本發(fā)明屬于細菌篩檢技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種篩檢細菌的方法及采用特征元素篩檢六種致病菌的方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)意義上來說，細菌的檢測由最初的顯微鏡鏡下形態(tài)分析和動物實驗，過渡到各種生化反應(yīng)的鑒別實驗，鑒別的特異性顯著提高。隨著檢測設(shè)備的發(fā)展，細菌鑒定儀和pcr技術(shù)的使用，使得細菌的鑒定速度顯著提升。

其中細菌鑒定儀是通過不同細菌有不同的生化反應(yīng)，從而導(dǎo)致鑒定卡上顏色的變化，對照現(xiàn)有的譜圖進行鑒別。雖然細菌鑒定儀的優(yōu)點是能更方便的進行藥敏實驗，但其最大的缺點是完全不能受雜菌的干擾，不管是在培養(yǎng)階段還是在鑒定階段，一旦實驗過程中被雜菌所污染，雜菌就會導(dǎo)致生化反應(yīng)異常，可能造成結(jié)果的誤判。

而pcr法進行檢測對場地的要求比較高，雖然用熒光定量pcr可以避免后期的電泳階段，但前期提取核酸階段不但操作繁瑣，而且容易污染實驗室。pcr法檢測需要找到對應(yīng)的引物，但現(xiàn)在被研究出來公認的引物數(shù)量比較少，這也極大的限制了該儀器的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種篩檢細菌的方法及采用特征元素篩檢六種致病菌的方法，通過分析各細菌的無機元素含量，找出其中的特征元素，從而達到快速篩查細菌的目的。

本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的：一種篩檢細菌的方法，其關(guān)鍵在于：通過檢測細菌中的特征元素，從而實現(xiàn)細菌的快速篩查和鑒別。

進一步地，上述的一種篩檢細菌的方法：通過一種或多種所述特征元素對細菌進行鑒別、篩查。

進一步地，上述的一種篩檢細菌的方法的具體步驟為：將已知細菌接種培養(yǎng)后，再將細菌消解、定容，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測細菌中常見無機元素的含量，然后對各種細菌中元素的含量進行對比區(qū)分，含量明顯區(qū)別于其他菌的元素選為特征元素，最后將待測細菌進行接種培養(yǎng)后再將細菌消解、定容，并通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測待測細菌中特征元素的含量進行細菌的篩查和鑒別。

進一步地，上述已知菌株和待測菌株的接種培養(yǎng)具體步驟為：將菌株的雌株接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)24h，12000r/min離心3min，棄去上清液，用超純水反復(fù)洗滌三次后，將菌殘渣放置于-70℃過夜，然后將其置于冷凍離心機中-40℃，抽取36h備用。培養(yǎng)處理中仍需要增菌，洗滌、冷凍干燥后方能夠進行上機檢測，其主要目的是去除菌落中的水分，從而使得不同細菌在相同的狀態(tài)下進行比較。還有震蕩培養(yǎng)不但可以使氧氣充分融入培養(yǎng)基，而且可以有效的避免菌量增多后結(jié)成塊狀沉積于培養(yǎng)基底部。從而滿足實驗對細菌的產(chǎn)量的要求。

進一步地，上述已知菌株和待測菌株消解的具體步驟為：將菌體移入聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml過氧化氫，超純水2.0ml，混勻，浸泡30min，將聚四氟乙烯罐放入微波消解儀中，180℃消解20min。

進一步地，上述常見無機元素包括na、k、mg、al、ca、fe、zn、b、mn、cu、as、se、mo、cd、ba、pb、th、u、be、v、cr、co、ni、ag、sn、sb、hg、tl。

本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的：一種采用特征元素篩檢六種致病菌的方法，其關(guān)鍵在于：將金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌、副溶血弧菌和蠟樣芽孢桿菌接種培養(yǎng)后，再將細菌消解、定容，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測細菌中28種無機元素的含量，即na、k、mg、al、ca、fe、zn、b、mn、cu、as、se、mo、cd、ba、pb、th、u、be、v、cr、co、ni、ag、sn、sb、hg和tl，然后對六種細菌中所述無機元素的含量進行對比區(qū)分，其中含量明顯區(qū)別于其他菌的元素選為特征元素，最后將待測細菌進行接種培養(yǎng)后再將細菌消解、定容，并通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測待測細菌中特征元素的含量進行細菌的篩查和鑒別。

進一步地，上述已知菌株和待測菌株的接種培養(yǎng)具體步驟為：將菌株的雌株接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)24h，12000r/min離心3min，棄去上清液，用超純水反復(fù)洗滌三次后，將菌殘渣放置于-70℃過夜，然后將其置于冷凍離心機中-40℃，抽取36h備用。

進一步地，上述已知菌株和待測菌株消解的具體步驟為：將菌體移入聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml過氧化氫，超純水2.0ml，混勻，浸泡30min，將聚四氟乙烯罐放入微波消解儀中，180℃消解20min。

有益效果：

本發(fā)明方法：基于不同的細菌在生長過程中，為維持細胞的正常生長，維持滲透壓平衡，控制氧化還原反應(yīng)電位，會富集不同量的無機鹽，不同的細菌種類對攝入金屬的種類和數(shù)量均有所不同，因此能有效通過測定細菌的無機元素含量，實現(xiàn)對細菌的初步篩檢。

附圖說明

圖1為樣品的內(nèi)標回收率；

圖2為各細菌的特征元素含量。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：以篩檢金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、蠟樣芽孢桿菌六種細菌為例。

1材料

1.1儀器設(shè)備

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(agilent，7700x)，微波消解儀(speedwave，sw-4)，冷凍干燥機(寧波新芝，scientz-30nd)，超純水機(millipore，milli-qintegral)，離心機(thermofisher，x1r)。

1.2試劑

硝酸(thermofisher，gr)，營養(yǎng)肉湯(青島海博)，過氧化氫(30％，川東化工，gr)。

1.3標準菌株

金黃色葡萄球菌(atcc6538)，鼠傷寒沙門氏菌(atcc14028)，福氏志賀氏菌(cicc10865)，大腸桿菌(atcc25922)，副溶血弧菌(cicc21627)，蠟樣芽孢桿菌(cicc23828)。

1.4標準溶液

(1)混標(na，k，mg，al，ca，fe，zn，mn，cu，as，se，mo，cd，ba，pb，th，u，be，v，cr，co，ni，ag，sb，tl)，10mg/l，編號213035005，購自accustandard,inc；(2)hg，1000mg/l，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；(3)b，1000mg/l，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；(4)sn，500mg/l，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；(5)調(diào)諧液：ce、co、li、mg、y、tl，均1μg/l，agillent；(6)內(nèi)標：bi、ge、in、lu、rh、sc、tb，均100mg/l(臨用時稀釋至1mg/l)，agillent。

2方法

2.1細菌培養(yǎng)

將以上6個菌株的瓷珠接種于30ml營養(yǎng)肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)24h，12000r/min離心3min，棄去上清液，用超純水反復(fù)洗滌三次后，將菌殘渣放置于-70℃過夜，然后將其置于冷凍離心機中-40℃，抽取36h備用。同時進行肉湯空白實驗。

2.2細菌消解

稱取10mg-20mg菌體于聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml過氧化氫，超純水2.0ml，混勻，浸泡30min，將消解罐放入微波消解儀180℃消解20min。消解完畢后用超純水定容至10ml，混勻備用。

2.3儀器檢測參數(shù)如表1所示：

表1電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測參數(shù)

3檢測結(jié)果及分析

3.1檢測結(jié)果

將制備好的樣液進行檢測，每個細菌測定6次，得到28種無機元素(na，k，mg，al，ca，fe，zn，b，mn，cu，as，se，mo，cd，ba，pb，th，u，be，v，cr，co，ni，ag，sn，sb，hg，tl)的平均含量見表2所示。

表2：6種細菌的無機元素平均濃度及相對標準差(n＝6)

注：a，該指標無法計算或計算無意義。

3.2方法指標

3.2.1精密度

如表2所示，28種元素測定的相對標準偏差(rsds，n＝6)在1.1～7.9范圍內(nèi)，均小于8％，說明測定的精密度良好。

3.2.2內(nèi)標回收率

用sc，ge，in，tb，bi元素作為內(nèi)標以校正待測元素測定結(jié)果，儀器自動計算出內(nèi)標元素的回收率，可用于評價樣品基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標回收率結(jié)果見圖1，平均回收率均在80％-120％范圍內(nèi)。

3.3測定結(jié)果分析

3.3.1元素含量分析

根據(jù)元素檢測結(jié)果，按照元素濃度的范圍可以將其分為四個組，分組情況見表3。

表3各濃度范圍的元素種類

由上表可以看出，高濃度組的元素主要是k、na等，這些元素是微生物細胞的主要元素，是己糖磷酸化酶、核酸聚合酶等活性中心組分，葉綠素和細菌葉綠素成分。其次，細菌生長繁殖和許多生理過程中，對mg，al，ca，fe，zn需求較多，可能貯存以備用等。有的重金屬如cr，co，ni，ag，cd，sb，hg具有毒性，對細菌生長不利，故不易被細菌吸收，檢出濃度極低。

3.3.2結(jié)合圖2對各細菌的特征元素進行分析

對于副溶血弧菌，b為其特征元素，其含量遠高于其他細菌。特別是和其有相似癥狀的金黃色葡萄球菌比較，副溶血弧菌含量約為金黃色葡萄球菌的5倍左右。

對于金黃色葡萄球菌，cu為其特征元素，其含量高于其他細菌。含量最接近的為蠟樣芽胞桿菌，僅為其的一半。

對于福氏志賀氏菌，th為其特征元素，其含量高于其他細菌。志賀氏菌和沙門氏菌引起的食物中毒發(fā)病時間均為8h～24h，且癥狀均比較相識，不易區(qū)分。但福氏志賀氏菌中th含量大于0.8mg/kg，沙門氏菌中th的含量低于0.1mg/kg，可以作為區(qū)分。

對于蠟樣芽孢桿菌，na為其特征元素，其含量高于其他細菌。蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌食物中毒的癥狀均為強烈的嘔吐，且開始發(fā)病的時間均比較短，不易區(qū)分。可以利用其中na含量的巨大差異對其進行鑒別。

對于大腸桿菌，k為其特征元素，其含量高于其他細菌。大腸桿菌為條件致病菌，引起食源性疾病需要滿足一定的條件。含量最接近的為蠟樣芽胞桿菌，約為其的一半。

對于鼠傷寒沙門氏菌，b的含量遠低于其他細菌。pb的含量高于其他細菌，但與蠟樣芽孢桿菌中的含量比較接近。在實際鑒定中，最好將這兩種元素結(jié)合起來判斷。

因此副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌的特征元素分別為b、cu、th、na、k、pb。

4待測細菌檢測：

最后將待測細菌進行所述接種培養(yǎng)后再將細菌通過上述的方法消解、定容，并通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測待測細菌中特征元素的含量即可對上述細菌進行初步的篩查和鑒別。b、cu、th、na、k、pb特征元素能夠結(jié)合臨床癥狀，分別用于副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌的鑒別。