本發(fā)明涉及一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效的用途和試劑盒，屬于醫(yī)藥衛(wèi)生技術領域。
背景技術：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，sle)是一種典型的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)多樣化，常累及多系統(tǒng)多器官，給患者本人帶來了身體和精神上巨大痛苦，也給其家庭和社會帶來了沉重經(jīng)濟負擔。sle患病率存在顯著性別差異，女性患病率大約是男性的9～13倍，育齡期女性患病率更高，兒童及老年人也可發(fā)病。sle發(fā)病率缺乏準確評價，多數(shù)流行病學調(diào)查集中在患病率評價，調(diào)查結果顯示sle的患病率在不同的人群和地域間存在著明顯差異。資料顯示我國sle患病率約為31-70/10萬人，高于西方國家和亞洲其它國家，婦女的患病率約為113/10萬人。到目前為止，sle的發(fā)病病因尚未明確，但大量證據(jù)顯示遺傳、內(nèi)分泌、感染、免疫異常和環(huán)境因素都與其發(fā)病有關，早年的家系研究及近年的gwas研究證據(jù)支持遺傳因素是sle的重要發(fā)病病因。當前sle患者生存率不斷提高，我國sle患者5年生存率約為95％，10年生存率約為90％，患病人口基數(shù)越來越大，已成為女性繼乳腺癌后的又一重大疾病，嚴重影響了女性的身心健康，是一個亟需解決的公共衛(wèi)生問題。
藥物基因組學(pharmacogenomics)的出現(xiàn)對于實現(xiàn)患者個體化用藥具有重要的意義。它是功能基因組學研究的一個分支，通過研究基因組或基因遺傳變異(如單核苷酸多態(tài)性，singleneucleotidepolymorphism，snp)對藥物在人體內(nèi)吸收、代謝、療效及不良反應產(chǎn)生影響的現(xiàn)象及其機制，從而指導合理用藥的一門學科。它最終目的是實現(xiàn)依據(jù)患者的遺傳特征選擇治療方案，最大限度的降低治療風險，減少治療費用，達到有效又安全的治療疾病。近年《science》、《nengljmed》、《jclinoncol》等權威雜志發(fā)表的研究證據(jù)顯示藥物基因組學研究成果能夠迅速轉化應用，在發(fā)達國家藥物基因組學研究成果已經(jīng)開始應用于指導臨床個體化用藥，表現(xiàn)出強大的生命力。
糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，gc)是治療sle的基礎藥物，如何有效、安全和規(guī)范的使用gc是目前sle治療中急需解決的問題。gc在sle的應用可追溯到半個世紀之前，因其強大的抗炎和免疫抑制作用而被廣泛應用于sle的治療。sle患者必須長期應用gc，但臨床實踐顯示gc治療sle是一把“雙刃劍”，gc在緩解病情的同時會帶來嚴重的不良反應。同時sle患者對gc治療反應敏感性存在較大個體差異，有的患者很快獲得療效，有的患者需要較長時間才能緩解病情，有的患者始終不能獲得較好療效，有的患者會出現(xiàn)嚴重不良反應。因此sle治療必須遵循個體化用藥原則。目前，臨床上能夠真正指導sle患者個體化治療的方法還未出現(xiàn)，sle患者的治療方案往往憑借醫(yī)生的個人經(jīng)驗來選擇。借助藥物基因組學研究技術，基于遺傳因素預測gc治療sle的療效和不良反應，給每個患者提供最佳的治療方案，是實現(xiàn)sle真正個體化治療的一個新的突破口。
gc主要作用機制是通過基因調(diào)控途徑完成，它與細胞漿內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptor，gr)相結合起作用。gc被動彌散進入細胞內(nèi)，與gr結合形成gc-gr復合物，迅速進入細胞核后，通過直接和間接基因調(diào)控機制發(fā)揮作用。熱休克蛋白90(heatshockprotein90，hsp90)是熱休克蛋白家族中的重要成員，是gc-gr效應通路中的重要伴侶蛋白。它具有高度保守性，存在于從細菌到高等真核生物中，生物學功能廣泛，對維持生命具有重要意義。hsp90的結構和功能的任何變化都會影響gc發(fā)揮其生物學效應。腫瘤壞死因子受體相關蛋白1(tumornecrosisfactorreceptor-associatedprotein1，trap1)是hsp90家族的主要成員之一，能夠抵御氧化應激所誘導的凋亡，維持線粒體完整性及細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。證據(jù)表明trap1表達異常在sle的發(fā)生發(fā)展及治療療效反應中具有重要作用。
目前，中國人群中多個trap1基因多態(tài)性位點已被發(fā)現(xiàn)，這些遺傳變異可能是導致gc治療sle療效和不良反應存在個體化差異的重要原因之一，當前本領域缺乏通過trap1基因多態(tài)性位點基因型來預測gc治療sle療效的方法和試劑盒。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效的用途和試劑盒，為實現(xiàn)sle患者的個體化治療提供新的思路和方法。
本發(fā)明技術方案是通過以下實現(xiàn)的：
一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡療效的用途，所述的trap1基因多態(tài)性位點為rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552。
優(yōu)選地，所述的糖皮質(zhì)激素包括潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、強的松、強的松龍、氫化可的松、可的松、曲安西龍、地塞米松、倍他米松、甲強龍、甲基潑尼松中的至少一種。
一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡療效的試劑盒，包含有下述試劑成分：
(1)檢測trap1基因多態(tài)性位點基因型的引物；
(2)pcr擴增酶及相應緩沖液；
(3)pcr產(chǎn)物純化酶；
(4)dntp；
(5)單堿基延伸反應酶及相應緩沖液；
(6)單堿基延伸產(chǎn)物純化酶。
優(yōu)選地，所述的檢測trap1基因多態(tài)性位點基因型的引物包括擴增多態(tài)性位點的引物和單堿基延伸多態(tài)性位點的引物，
所述的擴增rs4786428多態(tài)性位點的引物：
5’-tgacaaccacaagctgggatga-3’
5’-tctgggaagctcacggatgaag-3’。
優(yōu)選地，所述的擴增rs3751842多態(tài)性位點的引物：
5’-acggggcaggtcaccacttatt-3’
5’-gtgcttcctaagcccccagagc-3’。
優(yōu)選地，所述的擴增rs3794701多態(tài)性位點的引物：
5’-ccttctccctggctgtggttct-3’
5’-cactggcactcagagcagagca-3’。
優(yōu)選地，所述的擴增rs12597773多態(tài)性位點的引物：
5’-gagggtgtggtgagctgaggtt-3’
5’-tgtagcatgtgcctggcttcag-3’。
優(yōu)選地，所述的擴增rs6500550多態(tài)性位點的引物：
5’-gcgatgaccccccacttagg-3’
5’-ctgacacaccccgtcctttctc-3’。
優(yōu)選地，所述的擴增rs17183750多態(tài)性位點的引物：
5’-atgactgggagccatgcagaaa-3’
5’-tcccgactccagttgtcctctg-3’。
優(yōu)選地，所述的擴增rs6500552多態(tài)性位點的引物：
5’-caagaaacatcaatggctttacgtcct-3’
5’-cagacggcattgccaacagttt-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs4786428多態(tài)性位點的引物：
5’-tttttggcccactggtagtgccc-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs3751842多態(tài)性位點的引物：
5’-ttttttttttttggtagtggactcgggggttgtc-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs3794701多態(tài)性位點的引物：
5’-ttcccgcaggagaggcgtc-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs12597773多態(tài)性位點的引物：
5’-tttttttttctttcagacctcactgacccctga-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs6500550多態(tài)性位點的引物：
5’-ttttttttttttttcctaggctcctctgtgtgctcc-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs17183750多態(tài)性位點的引物：
5’-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaagtaaagaatgattgacatatttgacgtca-3’。
優(yōu)選地，所述的單堿基延伸rs6500552多態(tài)性位點的引物：
5’-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaaaacgagatagcattttcactaccaga-3’。
本發(fā)明還提供了一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效的方法，具體步驟包括：
第一步、dna提?。?/p>
第二步、pcr擴增反應；
第三步、pcr產(chǎn)物純化；
第四步、單堿基延伸反應；
第五步、延伸產(chǎn)物純化；
第六步、對trap1基因多態(tài)性位點進行分型；
第七步、預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效。
所述pcr擴增反應包含rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552擴增多態(tài)性位點的引物。
所述單堿基延伸反應包含rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552單堿基延伸多態(tài)性位點的引物。
所述的trap1基因多態(tài)性位點分型包含rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552多態(tài)性位點基因型。
所述的糖皮質(zhì)激素包括(但不限于)潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、強的松、強的松龍、氫化可的松、可的松、曲安西龍、地塞米松、倍他米松、甲強龍、甲基潑尼松等。
所述的預測為trap1基因rs4786428多態(tài)性位點基因型為cc，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs3751842多態(tài)性位點基因型為ct和/或tt時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs3794701多態(tài)性位點基因型為gg和/或ga時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs12597773多態(tài)性位點基因型為gg時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs6500550多態(tài)性位點基因型為cc和/或ct時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs17183750多態(tài)性位點基因型為gg和/或ga時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs6500552多態(tài)性位點基因型為tc和/或cc時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好。
所述的療效為經(jīng)過糖皮質(zhì)激素治療后sle患者臨床癥狀是否得到緩解，臨床癥狀得到緩解則療效好，沒有得到緩解則療效差。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明試劑盒預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效的方法快速、簡便、有效、準確度高，為指導系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的合理用藥及個體化治療提供了新的思路和方法。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步說明。應該理解為，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。
實施例1：一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效的試劑盒和方法
(一)試劑盒的組成成分
(1)檢測trap1基因多態(tài)性位點基因型的引物；
擴增多態(tài)性位點的引物：
延伸多態(tài)性位點的引物：
(2)pcr擴增酶及相應緩沖液；
(3)pcr產(chǎn)物純化酶；
(4)dntp；
(5)單堿基延伸反應酶及相應緩沖液；
(6)單堿基延伸產(chǎn)物純化酶。
(二)標本收集準備和基因型檢測
1采集血樣
由經(jīng)過培訓的醫(yī)護人員從sle患者前臂采取靜脈血5ml，放置于0.5medta抗凝管中。
2提取dna
dna的提取采用基因組dna抽提試劑盒提取，提取方法如下：
(1)向1.5ml離心管中加入20μlqiagen蛋白酶，再向其中加入200μl血樣，充分混勻。
(2)向離心管中加入200μlbufferal，渦旋振蕩15s，使得其充分混勻，56℃下孵育10min，再快速離心，并確保離心管蓋子中無液滴殘留。
(3)向離心管中加入200μl的96-100％乙醇，渦旋振蕩15s，充分混勻，再快速離心，確保離心管蓋子中無液滴殘留。
(4)將樣品移至qiaampmini離心柱中，6000g(8000rpm)離心1min，再將離心柱移至一個新的2ml收集管中。
(5)向離心柱中加入500μlbufferaw1，6000g(8000rpm)離心1min，將離心柱放入一個新的2ml收集管中。
(6)向離心柱中加入500μlbufferaw2，20000g(14000rpm)離心3min，再將離心柱放入一個新的2ml收集管，20000g(14000rpm)離心1min。
(7)將離心柱轉移到一個1.5ml收集管中，在離心柱中加200μlbufferae，室溫孵育1min，再6000g(8000rpm)離心1min，洗提dna。
3檢測基因型
(1)dna濃度和質(zhì)量評估：先取1μldna樣本，1％agarose電泳對其進行濃度估計和質(zhì)量評估，然后根據(jù)估計的濃度將dna樣本稀釋到5-10ng/μl的工作濃度。
(2)進行pcr擴增反應
a)擴增多態(tài)性位點引物：
擴增rs4786428多態(tài)性位點的引物：
5’-tgacaaccacaagctgggatga-3’
5’-tctgggaagctcacggatgaag-3’
擴增rs3751842多態(tài)性位點的引物：
5’-acggggcaggtcaccacttatt-3’
5’-gtgcttcctaagcccccagagc-3’
擴增rs3794701多態(tài)性位點的引物：
5’-ccttctccctggctgtggttct-3’
5’-cactggcactcagagcagagca-3’
擴增rs12597773多態(tài)性位點的引物：
5’-gagggtgtggtgagctgaggtt-3’
5’-tgtagcatgtgcctggcttcag-3’
擴增rs6500550多態(tài)性位點的引物：
5’-gcgatgaccccccacttagg-3’
5’-ctgacacaccccgtcctttctc-3’
擴增rs17183750多態(tài)性位點的引物：
5’-atgactgggagccatgcagaaa-3’
5’-tcccgactccagttgtcctctg-3’
擴增rs6500552多態(tài)性位點的引物：
5’-caagaaacatcaatggctttacgtcct-3’
5’-cagacggcattgccaacagttt-3’。
b)pcr反應體系：
反應體系(10μl)有1μl樣本dna，1xhotstartaqbuffer，3.0mmmg2+，0.3mmdntp，1uhotstartaqpolymerase(qiageninc.)，和1μl多重pcr引物。
c)pcr循環(huán)程序：
(3)純化pcr產(chǎn)物
在10μl的pcr產(chǎn)物中加入2uexonucleasei酶以及5usap酶，然后37℃溫浴60min，75℃條件下滅活15min。
(4)單堿基延伸反應
a)延伸引物：
單堿基延伸rs4786428多態(tài)性位點的引物：
5’-tttttggcccactggtagtgccc-3’
單堿基延伸rs3751842多態(tài)性位點的引物：
5’-ttttttttttttggtagtggactcgggggttgtc-3’
單堿基延伸rs3794701多態(tài)性位點的引物：
5’-ttcccgcaggagaggcgtc-3’
單堿基延伸rs12597773多態(tài)性位點的引物：
5’-tttttttttctttcagacctcactgacccctga-3’
單堿基延伸rs6500550多態(tài)性位點的引物：
5’-ttttttttttttttcctaggctcctctgtgtgctcc-3’
單堿基延伸rs17183750多態(tài)性位點的引物：
5’-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaagtaaagaatgattgacatatttgacgtca-3’
單堿基延伸rs6500552多態(tài)性位點的引物：
5’-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaaaacgagatagcattttcactaccaga-3’。
b)延伸反應條件：
延伸反應體系10μl，包括5μlsnapshotmultiplexkit(abi)，1μl延伸引物混合物，2μl純化后多重pcr產(chǎn)物和2μl超純水。
c)延伸反應程序：
(5)純化延伸產(chǎn)物
添加1usap酶至10μl延伸產(chǎn)物中，再37℃溫浴1小時，接著75℃條件下滅活15分鐘。
(6)延伸產(chǎn)物上abi3730xl測序儀
將0.5μl純化后的延伸產(chǎn)物、9μlhi-di和0.5μlliz120sizestandard混勻成10μl的反應體系，在95℃下變性5min后，使用abi3730xl測序儀收集數(shù)據(jù)。
(7)基因分型
用genemapper4.1(appliedbiosystemsco.,ltd.,usa)分析abi3730xl測序儀上收集數(shù)據(jù)，從而確定trap1基因rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552多態(tài)性位點基因型。
(三)預測療效
1判定療效標準
收集處于活動期sle患者414例，采用糖皮質(zhì)激素治療三個月，糖皮質(zhì)激素治療sle療效采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)(sledai)評分來判定。sle患者治療三個月后sledai評分在0～4分間或者治療前后患者sledai評分下降≥5分判定為病情緩解，療效好；sle患者治療三個月后sledai評分仍大于4分而且治療前后患者sledai評分下降值<5分判定為病情沒有緩解，療效差。
2預測糖皮質(zhì)激素療效
從報道的中國人群trap1基因上的多個snp中的28個標簽多態(tài)性位點進行篩選，最終發(fā)現(xiàn)rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552多態(tài)性位點能夠預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效。414例sle患者三個月糖皮質(zhì)激素治療結束后，174例患者療效差，240例患者療效好。7個多態(tài)性位點基因型分布均符合hardy-weinburg平衡(見表1)。采用顯性模型和隱性模型分析發(fā)現(xiàn)rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552七個多態(tài)性位點和糖皮質(zhì)激素治療sle的療效之間存在關聯(lián)(因變量：0＝療效好；1＝療效差)。trap1基因rs4786428多態(tài)性位點基因型為cc，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs3751842多態(tài)性位點基因型為ct和/或tt時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs3794701多態(tài)性位點基因型為gg和/或ga時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs12597773多態(tài)性位點基因型為gg時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs6500550多態(tài)性位點基因型為cc和/或ct時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs17183750多態(tài)性位點基因型為gg和/或ga時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs6500552多態(tài)性位點基因型為tc和/或cc時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好(見表2)。
表1trap1基因多態(tài)性位點基因型頻率分布及hardy-weinburg平衡結果
表2trap1基因多態(tài)性位點與糖皮質(zhì)激素治療sle療效的關聯(lián)
(四)得出結論
基于上述數(shù)據(jù)得出：trap1基因rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552多態(tài)性位點能夠預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效。rs4786428多態(tài)性位點基因型為cc，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs3751842多態(tài)性位點基因型為ct和/或tt時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs3794701多態(tài)性位點基因型為gg和/或ga時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs12597773多態(tài)性位點基因型為gg時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs6500550多態(tài)性位點基因型為cc和/或ct時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs17183750多態(tài)性位點基因型為gg和/或ga時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好；rs6500552多態(tài)性位點基因型為tc和/或cc時，預測糖皮質(zhì)激素治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效好。
以上所述實施方式僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發(fā)明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明的權利要求書確定的保護范圍內(nèi)。
<110>安徽醫(yī)科大學
<120>一種基于trap1基因多態(tài)性位點基因型預測糖皮質(zhì)激素治療sle療效的用途和試劑盒
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