本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法及所產(chǎn)纖維素酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：纖維素酶在蝸牛的消化道中被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)以后，纖維素在微生物降解的問題上就受到世界科學(xué)家們較大的關(guān)注。美軍的natick實(shí)驗(yàn)室隨后就已經(jīng)研究了有關(guān)微生物降解在軍用纖維素材料方面的防護(hù)問題，在后來研究中發(fā)現(xiàn)纖維素除了能夠被微生物降解以外，生產(chǎn)出來的生產(chǎn)原料也十分豐富經(jīng)濟(jì)，自然界中不斷產(chǎn)生的固體廢物問題也有望能夠得到解決。在此以后，纖維素酶得到了更為廣泛的關(guān)注。纖維素在地球上分布最廣，也是含量最豐富的碳水化合物，且植物總干重的35％-50％都是纖維素。對人類來說，纖維素更是自然界中數(shù)量最為龐大的可再生性物質(zhì)，自然界的碳素循環(huán)機(jī)制中必不可少的中心環(huán)節(jié)就是它的降解過程。充分利用纖維素與它的轉(zhuǎn)化條件對于解決目前世界性重大問題如世界糧食短缺、能源危機(jī)、環(huán)境污染等上具有十分重要的意義。纖維素酶在食品加工、化工生產(chǎn)、醫(yī)藥保健、釀造行業(yè)、飼料生產(chǎn)、農(nóng)副產(chǎn)品深加工、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景和十分深厚的潛力。然而，纖維素酶存在產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力低，而且所產(chǎn)生的酶的組分不完整或不平衡等問題，纖維素酶作用的機(jī)制至今尚未被研究得完全清楚的重要原因，也是實(shí)際的應(yīng)用和研究存在距離較大的最為主要的原因。香菇在傘菌目中屬于口蘑科，是一種既能藥用，也受民眾喜愛的一類食用菌，成為世界上第二大食用菌。在民間，香菇在烹飪時味道非常鮮美，肉質(zhì)肥厚，香氣沁人心脾，營養(yǎng)含量又極其豐富，被人們稱譽(yù)為“山珍”，更享有“植物皇后”美譽(yù)。目前，中國在香菇生產(chǎn)上一年的產(chǎn)量可達(dá)8萬噸，在世界總年產(chǎn)量中占有80%以上的比例，高居于世界第一位，出口量達(dá)到3.6萬噸，也居于世界的首位。在香菇栽培中，鋸末、秸稈等這類富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的物質(zhì)是碳源的主要來源。香菇擁有將這些大的分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)從而能夠被利用的胞外酶，這說明纖維素酶系在香菇中有十分豐富的含量。目前研究香菇產(chǎn)多糖的居多，而對香菇發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究卻很少見，這方面的空白如果得不到填補(bǔ)將是極大的浪費(fèi)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對以上不足，本發(fā)明的目的是提供一種高效的香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)12-16d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入60-90ml液體培養(yǎng)基，置于24-32℃、100-160r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)96-192h。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還有進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn)。本發(fā)明中的pda培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。進(jìn)一步地，所述pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。進(jìn)一步地，在加入所述液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)氮源或培養(yǎng)碳源；所述培養(yǎng)氮源為酵母膏、牛肉膏、玉米面、(nh4)2so4中的一種，且所加入的所述培養(yǎng)氮源的量為4-6g/l；所述培養(yǎng)碳源為蔗糖、葡萄糖、羧甲基纖維素、甘蔗渣、淀粉中的一種，且所加入的所述培養(yǎng)碳源的量為18-25g/l。進(jìn)一步地，所述菌片的數(shù)量為3-5片。進(jìn)一步地，所述香菇菌種在所述pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為3-8min。進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)時間為144h。進(jìn)一步地，所述搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。本發(fā)明的另一個目的是提供香菇發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶在降解草本或木本植物中的纖維物質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明公開的香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法所生產(chǎn)的纖維素酶可以有效應(yīng)用于降解草本或木本植物中的纖維物質(zhì)，提高草本或木本植物中的纖維物質(zhì)的降解效率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，通過新的培養(yǎng)基以及補(bǔ)料的組分、濃度等，來提高香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的水平，從而提高纖維素酶的產(chǎn)量。新的培養(yǎng)基以及補(bǔ)料的組分、濃度等配置合理、互相配合，通過合理的組分和濃度，即對香菇纖維素酶基因的表達(dá)促進(jìn)，又對香菇纖維素酶的產(chǎn)生實(shí)行誘導(dǎo)，還不會因組分、濃度不合理而造成酶活的抑制，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)纖維素酶的目的。本發(fā)明還提供香菇發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶在降解草本或木本植物中的纖維物質(zhì)的應(yīng)用，為降解草本或木本植物中的纖維物質(zhì)提供了一種新的方式。具體實(shí)施方式下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)14d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到75ml液體培養(yǎng)基中，菌片為4片，置于28℃、120r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)144h。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。實(shí)施例2本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)12d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到60ml液體培養(yǎng)基中，菌片為3片，置于24℃、100r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)96h。在加入液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)碳源，培養(yǎng)碳源為蔗糖，加入的蔗糖的量為18g/l。香菇菌種在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為3min。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。實(shí)施例3本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)16d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到90ml液體培養(yǎng)基中，菌片為5片，置于32℃、160r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)192h。在加入液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)碳源，培養(yǎng)碳源為葡萄糖，加入的葡萄糖的量為25g/l。香菇菌種在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為8min。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。實(shí)施例4本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)15d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到75ml液體培養(yǎng)基中，菌片為4片，置于28℃、120r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)144h。在加入液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)碳源，培養(yǎng)碳源為羧甲基纖維素，加入的羧甲基纖維素的量為20g/l。香菇菌種在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為5min。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。實(shí)施例5本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)14d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到60ml液體培養(yǎng)基中，菌片為3片，置于24℃、100r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)96h。在加入液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)氮源，培養(yǎng)氮源為酵母膏，加入的酵母膏的量為18g/l。香菇菌種在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為3min。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。實(shí)施例6本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)12d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到90ml液體培養(yǎng)基中，菌片為5片，置于32℃、150r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)192h。在加入液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)氮源，培養(yǎng)氮源為牛肉膏，加入的牛肉膏的量為25g/l。香菇菌種在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為8min。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。實(shí)施例7本實(shí)施例提供一種香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，在pda培養(yǎng)基上接種香菇菌種進(jìn)行培養(yǎng)15d，用無菌打孔器打孔成10mm的菌片后加入到75ml液體培養(yǎng)基中，菌片為4片，置于28℃、120r/min的搖床條件下發(fā)酵培養(yǎng)144h。在加入液體培養(yǎng)基時，還同時加入培養(yǎng)氮源，培養(yǎng)氮源為玉米面，加入的玉米面的量為20g/l。香菇菌種在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，置于15w、25cm的紫外燈條件下進(jìn)行誘變處理，處理時間為5min。其中，pda培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、瓊脂20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，進(jìn)行倒平板操作。其中，液體培養(yǎng)基的制備方法為：取馬鈴薯200g，去皮、切塊，加水1000ml，煮沸，紗布過濾；分別加入蔗糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、維生素b10.01g，加熱溶化；ph自然；置于121℃滅菌鍋中滅菌20min，裝于錐形瓶中。在進(jìn)行完香菇發(fā)酵培養(yǎng)纖維素酶后，對產(chǎn)酶效率進(jìn)行測定。香菇發(fā)酵培養(yǎng)纖維素酶后獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，再經(jīng)過離心機(jī)3000r/min轉(zhuǎn)速離心15min后，取溶液的上清液，為粗酶液，此時粗酶液即為纖維素酶液。取已離心的粗酶液置于沸水浴中持續(xù)滅活10min，待用。將滅活后的粗酶液適當(dāng)稀釋后取0.5ml，加入2.0ml底物（底物指將0.6g的羧甲基纖維素鈉溶于100ml、ph值4.8的檸檬酸緩沖溶液的所得物中，振蕩混勻，于60℃條件下，持續(xù)保溫30min后，加入2.5ml的3，5-二硝基水楊酸溶液后，置沸水浴中5min后，馬上用自來水冷卻。在imark酶標(biāo)儀上測出540nm的吸光值，對照葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出酶的活力。對實(shí)施例1~7的技術(shù)方案所獲纖維素酶液進(jìn)行酶活計算，計算結(jié)果見下表。方案酶活（mg/ml）實(shí)施例10.23實(shí)施例20.48實(shí)施例30.35實(shí)施例40.33實(shí)施例50.39實(shí)施例60.41實(shí)施例70.45從上表中可以看出，本發(fā)明實(shí)施例提供的方案具有很好的產(chǎn)酶能力，尤其是添加培養(yǎng)碳源或培養(yǎng)氮源和引進(jìn)紫外光光源后，酶活提高明顯，香菇產(chǎn)纖維素酶的能力得到進(jìn)一步加強(qiáng)，產(chǎn)酶效率大大提高，說明了本發(fā)明提供的香菇發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法簡單而高效，能實(shí)現(xiàn)低投入高產(chǎn)出的香菇產(chǎn)纖維素酶的目的。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12