本發(fā)明屬于畜牧業(yè)養(yǎng)殖技術領域，具體涉及一種處理糞便的微生物制劑及其制備方法和應用。

背景技術：

畜牧養(yǎng)殖業(yè)是農業(yè)的重要組成部分，自90年代中期開始，我國的畜牧業(yè)逐漸形成集中養(yǎng)殖、規(guī)?；a的經營方式，但隨之而來的環(huán)境污染和糞污排放問題也逐漸成為社會關注的熱點之一，隨著各項涉污染排放法規(guī)的出臺和嚴格執(zhí)行，許多環(huán)境排放不達標的企業(yè)不得不面臨關停的窘境。

畜牧養(yǎng)殖場的污染物中有機物、惡臭氣體等濃度較高，目前針對其產生量大、難處理等問題，陸續(xù)出現了一些新型處理工藝。這些新型工藝綜合運用減量化、資源化、生態(tài)化及無害化處理手段，突破了傳統(tǒng)方法臟、臭、累且效率低下的弊端。這些新技術中包括了現代生物技術法，它是利用環(huán)境微生物快速分解畜禽糞便營養(yǎng)成分的能力，通過堆肥、密閉厭氧增氧產氣等培養(yǎng)方式減少排泄物中有害物質含量的一種處理方法。

微生物發(fā)酵床技術，是新一代糞污生物處理技術，它利用從自然環(huán)境中分離獲取的微生物，快速降解畜禽糞便中的有機物以及其他有害物質。高效混合菌劑的獲得需要經歷采集菌樣(養(yǎng)殖場附近土壤)、分離純化、制備菌種、擴大培養(yǎng)的過程，并將混合菌劑按比例撒到鋪好的有機墊料上，翻犁均勻，?；蜇i等畜禽在發(fā)酵床上生活，畜禽糞尿會被微生物快速消化、降解。該技術以畜禽糞便作為微生物生長原料，不再需要人工清理糞便，是一種對糞便進行原位分解處理的現代綠色畜牧業(yè)技術，可以真正地實現無污染、零排放的目的，操作簡便、經濟高效、省時省力。該技術的核心是發(fā)酵床中的有效微生物的種類及數量。高效混合菌劑中的微生物在生化功能上互為補充，可以高效快捷地分解畜禽糞便中的纖維素、半纖維素、脂肪類以及蛋白質等殘余物，生成抑制病原微生物生長的有機酸和無臭的co2、n2等氣體。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是，提供一種處理糞便的微生物制劑及其制備方法和應用。本發(fā)明技術方案從奶牛養(yǎng)殖場的原生態(tài)微生物菌群出發(fā)，通過科學的培養(yǎng)、富集、訓化以及放大，得到適應本地奶牛糞污，并可以高效實現生物降解的微生物菌劑，并通過施灑到奶牛養(yǎng)殖床中，實現零排放地糞便處理。

本發(fā)明為解決上述技術問題所采用的技術方案如下：

一種處理糞便的微生物制劑，其特征在于：通過在培養(yǎng)基中添加有機酸和糞臭化合物進行微生物的富集和馴化獲得所述微生物制劑，所述微生物制劑中的活菌菌落數為5x10⁸～2x10⁹cfu/g。

優(yōu)選地，所述有機酸包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸，每種有機酸在培養(yǎng)基中的濃度分別為0.05％～0.2％(v/v)。

優(yōu)選地，所述糞臭化合物包括吲哚和糞臭素，吲哚和糞臭素在培養(yǎng)基中的濃度分別為0.01％～0.02％(w/v)。

優(yōu)選地，所述吲哚和糞臭素先溶于無水乙醇后再添加至培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述微生物制劑主要包括芽孢桿菌、類芽孢桿菌、乳酸桿菌、紅曲霉菌和粉狀畢赤酵母菌。

本發(fā)明還提供一種處理糞便的微生物制劑的制備方法，該方法包括如下步驟：

步驟1，將牛糞便固形物以1％-2％(w/v)的比例接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度30～35℃、轉速150～250rpm條件下，培養(yǎng)5～7天；

步驟2，將步驟1獲得的菌液以1％-5％(w/w)的比例接種到固體發(fā)酵基質中，發(fā)酵溫度為30～35℃，每日攪動拌料，連續(xù)培養(yǎng)10～20日，制得固體發(fā)酵的微生物種源；

步驟3，將前述固體發(fā)酵的微生物種源以1％-5％(w/w)的比例接種到固體發(fā)酵基質中，發(fā)酵溫度為30～35℃，每日攪動拌料，連續(xù)培養(yǎng)20-30天，制得所述微生物制劑。

優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)基的制備步驟如下：

步驟1，配制基本培養(yǎng)基，各組分的質量體積百分比為(w/v)：1.0％-2.0％米糠、1.0％-2.0％菜粕、2.0％-3.0％魚粉、0.5％-1.0％稻草，其余為水；

步驟2，在前述基本培養(yǎng)基中分別加入乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸；每種酸的加入量為0.05％～0.2％(v/v)；

步驟3，在前述基本培養(yǎng)基中分別加入吲哚和糞臭素的乙醇溶液，所述吲哚和糞臭素在基本培養(yǎng)基中的濃度為0.01％～0.02％(w/v)；調整ph值至5.8-6.3，高壓滅菌制得所述液體培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述固體發(fā)酵基質的制備步驟如下：

步驟1，配制基本培養(yǎng)基，各組分的質量體積百分比為(w/v)：36％-40％米糠、8％-12％菜粕、8％-12％魚粉、12％-16％稻草，2％-4％牛糞，其余為水；

步驟2，在前述基本培養(yǎng)基中分別加入乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸；每種酸的加入量為0.05％～0.2％(v/v)；

步驟3，在前述基本培養(yǎng)基中分別加入吲哚和糞臭素的乙醇溶液，所述吲哚和糞臭素在基本培養(yǎng)基中的濃度為0.01％～0.02％(w/v)；高壓滅菌制得所述液體培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了所述的微生物制劑在降解處理奶牛糞便中的應用。具體地，將所述微生物制劑均勻施灑到富含木質纖維素的生物質奶牛養(yǎng)殖床中，對奶牛糞便進行原位分解。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明利用牛糞便污染物的化學組成及其對微生物生長的影響，結合微生物的生理特性，通過固液發(fā)酵組合的方式，富集并放大高效菌種的密度，為奶牛養(yǎng)殖業(yè)提供了可實現零排放的切實可行的技術方案，解決了高密度養(yǎng)殖方式下的繁重污染治理的技術問題。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中制得的微生物制劑中包含的原核微生物種類的組成和相對含量的示意圖；其中黑色圖框表示訓化前原始樣品中的菌，斜條紋圖框表示訓化后微生物制劑中的菌。

圖2是本發(fā)明實施例中制得的微生物制劑中包含的真核微生物種類的組成和相對含量的示意圖；其中黑色圖框表示訓化前原始樣品中的菌，斜條紋圖框表示訓化后微生物制劑中的菌。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細說明。以下采用的生物材料、試劑或實驗儀器如未特別說明，均為商業(yè)化產品。

本發(fā)明的技術方案具體是：將牛糞自然堆積環(huán)境(堆肥處理及自然堆積場)中的微生物群落先經基本培養(yǎng)基培養(yǎng)；向基本培養(yǎng)基中分別加入各種有機酸及糞臭化合物，進行富集培養(yǎng)；培養(yǎng)物進一步通過固體培養(yǎng)基質進行兩次放大培養(yǎng)；通過在固體培養(yǎng)基質中添加乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、吲哚、糞臭素等有機酸和糞臭化合物進行篩選訓化，獲得能夠高效降解糞便污染物的微生物菌群。

實施例1：高效微生物制劑的富集

基本液體培養(yǎng)基(w/v)含1.0％米糠、1.0％菜粕、2.0％魚粉、0.5％稻草；稱0.1g吲哚和糞臭素(3-甲基吲哚)，分別溶于1ml無水乙醇中，搖勻，備用；在基本液體培養(yǎng)基中分別添加100μl(0.1％，v/v)乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸以及100μl(0.01％，w/v)吲哚、糞臭素(3-甲基吲哚)。為了充分混勻，可將吲哚和糞臭素先溶解于無水乙醇，然后再添加至培養(yǎng)基中。調整ph至6.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

稱0.1g經堆肥處理的牛糞，接種于上述液體培養(yǎng)基中，接種量0.1％(w/v)，30℃、200r·min^-1搖床培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)48h，收集菌液用作固體富集及放大培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液。

實施例2：高效微生物制劑(1千克)的擴培

固體培養(yǎng)基質含(w/w)38.0％米糠、10.0％菜粕、10.0％魚粉、14.0％稻草、3.0％牛糞，其余為水分。將配制的培養(yǎng)基放于大型玻璃燒杯中，以鋁箔低覆蓋，放于滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌20min；

取50g實施例1中富集的種子培養(yǎng)液，接入滅菌后經降溫至室溫的上述固體培養(yǎng)基質中，接種量為5.0％(w/w)，并且往上述混合物中分別加入0.1％(v/v)的乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸以及0.02％(w/v)的吲哚、糞臭素。為了充分混勻，可將吲哚和糞臭素先溶解于無水乙醇，然后再添加至培養(yǎng)基中。充分混合均勻后，將混合物裝入1kg呼吸袋中，封口，放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)15～20天，每天人工進行充分混勻3～5次，保持呼吸袋不受損。

收集經連續(xù)培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)物，用作10千克微生物菌劑的放大培養(yǎng)。

實施例3：高效微生物制劑(10千克)的擴培

首先制備固體培養(yǎng)基質1kg，1kg培養(yǎng)基的配方如下(w/w)：38.0％米糠、10.0％菜粕、10.0％魚粉、14.0％稻草、3.0％牛糞，其余為水分，培養(yǎng)基放于大的無紡布袋中，置于一個鋼制托盤中，放于滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌20min；

取500g實施例2中擴培后的固體培養(yǎng)物，接入上述固體培養(yǎng)基質中，接種量5.0％(w/w)，混合均勻，裝入10kg呼吸袋中，并且往上述混合物中分別加入0.1％(v/v)的乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸以及0.01％(w/v)的吲哚、糞臭素。為了充分混勻，可將吲哚和糞臭素先溶解于無水乙醇，然后再添加至培養(yǎng)基中。封口，30℃靜置培養(yǎng)20～30天，每天充分混勻數次，獲得能夠高效處理牛糞便的微生物制劑。

實施例4：微生物制劑的菌群檢測

稱5～10g待檢測樣品，提取總基因組dna，具體提取步驟參照omega試劑盒e.z.n.atmmag-bindsoildnakit的試劑盒使用說明書(網址鏈接：http://www.omegabiotek.com.cn/product/109.html)。將基因組提交到至生物公司進行16s、18s宏基因組測序及生物信息學比較分析，其中用于擴增16s的引物對分別為341f：5′-ccctacacgacgctcttccgatctgcctacgggnggcwgcag-3′及805r：5′-gactggagttccttggcacccgagaattccagactachvgggtatctaatcc-3′；而用于擴增18s的引物對為ns1：5′-cctacacgacgctcttccgatctngtagtcatatgcttgtctc-3′及fung：5′-gactggagttccttggcacccgagaattccaattccccgttacccgttg-3′。

利用qubit2.0dna檢測試劑盒對基因組dna精確定量，以確定pcr反應應加入的dna量。pcr所用的引物融合了miseq測序平臺的通用引物，并利用pcr體系按照如下進行：

配置好的pcr體系按照如下反應條件進行pcr擴增：

94℃，3min

94℃，30sec,45℃，30sec,65℃，30sec；5個循環(huán)

94℃，20sec,55℃，20sec,72℃，30sec；20個循環(huán)

72℃，5min，然后是4℃

擴增后的dna利用dna純化試劑盒進行回收純化并作dna的精確定量，然后對每個樣品dna量取10ng，最終上機測序濃度為20pmol。測序后的dna數據經過生物信息學處理分析，得到如圖1和圖2所示的微生物豐度排序情況圖。圖1是本發(fā)明實施例中制得的微生物制劑中包含的原核微生物種類的組成和相對含量的示意圖；圖2是本發(fā)明實施例中制得的微生物制劑中包含的真核微生物種類的組成和相對含量的示意圖。其中黑色圖框表示訓化前原始樣品中的菌，斜條紋圖框表示本發(fā)明制得的訓化后的微生物制劑中的菌。

從圖中可知：本發(fā)明獲得的高效微生物制劑中，在原核微生物中，類芽孢桿菌的增長最多；而在真核微生物中，紅曲霉菌和粉狀畢赤酵母菌的數量較多。

實施例5：高效微生物制劑在奶牛養(yǎng)殖床技術中的應用

一個200(10m*20m)平米的奶牛養(yǎng)殖床大概可以養(yǎng)殖15頭成年奶牛，首先將約60噸的木屑均勻鋪設在養(yǎng)殖場內，再將約200公斤的微生物菌劑均勻地撒到表面，再利用翻勻機械設備進行2～3次深耕攪拌。木屑的鋪設厚度約為50cm，含水量低于50％。鋪設完成后，奶牛便可以在養(yǎng)殖床上進行排便，每日利用翻耕設備對表層的木屑和糞便進行一定的混勻，這樣便可以完成奶牛松軟舒適的養(yǎng)殖環(huán)境，養(yǎng)殖床中的微生物每年可以補充3～4次，每次約0.5公斤/m²，微生物可以對奶牛糞便中的酸臭物進行降解，并完全利用和分解其中的蛋白質、脂類、糖類成分，減少了自然分解狀態(tài)下氨、胺類、有機酸等有害物質的釋放，改善了養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)工人的作業(yè)環(huán)境，真正實現零排放生態(tài)養(yǎng)殖。

上述僅為本發(fā)明的部分優(yōu)選實施例，本發(fā)明并不僅限于實施例的內容。對于本領域中的技術人員來說，在本發(fā)明技術方案的構思范圍內可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發(fā)明保護范圍之內。