本發(fā)明屬于異煙肼應(yīng)用藥理領(lǐng)域，特別涉及一種基于sanger測(cè)序原理一次性檢出nat2影響抗結(jié)核藥物異煙肼療效及毒副作用常見(jiàn)功能突變位點(diǎn)的技術(shù)方法及配套的試劑。

背景技術(shù)：

異煙肼(isoniazid，inh)又名雷米封(rimifon)。異煙肼對(duì)結(jié)核桿菌有高度選擇性，抗菌力強(qiáng)，在試管中0.025～0.05mg/l的濃度即可抑菌，較高濃度對(duì)繁殖期細(xì)菌有殺菌作用。單用時(shí)結(jié)核桿菌易產(chǎn)生耐藥性，但與其他抗結(jié)核藥無(wú)交叉耐藥性，如與其他抗結(jié)核病聯(lián)用，則能延緩耐藥性的發(fā)生并增強(qiáng)療效。抗菌機(jī)制可能是抑制分枝菌酸(mycolicacid)的合成，使細(xì)菌喪失耐酸性、疏水性和增殖力而死亡。此酸是結(jié)核桿菌細(xì)胞所特有的重要成分，因此異煙肼對(duì)其他細(xì)菌無(wú)作用。

異煙肼在肝細(xì)胞內(nèi)有多條代謝通路，其一是經(jīng)由nat2代謝為乙酰異煙肼，隨后被水解為無(wú)毒的二乙酰肼；其二是經(jīng)由nat2代謝為乙酰異煙肼或單乙酰肼后，再由細(xì)胞色素p450氧化酶2e1(cyp2e1)氧化為乙酰二氮烯，乙酰基離子，或乙酰基烯酮等細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物。這些水解代謝產(chǎn)物通過(guò)谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶(gstm1)，與甘氨酸結(jié)合并解毒后，再經(jīng)由腎臟排出體外。

不同個(gè)體同一條染色體上同一位點(diǎn)的核苷酸序列絕大多數(shù)是一致的，當(dāng)單個(gè)核苷酸堿基不同而導(dǎo)致核酸序列呈包括置換、缺失和插入等多態(tài)性時(shí)，稱單核苷酸多態(tài)性，即snp。snp現(xiàn)象在生物體內(nèi)廣泛存在，它是生物遺傳變異的表現(xiàn)之一，因而snp對(duì)研究人類遺傳和進(jìn)化具有重要意義。藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，編碼異煙肼體內(nèi)代謝酶的基因如果發(fā)生功能性變異snp，將會(huì)引起個(gè)體對(duì)異煙肼的反應(yīng)產(chǎn)生差異，這也是異煙肼抗結(jié)核療效和毒副反應(yīng)差異的根本原因。其中，nat2基因序列中擁有許多功能性變異snp，這些基因變異導(dǎo)致nat2代謝酶的酶活性在人群中呈現(xiàn)三種狀態(tài)，即快速乙?；瘋€(gè)體，中速乙酰化個(gè)體和慢速乙?；瘋€(gè)體。nat2常見(jiàn)的7個(gè)功能性snps如下表1。

表1.nat2基因7個(gè)常見(jiàn)慢乙?；蛔兾稽c(diǎn)

表注：以上所有數(shù)據(jù)來(lái)自pharmgkb，maf(minimumallelefrequency)，為1000genomes數(shù)據(jù)庫(kù)chb中的maf。

在中國(guó)人群中快速乙酰化個(gè)體的比例約為35％，中速乙酰化個(gè)體約為47％，慢速乙?；瘋€(gè)體約為18％。這一數(shù)據(jù)在歐美白種人群中分別為6％，37％和57％。nat2代謝酶活性狀態(tài)呈現(xiàn)了明顯的種族差異和個(gè)體差異。根據(jù)過(guò)去多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)以及薈萃分析研究，慢速乙?；瘋€(gè)體由于無(wú)法迅速將異煙肼代謝為無(wú)活性代謝產(chǎn)物，從而面臨較高的肝臟損害風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，在使用相同藥物劑量時(shí)，快速乙?；瘋€(gè)體較中速及慢速乙?；瘋€(gè)體更容易出現(xiàn)治療無(wú)效。根據(jù)這些研究結(jié)果，美國(guó)fda在異煙肼的藥物說(shuō)明書(shū)中，明確指出了nat2遺傳變異與異煙肼引發(fā)的肝臟毒性的相關(guān)性，要求臨床醫(yī)生在使用該藥物前，需先了解nat2基因變異情況。此外，cyp2e1，gstm1基因突變也將改變患者體內(nèi)異煙肼毒性代謝產(chǎn)物的濃度，但薈萃分析研究并未得出相關(guān)遺傳變異與異煙肼肝臟毒性的顯著相關(guān)性。因此，nat2慢速乙?；瘋€(gè)體仍然是異煙肼肝臟毒性的高風(fēng)險(xiǎn)人群。

根據(jù)nat2以上snps的檢測(cè)，則可以判斷出nat2的乙?；愋?，幫助臨床醫(yī)生異煙肼個(gè)體化給藥?？旖?、方便、全面和準(zhǔn)確檢測(cè)出nat2常見(jiàn)突變位點(diǎn)的方法可為異煙肼個(gè)體化用藥提供便利，然而目前尚未建立符合這些特點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)，本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明為首創(chuàng)。

綜合比較目前snp檢測(cè)方法有以下一些技術(shù)，具體應(yīng)用時(shí)則需要根據(jù)所要檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)和樣本數(shù)來(lái)選擇和建立相應(yīng)的技術(shù)方法。

1、sanger測(cè)序法

sanger測(cè)序法是每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dntp)使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddntp)使之終止。由于ddntp缺乏延伸所需要的3’-oh基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在g、a、t或c處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dntps和ddntps的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用x-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

優(yōu)點(diǎn):(1)測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn)，讀長(zhǎng)長(zhǎng)，目前sanger遺傳分析儀測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)到950bp及以上。(2)精準(zhǔn)：流程細(xì)致，質(zhì)控環(huán)節(jié)多，污染低，結(jié)果直觀可視，假性結(jié)果極低。(3)可進(jìn)行個(gè)性化位點(diǎn)檢測(cè)，可以任意選擇單項(xiàng)測(cè)序，sanger測(cè)序個(gè)性化基因檢測(cè)有價(jià)格優(yōu)勢(shì)。由于臨床測(cè)序特點(diǎn)是：目標(biāo)明確、結(jié)果精準(zhǔn)、通量小，sanger測(cè)序非常適用于臨床。

缺點(diǎn)：通量低，成本高，鑒于測(cè)序本身方法的局限，測(cè)序引物后10bp～40bp無(wú)法保證準(zhǔn)確。

2、taqman探針?lè)?/p>

taqman探針?lè)ǖ暮诵木褪翘禺愋缘男揎椈鶊F(tuán)(minorgroovebinder，mgb)探針技術(shù)，已證實(shí)的taqman探針，3’-端結(jié)合mgb技術(shù)，能更好的進(jìn)行等位基因的區(qū)分。mgb分子結(jié)合到dna螺旋小溝，通過(guò)穩(wěn)定mgb探針/模板聯(lián)合體提高雜交的檢驗(yàn)。這種超強(qiáng)的穩(wěn)定性可使短至13個(gè)堿基的探針提高錯(cuò)配的辨別力，并為困難多變的序列設(shè)計(jì)提供更高的靈活性。所有的mgb探針都包括一個(gè)不發(fā)熒光的猝滅基團(tuán)(nfq)，它能真正消除傳統(tǒng)猝滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提高-檢測(cè)靈敏性。taqman探針?lè)捎糜诨驘晒舛糠治?、甲基化檢測(cè)、snp分型、mirna定量分析等等，但taqman探針?lè)ǖ娜秉c(diǎn)就是探針購(gòu)買太貴，適于大樣本量，少量snp位點(diǎn)分析。

3、beckmansnpgenomestream技術(shù)

beckman技術(shù)的特點(diǎn)就是單堿基延伸法，設(shè)計(jì)時(shí)每個(gè)位點(diǎn)共設(shè)計(jì)3條引物，2條是擴(kuò)增引物，1條為單堿基延伸引物(這個(gè)引物也可理解為探針)。beckman的技術(shù)比較適合恰好有12個(gè)位點(diǎn)，48個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)，只有幾個(gè)位點(diǎn)，或者恰巧不是12或48的倍數(shù)時(shí)，就不合算。另外標(biāo)本量不能太低，beckman檢測(cè)采用384板，適于大樣本量。

4、snapshot法

snapshot法由美國(guó)應(yīng)用生物公司(abi)開(kāi)發(fā)，是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱小測(cè)序，主要針對(duì)中等通量的snp分型項(xiàng)目。在一個(gè)含有測(cè)序酶、四種熒光標(biāo)記ddntp、緊臨多態(tài)位點(diǎn)5’-端的不同長(zhǎng)度延伸引物和pcr產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)abi測(cè)序儀檢測(cè)后，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的snp位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。對(duì)于pcr產(chǎn)物模板可通過(guò)多重pcr反應(yīng)體系來(lái)獲得。通常用于10-30個(gè)snp位點(diǎn)分析。snapshot法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，可以在多種遺傳分析儀上進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地基因分型，實(shí)現(xiàn)了snp分析的自動(dòng)化，可以方便高效地用于高通量的snp驗(yàn)證及中通量的snp篩選。

5、hrm法

高分辨率熔解曲線分析(hrm)是近幾年興起的snp研究工具，它通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈dna熒光染料與pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來(lái)判斷是否存在snp，而且不同snp位點(diǎn)、是否是雜合子等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此hrm分析能夠有效區(qū)分不同snp位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測(cè)方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無(wú)需序列特異性探針，在pcr結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。該方法無(wú)需設(shè)計(jì)探針，操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。

運(yùn)用hrm技術(shù)可以進(jìn)行樣本中已知突變位點(diǎn)的檢測(cè)、未知新突變位點(diǎn)的鑒定，已知多態(tài)位點(diǎn)如snps、短串聯(lián)重復(fù)序列、微衛(wèi)星、條形碼序列等的檢測(cè)等。hrm技術(shù)已經(jīng)在人類和動(dòng)植物遺傳疾病的分子診斷、動(dòng)植物各類多態(tài)位點(diǎn)的鑒定與檢測(cè)、動(dòng)物生產(chǎn)繁殖數(shù)量性狀位點(diǎn)的鑒定與檢測(cè)等研究領(lǐng)域獲得了應(yīng)用，并取得了很多新的研究進(jìn)展。

6、snp芯片法

dna芯片技術(shù)是一種dna序列變異檢測(cè)工具。dna芯片(dnachip)，也稱生物芯片(biochip)，其大小與計(jì)算機(jī)上的cpu芯片相似，約1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作為載體基片，芯片上鋪了一層肉眼看不見(jiàn)的dna纖維“地毯”，即具有特定堿基序列的探針。待測(cè)基因經(jīng)提取后，被切成長(zhǎng)短不一的片段，經(jīng)熒光化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記后，注射到嵌有芯片的載片上。由于dna和探針雜交的程度與熒光強(qiáng)度相關(guān)，因此通過(guò)激光掃描，即可根據(jù)熒光強(qiáng)弱測(cè)出被檢測(cè)序列的變異。成本昂貴，適用于多基因大量snps檢測(cè)服務(wù)。

7、massarray法

massarray分子量陣列技術(shù)是sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具，通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的maldi-tof-ms技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測(cè)?；趍assarray平臺(tái)的iplexgold技術(shù)可以設(shè)計(jì)最高達(dá)40重的pcr反應(yīng)和基因型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高。根據(jù)應(yīng)用需要，對(duì)數(shù)十到數(shù)百個(gè)snp位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)百至數(shù)千份樣本檢測(cè)時(shí)，massarray具有最佳的性價(jià)比，特別適合于對(duì)全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。

8、illuminabeadxpress法

采用illumina公司的beadxpress系統(tǒng)進(jìn)行批量snp位點(diǎn)檢測(cè)，可以同時(shí)檢測(cè)1-384個(gè)snp位點(diǎn)，往往用于基因組芯片結(jié)果確認(rèn)，適合高通量檢測(cè)。微珠芯片具有高密度、高重復(fù)性、高靈敏度、低上樣量、定制靈活等特點(diǎn)，極高的集成密度，從而獲得極高的檢測(cè)篩選速度，在高通量篩選時(shí)可顯著降低成本。

我們的待測(cè)目標(biāo)基因nat2全長(zhǎng)含有9969bp堿基，但僅有兩個(gè)外顯子，1號(hào)外顯子snp突變情況十分罕見(jiàn)，而nat2這些基因突變幾乎全部落在2號(hào)外顯子1296bp區(qū)間內(nèi)，并且這些snps物理位置上相連，前后兩頭跨度667bp。本項(xiàng)目技術(shù)主要是根據(jù)以上snp檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用范圍，結(jié)合本項(xiàng)目的一些自身特點(diǎn)而選擇建立。比較分析表明，taqman探針?lè)?、beckmansnpgenomestream技術(shù)、massarray法、illuminabeadxpress法和snp芯片法比較適合高通量測(cè)序，樣本量小的情況下則成本較高；hrm法適應(yīng)未知突變snp的鑒定，尤其是難辨snp的區(qū)分時(shí)則具有其優(yōu)勢(shì)，適合少量snps及大樣本量的應(yīng)用；而snapshot法在某種程度而言，是sanger測(cè)序法的一種特殊應(yīng)用，sanger測(cè)序法是目前判斷snp的金標(biāo)準(zhǔn)，讀長(zhǎng)長(zhǎng)，結(jié)果精準(zhǔn)，質(zhì)控環(huán)節(jié)多，污染低，結(jié)果直觀可視，假性結(jié)果極低；可進(jìn)行個(gè)性化位點(diǎn)檢測(cè)，可以任意選擇單項(xiàng)測(cè)序；sanger測(cè)序個(gè)性化基因檢測(cè)有價(jià)格優(yōu)勢(shì)，技術(shù)應(yīng)用成熟，一般實(shí)驗(yàn)室均有相應(yīng)儀器配備；此外，sanger測(cè)序適應(yīng)于臨床應(yīng)用測(cè)序特點(diǎn)：目標(biāo)明確、結(jié)果精準(zhǔn)、通量小。與以上其他技術(shù)，通常的比較上而言，sanger測(cè)序有一些缺點(diǎn)：如通量低，成本高，鑒于測(cè)序本身方法的局限，測(cè)序引物后10bp～40bp無(wú)法保證準(zhǔn)確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是建立一種一次性檢出nat2常見(jiàn)功能snps的sanger測(cè)序法，同時(shí)可能發(fā)現(xiàn)新的snps。發(fā)明包括特異性擴(kuò)增nat2目的區(qū)間全長(zhǎng)片段引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證；最佳普通pcr及測(cè)序pcr反應(yīng)各試劑濃度及參數(shù)的確定和驗(yàn)證；nat2基因突變檢測(cè)各試劑指標(biāo)及參數(shù)的確立及驗(yàn)證；nat2基因突變檢測(cè)方法的測(cè)試應(yīng)用?？煽旖?、方便、全面和準(zhǔn)確檢測(cè)出nat2常見(jiàn)突變位點(diǎn)，為異煙肼個(gè)體化用藥提供便利，本技術(shù)發(fā)明具有首創(chuàng)性。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

用于異煙肼個(gè)體化用藥一次性檢出nat2常見(jiàn)功能snps的sanger測(cè)序法，包括如下步驟：

步驟一、生物信息學(xué)分析：進(jìn)入pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)網(wǎng)站，從nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中，查找nat2基因序列，位于8號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)9969bp,總共兩個(gè)外顯子，并且cds區(qū)域全部位于2號(hào)外顯子；獲得2號(hào)外顯子序列，物理位置為：18399851-18401110，共1296bp；

步驟二、錨定并標(biāo)記nat2常見(jiàn)突變snps在待測(cè)分析序列上的位置：rs1801280、rs1799929、rs1208、rs1799930、rs1041983、rs1799931和rs1801279分別為7個(gè)堿基為nat2常見(jiàn)突變snps所分布的位置，前后總共667bp；

步驟三、設(shè)計(jì)待測(cè)區(qū)域特異性引物，針對(duì)nat2基因7個(gè)常見(jiàn)功能snps，設(shè)計(jì)特異性引物，要求擴(kuò)增包含這些突變位點(diǎn)nat2目的區(qū)間全長(zhǎng)片段，并具有特異性。針對(duì)nat2第2號(hào)外顯子，利用pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)自帶primer-blast工具，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，考慮到目前sanger測(cè)序讀長(zhǎng)限制，設(shè)定＜1000bp的擴(kuò)增區(qū)間，并保證snp位點(diǎn)均需落于擴(kuò)增片段區(qū)間；所設(shè)計(jì)的引物為：

1、primerf：gatcatggacattgaagcatat；primerr：tcaaaataacgtgagggtagag；

2、primerf：cgggctgttccctttga；primerr：ttagtgagttgggtgata。

步驟四、擴(kuò)增引物特異性驗(yàn)證：對(duì)普通pcr反應(yīng)體系及參數(shù)進(jìn)行確定，對(duì)普通pcr循環(huán)體系參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)；

步驟五、測(cè)序pcr反應(yīng)，產(chǎn)物純化，樣品上機(jī)測(cè)序分析，結(jié)果判讀分析，

步驟六、技術(shù)方法測(cè)試應(yīng)用，待測(cè)樣本隨機(jī)選取，普通pcr反應(yīng)，測(cè)序pcr反應(yīng)，測(cè)試結(jié)果對(duì)比分析。

進(jìn)一步的，所述步驟四中，nat2普通pcr反應(yīng)體系為：

進(jìn)一步的，普通pcr初步循環(huán)參數(shù)摸索條件：在94℃預(yù)變性5min,接著35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)的程序包括94℃變性45s,tm(55-65℃)退火45s,72℃延伸45s,循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸10min；

pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：瓊脂糖膠的制備：取0.75g瓊脂糖，加入tae50ml，微波(100s)加熱溶解，將溶液倒入，使其沒(méi)過(guò)樣孔板。點(diǎn)樣：loadingbuffer(gelred):2.0ul，pcr產(chǎn)物:3.0ul，maker(500-2000bp):5.0ul。電泳條件：電壓：110v,t＝40min方向：負(fù)極向正極。

進(jìn)一步的，所述步驟四中，pcr緩沖體系及pcr循環(huán)參數(shù)，得出引物1和2最佳的溫度分別為61℃和60℃。

進(jìn)一步的，該方法在異煙肼個(gè)體化用藥一次性檢出nat2常見(jiàn)snps中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，引物1和引物2在異煙肼個(gè)體化用藥一次性檢出nat2常見(jiàn)snps中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，一種異煙肼個(gè)體化用藥一次性檢出nat2常見(jiàn)snps的試劑盒，該試劑盒中含有引物1和引物2序列。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明中nat2基因snp的數(shù)量及物理分布特點(diǎn)，sanger測(cè)序可以降低約1/7的成本，相對(duì)于其他技術(shù)更有價(jià)格優(yōu)勢(shì)；項(xiàng)目通過(guò)精確設(shè)置引物，使待測(cè)snps避開(kāi)sanger測(cè)序引物后10bp～40bp區(qū)段不能判讀的位置，因此本發(fā)明方法建立的sanger法測(cè)序技術(shù)，可以通過(guò)單次測(cè)序反應(yīng)，同時(shí)全面檢測(cè)多個(gè)snps，因此可以充分發(fā)揮sanger測(cè)序一次性全面檢出nat2已知突變位點(diǎn)的能力，甚至包括未知新的突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。

本發(fā)明為首次研發(fā)出一次性檢出nat2目的突變位點(diǎn)的sanger法測(cè)序方法，可用于臨床及科研，大小樣本均能靈活適用，為異煙肼的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥提供全面準(zhǔn)確的nat2遺傳信息；

可以在一次性單樣本測(cè)序中完成幾乎所有nat2常見(jiàn)snp突變的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)單樣本單次檢測(cè)多個(gè)snps的功能，大幅度降低單個(gè)snp檢測(cè)成本，同時(shí)方法不僅適用于小、中樣本量檢測(cè)，也適用于大樣本量的檢測(cè)，能靈活應(yīng)用于臨床及研究領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)省時(shí)、經(jīng)濟(jì)和高效的結(jié)合，用于臨床及科研，為異煙肼的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥提供全面準(zhǔn)確的遺傳信息。

附圖說(shuō)明

圖1.pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)查找nat2核苷酸序列；

圖2.獲取nat2第2號(hào)2外顯子；

圖3.nat2第2號(hào)外顯子序列區(qū)間；

圖4.nat2常見(jiàn)7個(gè)突變snps在序列上的錨定；

圖5.primer-blast工具對(duì)nat2進(jìn)行引物設(shè)計(jì)參數(shù)設(shè)置1；

圖6.primer-blast工具對(duì)nat2進(jìn)行引物設(shè)計(jì)參數(shù)設(shè)置2；

圖7.primer-blast工具對(duì)nat2進(jìn)行引物設(shè)計(jì)參數(shù)設(shè)置3；

圖8.引物1特異性擴(kuò)增出976bp片段pcr結(jié)果；

圖9.引物1特異性擴(kuò)增出825bp片段pcr結(jié)果；

圖10.引物1擴(kuò)增976bp序列原始電泳圖；

圖11.引物2擴(kuò)增825bp序列原始電泳圖；

圖12.引物1和引物2正、反向測(cè)序擴(kuò)增子圖；

圖13.引物1和引物2正、反向測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)比較摘要報(bào)告；

圖14.引物1正、反向測(cè)序結(jié)果顯示結(jié)果具有一致性；

圖15.引物2正、反向測(cè)序結(jié)果顯示結(jié)果具有一致性；

圖16.引物1和引物2正、反向測(cè)序結(jié)果在nat2序列上位置錨定重合示意圖；

圖17.技術(shù)研發(fā)流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

如圖1所示，

第一部分：

一、生物信息學(xué)分析：進(jìn)入pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)網(wǎng)站，從nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中，查找nat2基因序列，位于8號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)9969bp,總共兩個(gè)外顯子，并且cds區(qū)域全部位于2號(hào)外顯子；獲得2號(hào)外顯子序列，共1296bp，物理位置為：18399851-18401110，總共1296bp，序列具體如圖1-3：

二、錨定并標(biāo)記nat2常見(jiàn)突變snps在待測(cè)分析序列上的位置：如圖批注所指示的7個(gè)堿基為nat2常見(jiàn)突變snps(rs1801280、rs1799929、rs1208、rs1799930、rs1041983、rs1799931和rs1801279)所分布的位置，前后總共667bp，如圖4。

三、設(shè)計(jì)待測(cè)區(qū)域特異性的引物：

針對(duì)nat2基因7個(gè)常見(jiàn)慢乙酰化突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，要求擴(kuò)增包含這些突變位點(diǎn)nat2目的區(qū)間全長(zhǎng)片段，并具有特異性。針對(duì)nat2第2號(hào)外顯子，利用pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)自帶primer-blast工具，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，考慮到目前sanger測(cè)序讀長(zhǎng)限制，設(shè)定＜1000bp的擴(kuò)增區(qū)間，并保證snp位點(diǎn)均需落于擴(kuò)增片段區(qū)間，引物設(shè)計(jì)步驟如圖5-7：

挑選的引物如下表2，分別對(duì)應(yīng)待測(cè)序列圖4中的綠色和粉色區(qū)域，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別為976和825bp。

表2.選取的primer-blast工具設(shè)計(jì)的引物

四、擴(kuò)增引物特異性驗(yàn)證

1、pcr緩沖體系確定和優(yōu)化，包含ddh2o、10×buffer、dntp、taqdna聚合酶、模板dna、primerf和primerr濃度和體積優(yōu)化。

nat2普通pcr反應(yīng)初步體系如下表3：

表3.nat2普通pcr反應(yīng)體系

2、pcr循環(huán)參數(shù)確定和優(yōu)化；

普通pcr初步循環(huán)參數(shù)摸索條件：在94℃預(yù)變性5min,接著35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)的程序包括94℃變性45s,tm(55-65℃)退火45s,72℃延伸45s,循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸10min。

3、pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：瓊脂糖膠的制備：取0.75g瓊脂糖，加入tae50ml，微波(100s)加熱溶解，將溶液倒入，使其沒(méi)過(guò)樣孔板。點(diǎn)樣：loadingbuffer(gelred):2.0ul，pcr產(chǎn)物:3.0ul，maker(500-2000bp):5.0ul。電泳條件：電壓：110v,t＝40min方向：負(fù)極向正極。

4、電泳紫外成像結(jié)果：maker，pcr產(chǎn)物(左→右)點(diǎn)樣，如出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，對(duì)應(yīng)的引物則為理想引物。

5、結(jié)果：

5.1引物1擴(kuò)增結(jié)果：能特異性擴(kuò)增出976bp大小的目的條帶。且經(jīng)過(guò)pcr循環(huán)溫度摸索初步發(fā)現(xiàn)7-9泳道區(qū)間的擴(kuò)增循環(huán)溫度比較適宜，擴(kuò)增條帶特異性高，無(wú)其他雜帶和引物二聚體出現(xiàn)，見(jiàn)圖8。

5.2引物2擴(kuò)增結(jié)果：能特異性擴(kuò)增出825bp大小的目的條帶。且經(jīng)過(guò)pcr循環(huán)溫度摸索初步發(fā)現(xiàn)9-12泳道區(qū)間的擴(kuò)增循環(huán)溫度比較適宜，擴(kuò)增條帶特異性高，無(wú)其他雜帶和引物二聚體出現(xiàn)，見(jiàn)圖9。

6、針對(duì)篩選出的特異性引物，反復(fù)驗(yàn)證優(yōu)化pcr緩沖體系及pcr循環(huán)參數(shù)，得出引物1和2最佳的tm分別為61℃和60℃：

五、pcr產(chǎn)物純化

采用柱純化：

(一)試劑盒采用離心吸附柱純化酶切、pcr等反應(yīng)溶液中的dna片段，同時(shí)除去蛋白質(zhì)、其它有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)鹽離子及寡核苷酸引物等雜質(zhì)，回收100bp-10kbdna片段，回收率可達(dá)80％以上，每個(gè)離心吸附柱每次可吸附的dna量為10μg。

(二)材料與方法

1.材料：pcr產(chǎn)物

2.儀器、用具：恒溫孵育器(65℃)、離心機(jī)、移液器、1.5ml離心管

3.試劑：天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的普通dna產(chǎn)物純化試劑盒(dp204)

4.步驟(參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)執(zhí)行)：使用前請(qǐng)先在漂洗液pw中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。

(1)柱平衡步驟：向吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400×g)離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2重新放回收集管中。(請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子)

(2)估計(jì)pcr反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液的體積，向其中加入5倍體積的結(jié)合液pb，充分混勻(無(wú)需去除石蠟油或礦物油)。注意：如pcr反應(yīng)體系為50μl(不包括石蠟油體積),則加入250μl結(jié)合液pb。

(3)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2min，12,000rpm(～13,400×g)離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管中。注意：吸附柱容積為800μl，若樣品體積大于800μl可分批加入。

(4)向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管中。注意：如果純化的dna是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，建議pw加入后靜置2-5min再離心。

(5)重復(fù)操作步驟4。

(6)將吸附柱cb2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱cb2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、pcr等)實(shí)驗(yàn)。

(7)將吸附柱cb2放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30-50μl洗脫緩沖液eb，室溫放置2min。12,000rpm(～13,400×g)離心2min收集dna溶液。注意：洗脫液的體積不應(yīng)少于30μl，體積過(guò)少會(huì)影響回收的效率。洗脫液的ph值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測(cè)序，需使用ddh2o做洗脫液，并保證其ph值在7.0-8.5范圍內(nèi)，ph值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；且dna產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防dna降解。dna也可以用緩沖液(10mmtris-cl,ph8.0)洗脫。為了提高dna的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，將dna溶液收集到離心管中。

(8)取5μl樣品，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化結(jié)果。

六、測(cè)序pcr反應(yīng)

(一)實(shí)驗(yàn)試劑：已經(jīng)純化好的pcr產(chǎn)物，測(cè)序引物，terminatorv3.1cyclesequencingkit，ddh2o，pop-7^tmpolymer，anodebuffercontainer3500series(ab公司)，cathodebuffercontainer3500series(ab公司)，hi-di(去離子甲酰胺)

(二)實(shí)驗(yàn)耗材：96孔板，0.2mlep管，移液槍，125mmedta(ph＝8)，3mnaac(ph＝5.2)，無(wú)水乙醇，計(jì)時(shí)器，記號(hào)筆

(三)實(shí)驗(yàn)操作具體步驟：

1.pcr產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系摸索：包含pcr產(chǎn)物、引物、terminatorv3.1、sequencebuffer和ddh2o濃度和體積優(yōu)化。

將引物和擴(kuò)增dna產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序pcr反應(yīng)，nat2初步測(cè)序pcr反應(yīng)體系配置參照下表4：

表4.測(cè)序pcr反應(yīng)體系配置參照表

2.測(cè)序pcr循環(huán)條件：

96℃1min→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)×25循環(huán)→4℃保溫。

七、測(cè)序產(chǎn)物純化(酒精/edta/naac法)：

每管加入2ml125mmedta(ph＝8)，2ml3mnaac(ph＝5.2)，加到管底；加入50ml100％酒精，封嚴(yán)，震蕩4次，室溫放置15min；3000xg4℃離心30min，馬上倒置96孔板，185×g離心1min；加入70ml70％酒精，3000xg4℃離心15min，馬上倒置96孔板，185×g離心1min；70％酒精重復(fù)洗滌1次或2次；讓殘余的酒精在室溫?fù)]發(fā)干。

八、樣品變性，上機(jī)測(cè)序分析

酒精完全揮發(fā)后，加入10mlhi-di甲酰胺，95℃變性4min，迅速置冰上4min，上樣，采用遺傳分析儀3500進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果采用配套軟件variantreporter2和seqa6分析，并與正常nat2進(jìn)行比對(duì)分析，判斷測(cè)序的結(jié)果。

九、將產(chǎn)物測(cè)序pcr產(chǎn)物純化后，在abi基因分析儀3500(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，將測(cè)序產(chǎn)物與參照序列進(jìn)行比對(duì)和判讀。

第二部分：

一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.引物1擴(kuò)增976bp的測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果能準(zhǔn)確的被儀器判讀出來(lái)，序列讀取區(qū)間976bp已經(jīng)全部包含nat2常見(jiàn)7個(gè)突變位點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和峰度均可初步達(dá)到要求，見(jiàn)圖10。

2.引物2擴(kuò)增825bp的測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果能準(zhǔn)確的被儀器判讀出來(lái)，序列讀取區(qū)間825bp已經(jīng)全部包含nat2常見(jiàn)7個(gè)突變位點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和峰度均可初步達(dá)到要求，見(jiàn)圖11。

二、技術(shù)應(yīng)用測(cè)試

隨機(jī)選擇代表性的一些樣本，分別同時(shí)采用引物1和引物2進(jìn)行測(cè)序，并將結(jié)果對(duì)比分析，判斷結(jié)果是否一致。經(jīng)過(guò)分析，兩對(duì)引物在隨機(jī)60份樣本的測(cè)試中，結(jié)果一致性達(dá)到100％，因此項(xiàng)目基于引物1和引物2建立的sanger測(cè)序技術(shù)特異性和準(zhǔn)確性均已達(dá)到應(yīng)用的要求，可以為異煙肼個(gè)體化給藥提供準(zhǔn)確的nat2遺傳信息，技術(shù)應(yīng)用測(cè)試代表性樣本圖譜如圖12-16所示：

三、結(jié)論

引物1和引物2正、反向測(cè)序結(jié)果標(biāo)明，nat2檢測(cè)突變位點(diǎn)在隨機(jī)代表性樣本待測(cè)序列上的標(biāo)識(shí)位置重合性100％，均判讀為nat2*6c慢乙酰化個(gè)體，結(jié)果具有高度一致性，因此本項(xiàng)技術(shù)具有可靠的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，適合臨床及科研，為異煙肼的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥提供全面準(zhǔn)確的遺傳信息，整個(gè)技術(shù)研發(fā)流程見(jiàn)圖17。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。