，其他金屬離子和na2-edta則對(duì)est3-14的酶活有抑制作用。在10mm金屬離子和na2-edta的添加量下，酯酶est3-14的水解活性都受到了不同程度的抑制，其中zn²⁺對(duì)酶活的抑制效果最強(qiáng)，活性僅為對(duì)照組的23.2％。

(6)有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響

有機(jī)溶劑對(duì)酯酶est3-14活性的影響，通過向反應(yīng)體系中添加終濃度為25％、50％和100％的有機(jī)溶劑來進(jìn)行檢測(cè)，選擇的有機(jī)溶劑包括：甲醇、乙醇、乙腈、正己烷、氯仿、二甲亞砜、丙酮、正丙醇、異丙醇、異辛烷和環(huán)己烷。測(cè)定前，將酶液與有機(jī)溶劑混合后置于30℃下震蕩孵育3h，殘余的酯酶酶活用比色法進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)于疏水性有機(jī)溶劑，孵育后的混合液通過離心去除有機(jī)溶劑后，剩余的酶液水相進(jìn)行酶活測(cè)定；對(duì)于親水性有機(jī)溶劑，孵育后的混合液用緩沖液進(jìn)行稀釋，至有機(jī)溶劑的濃度為5％后進(jìn)行測(cè)定，消除有機(jī)溶劑對(duì)酶活測(cè)定的影響。

如下表所示，est3-14在低濃度(25％)的親水有機(jī)溶劑中保持了較好的活性，并且隨著濃度提高到50％，酶活呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，但當(dāng)親水有機(jī)溶劑的濃度提高到100％后，est3-14在部分親水有機(jī)溶劑中的活性較之50％下的活性，有了明顯提高，比如est3-14在50％乙腈中殘留的活性為20.0％，在100％乙腈中的活性為90.2％。est3-14在疏水性有機(jī)溶劑中殘留的活性，表現(xiàn)出不規(guī)則的變化。其中，est3-14在無水正己烷中活性較高，經(jīng)孵育后，殘留活性仍可以達(dá)到88.2％，這暗示了est3-14在正己烷中進(jìn)行非水相催化的潛力。

實(shí)施例4：酯酶est3-14催化水解雨生紅球藻油中蝦青素酯

重新發(fā)酵酯酶est3-14，離心收集后的大腸桿菌，使用超純水進(jìn)行復(fù)溶，并置于超聲破碎機(jī)下進(jìn)行破碎處理。通過離心去掉破碎液沉淀后，破碎液上清進(jìn)行冷凍干燥，制得的est3-14酶粉用于蝦青素酯水解的研究。反應(yīng)體系如下：0.5％雨生紅球藻油，0.5ml無水乙醇，6mltris-hcl緩沖液，1700u酯酶est3-14(以對(duì)pnpb的水解活性定義)。將反應(yīng)混合液置于37℃水浴搖床中震蕩反應(yīng)，分別于48h和72h下取樣使用hplc法檢測(cè)生成的游離蝦青素含量。

hplc結(jié)果如圖5所示，在hplc圖譜上，峰1為生成的游離蝦青素，20min以后出峰的物質(zhì)為蝦青素酯。通過與0h的結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在外部添加1700u酯酶est3-14后，蝦青素酯在48h時(shí)可以水解比較完全，且水解率達(dá)到99％以上，結(jié)果表明篩選得到的est3-14在水解蝦青素酯方面具有非常好的潛力。

實(shí)施例5：酯酶est3-14催化蝦油中蝦青素酯的水解

按照實(shí)施例4中的方法，發(fā)酵制備est3-14酶粉，并將其應(yīng)用于蝦油中蝦青素酯的水解研究。水解體系如下：1.0％蝦油，0.5ml無水乙醇，6mltris-hcl緩沖液，2000u酯酶est3-14(以對(duì)pnpb的水解活性定義)。將反應(yīng)混合液置于37℃水浴搖床中震蕩反應(yīng)48h，并使用hplc法檢測(cè)生成的游離蝦青素含量。

水解結(jié)果顯示，在添加2000u酯酶est3-14的條件下，蝦油中的蝦青素酯在48h內(nèi)基本被水解完全，水解率可達(dá)99％以上，并且大大降低了蝦紅素等副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

sequencelisting

<110>中國(guó)海洋大學(xué)

<120>一種酯酶及其應(yīng)用

<130>

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