本申請是原申請、申請日為2013年12月27日，申請?zhí)枮?01380068766.7，發(fā)明名稱為“細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌”的中國專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌，尤其涉及在液體中分散性優(yōu)異的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌纖維素通常由寬度為約50nm的微細(xì)纖維(納米纖維)構(gòu)成，具有高機(jī)械強(qiáng)度、生物適合性、生物降解性等特性，因此作為能夠用于各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的材料而受到關(guān)注。細(xì)菌纖維素通常通過對醋酸菌等細(xì)菌進(jìn)行靜置培養(yǎng)而在培養(yǎng)基表面以包含凝膠狀物質(zhì)的膜(以下稱為“凝膠狀膜”。)的形式而獲得，但該凝膠狀膜在作為材料應(yīng)用時(shí)缺乏成形性、與其它物質(zhì)的混合性，此外由于生產(chǎn)效率低而使成本變高，因此存在作為實(shí)用材料的應(yīng)用性匱乏這樣的問題。對于這樣的問題，期待一種非凝膠狀膜、作為材料的應(yīng)用性優(yōu)異的、分散在液體中的細(xì)菌纖維素。例如，非專利文獻(xiàn)1中公開了一種通過對木醋桿菌sucrofermentans亞種(acetbacterxylinumsubsp.sucrofermentans)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素，此外，非專利文獻(xiàn)2中公開了一種在添加了羧甲基纖維素(cmc)的培養(yǎng)基中對木葡糖酸醋桿菌(gluconacetobacterxylinum)jcm10150株進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：吉永等、化學(xué)和生物、vol.35、no.11、第7～14頁、1997年非專利文獻(xiàn)2：s.warashina等、纖維素學(xué)會第17次大會2010celluloser&d講演要旨集、第98頁、2010年技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的課題但是，從并非使用添加了具有細(xì)菌纖維素的分散性提高效果的cmc的培養(yǎng)基而生產(chǎn)、以及在水中分散為“小的粒狀或纖維狀”(同一文獻(xiàn)；第9頁右欄)的記載可知，非專利文獻(xiàn)1所述的細(xì)菌纖維素在水中的分散性并不高。因此，在用于實(shí)用化的成形性、與其它物質(zhì)的混合性方面并不充分。此外，非專利文獻(xiàn)2所述的細(xì)菌纖維素在向cmc培養(yǎng)基的添加量為0.5％、1％、2％時(shí)，任一情況下，含有該細(xì)菌纖維素的水均是下部的白濁性高于上部、觀察到沉淀，并且纖維素粒子為能夠目視辨認(rèn)的程度的大小(同一文獻(xiàn)；fig.1)，因此在水中的分散性不高。因此，在實(shí)用化中所必須的成形性、與其它物質(zhì)的混合性方面并不充分。因此，非專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)2任一文獻(xiàn)中所述的細(xì)菌纖維素作為材料的成形性、與其它材料的混合性均不充分，在材料的生產(chǎn)效率方面也缺乏實(shí)用性。本發(fā)明是為了解決這樣的問題而做出的發(fā)明，其目的在于提供一種在液體中的分散性高、實(shí)用化中的成形性和與其它材料的混合性均良好、作為實(shí)用材料的應(yīng)用性優(yōu)異的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌。用于解決課題的手段本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如下獲得的細(xì)菌纖維素在水中具有高分散性，由此完成了下述各發(fā)明：所述細(xì)菌纖維素通過將作為新的菌株的siid9587株(保藏號nitebp-01495)(以下，有時(shí)稱為“nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)”。)在含cmc的培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)而獲得，所述siid9587株以由植物油制造生物柴油燃料時(shí)產(chǎn)生的含甘油的副產(chǎn)物(biodieselfuelby-product；bdf-b、廢甘油)、試劑甘油或糖蜜為碳源的中間葡糖醋桿菌。(1)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素具有如下物性：含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率為35％以上。(2)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素進(jìn)而具有如下物性：在下述i)～vi)的條件下進(jìn)行的凝膠滲透色譜的色譜圖的峰頂(ピ一クトツプ)的保留體積為2.5ml以上且小于3.0ml。i)柱：填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內(nèi)徑為6.0mm及長度為15cm的柱、ii)保護(hù)柱：內(nèi)徑為4.6mm、長度為3.5cm、iii)柱溫度：35℃、iv)送液速度：0.07ml/分鐘、v)洗脫液：40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液、vi)洗脫液中的細(xì)菌纖維素的終濃度：0.2％(w/w)。(3)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素，優(yōu)選將bdf-b同化而生產(chǎn)。(4)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素，優(yōu)選將選自砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物及它們的水解物、以及異構(gòu)化糖中的1或2種以上同化而生產(chǎn)。(5)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素是將制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物同化而生產(chǎn)的情況下，前述副產(chǎn)物優(yōu)選為糖蜜。(6)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素也可以利用中間葡糖醋桿菌(gluconacetobacterintermedius)而生產(chǎn)。(7)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素也可以利用中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)而生產(chǎn)。(8)本發(fā)明的細(xì)菌的特征在于，生產(chǎn)前述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌纖維素。(9)本發(fā)明的細(xì)菌也可以是生產(chǎn)前述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌纖維素的中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素，可以獲得幾乎均一分散在水等液體中的細(xì)菌纖維素，該細(xì)菌纖維素由于成形性、與其它物質(zhì)的混合性優(yōu)異，因此可以有助于最終制品的品質(zhì)、生產(chǎn)效率的提高或生產(chǎn)成本的降低。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以獲得無需利用混合器進(jìn)行微細(xì)化等工序而通過溫和條件下的精制即可幾乎均一地分散在液體中的細(xì)菌纖維素，可以獲得具有較大的平均分子量的細(xì)菌纖維素。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明，通過利用bdf-b、糖蜜等制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物作為碳源，有助于資源的有效利用且可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素的低價(jià)格化。此外，根據(jù)本發(fā)明還使用中間葡糖醋桿菌或中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)進(jìn)行生產(chǎn)，由此可以高效率地獲得大量的細(xì)菌纖維素。附圖說明圖1是表示分離將bdf-b同化而生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌的步驟的圖。圖中，細(xì)菌纖維素簡記為bc。圖2-1是示出siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株的16srdna堿基序列的一致點(diǎn)及不同點(diǎn)的圖。圖中，堿基序列的一致點(diǎn)用*標(biāo)記來表示，不同點(diǎn)用方框圍住來表示。此外，圖中，g.intermedius表示中間葡糖醋桿菌tf2株。圖2-2為示出siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株的16srdna堿基序列的一致點(diǎn)及不同點(diǎn)的圖。圖中，堿基序列的一致點(diǎn)用*標(biāo)記來表示，不同點(diǎn)用方框圍住來表示。此外，圖中，g.intermedius表示中間葡糖醋桿菌tf2株。圖3是示出siid9587株的細(xì)菌學(xué)性狀的圖。圖4是示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(上段圖)、以及將bdf-b及試劑甘油作為碳源進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的生產(chǎn)物(中段圖及下段圖)的ir譜圖的圖。圖5是示出分別包含對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)及進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(左圖及中央圖)、以及來自紙漿的細(xì)菌纖維素納米纖維(右圖)的水的外觀的圖。圖6是示出含有分別將糖蜜及試劑甘油作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率以及細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)量(bc生產(chǎn)量)及生產(chǎn)速度(bc生產(chǎn)速度)的圖。圖7是示出含有對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的漢森葡糖醋桿菌(g.hansenii)atcc23769株、木葡糖醋桿菌(g.xylinus)atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率、以及bc生產(chǎn)量、bc生產(chǎn)速度及bc生產(chǎn)速度的比率的圖。圖8是示出將bdf-b作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的而獲得的細(xì)菌纖維素(樣品b)、來自紙漿的纖維素納米纖維(來自紙漿的cnf液)及普魯蘭多糖的凝膠滲透色譜的色譜圖的圖。圖9是示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)(攪拌培養(yǎng)bc液)及靜置培養(yǎng)(混合器處理靜置培養(yǎng)bc液)而獲得的細(xì)菌纖維素的纖維寬度及利用透射型電子顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖10為示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(攪拌培養(yǎng)bc液)及來自紙漿的纖維素納米纖維(來自紙漿的cnf液)的利用透射型電子顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖11為示出對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(攪拌培養(yǎng)bc液)及來自紙漿的纖維素納米纖維(來自紙漿的cnf液)的利用偏光顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖12為示出將試劑甘油或bdf-b作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的重量的圖。圖13為示出將試劑甘油或bdf-b作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的atcc53582株及atcc23769株進(jìn)行振蕩培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的重量的圖。具體實(shí)施方式以下，對本發(fā)明的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明中的細(xì)菌纖維素是指利用細(xì)菌生產(chǎn)的纖維素。本發(fā)明中，細(xì)菌纖維素“分散”在水等液體中是指，細(xì)菌纖維素漂浮或懸浮在液體中。此外，分散性高是指，作為分散介質(zhì)的細(xì)菌纖維素在液體中的粒徑、纖維寬度較小、作為分散介質(zhì)的細(xì)菌纖維素較均一地漂浮或懸浮在液體中等。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素具有幾乎均一地分散在液體中的程度的高分散性。這里，使細(xì)菌纖維素分散的液體可以使用有機(jī)溶劑及水系溶劑中的任一種，優(yōu)選水系溶劑。細(xì)菌纖維素的分散性的高低例如可以測定光透過率作為指標(biāo)，存在光透過率越大則分散性越高、光透過率越小則分散性越低這樣的關(guān)系。光透過率可以通過將含有規(guī)定濃度的細(xì)菌纖維素的水供于分光光度計(jì)并照射規(guī)定波長的光、對透過的光的量進(jìn)行測定而求出。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素具有如下性質(zhì)：含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率為35％以上。這里，作為本發(fā)明中的含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率，除了為35％以上，還可以列舉例如36％以上、37％以上、38％以上、39％以上、40％以上、35％以上且99％以下，36％以上且99％以下，37％以上且99％以下，38％以上且99％以下，40％以上且99％以下，35％以上且95％以下，36％以上且95％以下，37％以上且95％以下，38％以上且95％以下，40％以上且95％以下，35％以上且90％以下，36％以上且90％以下，37％以上且90％以下，38％以上且90％以下，40％以上且90％以下，35％以上且85％以下，36％以上且85％以下，37％以上且85％以下，38％以上且85％以下，40％以上且85％以下，35％以上且80％以下，36％以上且80％以下，37％以上且80％以下，38％以上且80％以下，40％以上且80％以下等。此外，本發(fā)明的細(xì)菌纖維素可以具有與來自紙漿的纖維素納米纖維等來自植物的纖維素相比大的平均分子量。纖維素的平均分子量可以例如測定凝膠滲透色譜的色譜圖作為指標(biāo)，存在所述色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積越大則平均分子量越小、保留體積越小則平均分子量越大這樣的關(guān)系。即，本發(fā)明的細(xì)菌纖維素還可以具有如下物性：在下述i)～vi)的條件下進(jìn)行的凝膠滲透色譜的色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積為2.5ml以上且小于3.0ml。i)柱為填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內(nèi)徑為6.0mm及長度為15cm的柱、ii)保護(hù)柱的內(nèi)徑為4.6mm、長度為3.5cm、iii)柱溫度為35℃、iv)送液速度為0.07ml/分鐘、v)洗脫液為40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液、vi)洗脫液中的細(xì)菌纖維素的終濃度為0.2％(w/w)。此外，本發(fā)明的細(xì)菌纖維素例如可以通過在含有適當(dāng)碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌使其生產(chǎn)細(xì)菌纖維素而制造。這里，作為碳源，可以列舉例如葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖，低聚糖、砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物、它們的水解物、異構(gòu)化糖、淀粉水解物等糖類以及甘露糖醇、乙醇、乙酸、檸檬酸、甘油、bdf-b等，可以根據(jù)細(xì)菌的種類、培養(yǎng)條件、制造成本等適當(dāng)設(shè)定。予以說明的是，bdf-b的常規(guī)組成是甘油41.5％、脂肪酸21.4％、甲醇12.4％、強(qiáng)熱殘留成分6.3％、其它18.4％(財(cái)團(tuán)法人日本食品分析中心)，是大量地含有能夠用作細(xì)菌的碳源的甘油的組合物。這里，砂糖是指以蔗糖為主成分的甘味料(廣辭苑第6版)，在本發(fā)明中既可以是化學(xué)合成品，也可以是以甘蔗、甜菜(糖蘿卜)、糖槭、桄榔(sugarpalm)、高粱(sweetsorghum)等天然物質(zhì)為原料而制造的砂糖。作為本發(fā)明中的砂糖，可以列舉例如紅糖、白糖、粗糖(cassonade)(紅糖)、和三盆、楓糖等未分蜜糖以及粗糖、精制糖等分蜜糖。作為精制糖，可以列舉例如白雙糖(shirozarasugar)、粗晶軟糖(coarsecrystalmediumsoftsugar)、細(xì)白砂糖(castersugar)等砂糖，上白糖、幼砂糖等綿白糖(softsugar)，方糖、冰糖、粉砂糖、顆粒糖等加工糖以及液體糖等。此外，制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物是指，在砂糖的制造工序中產(chǎn)生的副產(chǎn)物中的含有蔗糖的副產(chǎn)物，具體而言，可以列舉例如上述的甘蔗、甜菜等天然原料的榨渣、糖蜜、利用過濾和/或離子交換樹脂進(jìn)行的精制工序中產(chǎn)生的殘?jiān)?。此外，二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物的水解物是指，在酸性溶液中對二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物進(jìn)行加熱等水解處理而獲得的物質(zhì)。碳源以外的培養(yǎng)基成分可以使用與細(xì)菌培養(yǎng)中使用的公知的培養(yǎng)基同樣的成分，優(yōu)選含有cmc。具體而言，可以列舉例如含有cmc、氮源、無機(jī)鹽類、以及根據(jù)需要而含有的氨基酸、維生素等有機(jī)微量營養(yǎng)素的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基，作為氮源，可以列舉硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽，硝酸鹽、尿素、蛋白胨等有機(jī)或無機(jī)的氮源。此外，作為無機(jī)鹽類，可以列舉磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等，作為有機(jī)微量營養(yǎng)素，可以列舉氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸、以及包含這些營養(yǎng)素的蛋白胨、水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，在使用生育中需要氨基酸的營養(yǎng)要求性變異株時(shí)，還可以進(jìn)一步補(bǔ)充所要求的營養(yǎng)素。此外，作為細(xì)菌，只要是能生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌則沒有特別限定，優(yōu)選可以通過攪拌培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌，更優(yōu)選同化bdf-b的細(xì)菌。具體而言，可以列舉例如醋桿菌屬細(xì)菌、葡糖醋桿菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌、土壤桿菌屬細(xì)菌、根瘤菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌等，更具體而言，可以列舉中間葡糖醋桿菌、漢森葡糖醋桿菌、斯氏葡糖醋桿菌(gluconacetobacterswingsii)、巴氏醋桿菌(acetobacterpasteurianus)、醋化醋桿菌(acetobacteraceti)、木醋桿菌(acetobacterxylinum)、木醋桿菌sucrofermentans亞種(acetbacterxylinumsubsp.sucrofermentans)、木醋桿菌nonacetoxidans亞種(acetbacterxylinumsubsp.nonacetoxidans)、惡臭醋桿菌(acetobacterransens)、胃八疊球菌(sarcinaventriculi)、bacteriumxyloides、腸桿菌等，這些之中，優(yōu)選中間葡糖醋桿菌。進(jìn)而，更具體而言，可以列舉中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)、木葡糖醋桿菌atcc53582株、漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、斯氏葡糖醋桿菌bpr3001e株、木醋桿菌jcm10150株、腸桿菌cjf-002株等，這些之中，優(yōu)選中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號nitebp-01495)。作為培養(yǎng)方法，可以列舉例如攪拌培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)等。作為攪拌培養(yǎng)，具體而言，可以列舉使用了發(fā)酵罐的不進(jìn)行通氣的培養(yǎng)(無通氣攪拌培養(yǎng))、使用了發(fā)酵罐的進(jìn)行通氣的培養(yǎng)(通氣攪拌培養(yǎng))、使用了帶槳葉的燒瓶的左右搖動的培養(yǎng)(振蕩培養(yǎng))、使用了帶槳葉的燒瓶的旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)(旋轉(zhuǎn)培養(yǎng))等。此外，培養(yǎng)條件可以設(shè)定為上述細(xì)菌的培養(yǎng)中所使用的公知的培養(yǎng)條件，可以列舉例如通氣量為1～10l/分鐘、轉(zhuǎn)速為100～800rpm、溫度為20～40℃、培養(yǎng)期為1天～7天的培養(yǎng)條件。此外，在本發(fā)明的細(xì)菌纖維素的制造中，可以根據(jù)需要進(jìn)行碳源的前處理工序、前前培養(yǎng)工序、前培養(yǎng)工序、細(xì)菌纖維素的精制、干燥、懸浮工序等。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素例如可以作為紙力增強(qiáng)劑、食品的增稠劑、懸浮穩(wěn)定化劑等添加劑而使用。其次，本發(fā)明的細(xì)菌是生產(chǎn)前述細(xì)菌纖維素的細(xì)菌。對于在生產(chǎn)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素的細(xì)菌中，與上述的本發(fā)明的細(xì)菌纖維素相同或相當(dāng)?shù)臉?gòu)成將省略重復(fù)說明。以下，對本發(fā)明的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌的各實(shí)施例進(jìn)行說明。予以說明的是，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例所示特征的限定。實(shí)施例<實(shí)施例1>細(xì)菌的分離及鑒定(1)細(xì)菌的分離對同化了bdf-b而生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌進(jìn)行了分離。具體而言，按照圖1所示的步驟，首先，以蘋果及西梅為分離源，使用在hestrin-schramm標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(組成：細(xì)菌蛋白胨0.5％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、na2hpo40.27％(w/v)、檸檬酸0.115％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)；hs培養(yǎng)基)中含有2％(w/v)的試劑甘油(試劑特級、和光純藥株式會社)來代替葡萄糖的培養(yǎng)基(hs/甘油培養(yǎng)基)進(jìn)行富集培養(yǎng)。將其接種在含有纖維素染色試劑的hs/甘油培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行平板培養(yǎng)，選擇出15種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株。然后，將這些菌株接種到含有2％(w/v)的試劑甘油(試劑特級、和光純藥株式會社)的lb培養(yǎng)基(組成；胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、氯化鈉0.5％(w/v))中，在30℃下靜置培養(yǎng)，使其生成凝膠狀膜。測定凝膠狀膜的干燥重量(以下稱為“干燥膜重量”。)，選擇出8種干燥膜重量大的菌株，作為同化甘油且細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力高的菌。然后，接種到含有bdf-b的lb培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行平板培養(yǎng)，進(jìn)而，接種到hs培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行靜置培養(yǎng)，從而使其生成凝膠狀膜。選擇其中干燥膜重量大的菌株，用含有甘油的lb培養(yǎng)基或hs/甘油培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)后，用hs培養(yǎng)基反復(fù)進(jìn)行靜置培養(yǎng)操作，選定一種具有bdf-b同化性、且細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力高的菌株，將其作為siid9587株。(2)細(xì)菌的鑒定按照常規(guī)方法對本實(shí)施例1(1)的siid9587株進(jìn)行測序，確定了全長16srdna的堿基序列(1367bp、序列號1)。然后，在technosurugalaboratoryco.，ltd中進(jìn)行了16srdna堿基序列解析及細(xì)菌學(xué)性狀試驗(yàn)。[2-1]16srdna堿基序列解析16srdna堿基序列解析試驗(yàn)使用apollo2.0(technosurugalaboratory社)作為軟件、使用apollodb-ba6.0(technosurugalaboratory社)及國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(genbank/ddbj/embl)作為數(shù)據(jù)庫而進(jìn)行。相對于apollodb-ba6.0的同源性檢索的結(jié)果，siid9587株的16srdna堿基序列(序列號1)相對于葡糖醋桿菌屬的16srdna堿基序列顯示高同源性，相對于中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號y14694)的16srdna堿基序列顯示最高同源性，同源率為99.8％。此外，在相對于genbank/ddbj/embl的同源性檢索的結(jié)果中，siid9587株的16srdna堿基序列(序列號1)也相對于葡糖醋桿菌屬的16srdna堿基序列顯示出高同源性，相對于基準(zhǔn)株的中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號nr_026435)的16srdna堿基序列顯示高同源性，同源率為99.8％。予以說明的是，登錄號y14694的序列和登錄號nr_026435的序列相同。siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號y14694、nr_026435)的16srdna堿基序列較結(jié)果如圖2-1及圖2-2所示。如圖2-1及圖2-2所示，兩者間有4個堿基不同。此外，在相對于apollodb-ba6.0的同源性檢索中，在基于同源性高的排在前面的15株的16srdna堿基序列的簡易分子系統(tǒng)解析的結(jié)果中，siid9587株包含在由葡糖醋桿菌屬中的種形成的簇內(nèi)。[2-2]細(xì)菌學(xué)性狀試驗(yàn)細(xì)菌學(xué)性狀試驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，siid9587株在含5％乙酸的培養(yǎng)基中不生育，這一點(diǎn)與已知的中間葡糖醋桿菌的性狀不同，其它性狀一致(brenner等、bergey’smanualofsystematicbacteriology.vol.two.theproteobacteria，partcthealpha-，beta-，delta-，andepsilonproteobacteria.2005.springer.p72-77)。從以上的本實(shí)施例1(2)[2-1]及[2-2]的結(jié)果可知，siid9587株屬于中間葡糖醋桿菌。另一方面，如上所述，siid9587株和作為中間葡糖醋桿菌的基準(zhǔn)株的中間葡糖醋桿菌tf2株之間，16srdna堿基序列及細(xì)菌學(xué)性狀方面存在不同點(diǎn)，因此可知，siid9587株是中間葡糖醋桿菌的新菌株。因此，將該菌株于平成24年(2012年)12月21日保藏在獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(nite-ipod；日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號室)，保藏號為nitebp-01495。以下，將該中間葡糖醋桿菌siid9587株(保藏號nitebp-01495)稱為nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)。(3)生產(chǎn)物的確認(rèn)進(jìn)行nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)的前培養(yǎng)，使菌體增殖。然后，將進(jìn)行前培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)液(前培養(yǎng)液)加入到hs培養(yǎng)基(碳源：葡萄糖)中，在30℃下進(jìn)行約8天靜置培養(yǎng)，由此進(jìn)行主培養(yǎng)，使其在培養(yǎng)基表面生成凝膠狀膜。對凝膠狀膜，按照常規(guī)方法得到紅外分光法(ir)的譜圖及x射線衍射圖并進(jìn)行解析。由其結(jié)果可知，凝膠狀膜為具有i型晶體結(jié)構(gòu)的纖維素。此外，按照常規(guī)方法得到掃描型電子顯微鏡圖像并進(jìn)行了解析，結(jié)果表明，凝膠狀膜中，納米級的寬度的纖維素纖維(纖維素納米纖維)形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由這些結(jié)果可確認(rèn)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)生產(chǎn)纖維素。<實(shí)施例2>通氣攪拌培養(yǎng)所產(chǎn)生的生產(chǎn)物的評價(jià)(1)通氣攪拌培養(yǎng)所產(chǎn)生的生產(chǎn)物的調(diào)制對bdf-b進(jìn)行中和處理，進(jìn)而進(jìn)行高壓釜處理，由此獲得經(jīng)過了前處理的bdf-b。調(diào)制了在含2％(w/v)的cmc(化學(xué)用、和光純藥株式會社)的hs培養(yǎng)基中添加試劑甘油(試劑特級、和光純藥株式會社)代替葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基、及在其中添加濃度為2％(w/v)的經(jīng)過了前處理的bdf-b代替葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基，分別作為甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基。然后，首先進(jìn)行nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)的前培養(yǎng)，使菌體增殖。然后，將前培養(yǎng)液分別接種到5l的甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用發(fā)酵罐在通氣量為7～10l/分鐘、轉(zhuǎn)速為200～800rpm、溫度為30℃的條件下進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)4天，由此進(jìn)行主培養(yǎng)。在進(jìn)行主培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)液(主培養(yǎng)液)中加入1％(w/v)naoh水溶液，在60℃、80rpm下振蕩4～5小時(shí)，由此溶解菌體。將其供于離心分離后，除去上清，回收沉淀物，由此除去水溶性的菌體成分。在其中加入超純水進(jìn)行離心分離后除去上清，將該操作反復(fù)進(jìn)行至濕潤狀態(tài)下沉淀物的ph達(dá)到7以下，由此對生產(chǎn)物進(jìn)行精制，將其作為攪拌培養(yǎng)bc液。(2)利用靜置培養(yǎng)調(diào)制細(xì)菌纖維素通過實(shí)施例1(3)所述的方法獲得凝膠狀膜，裁切為約1cm×1cm的大小。然后，加入1％(w/v)naoh水溶液，在60℃、80strokes/分鐘下振蕩4～5小時(shí)后，在20℃下振蕩一晚。使用金屬網(wǎng)進(jìn)行過濾，由此除去液體而回收凝膠狀膜。在其中加入超純水并在20℃下振蕩一晚，將該操作反復(fù)進(jìn)行至ph達(dá)到7以下，由此進(jìn)行精制后，使用混合器進(jìn)行數(shù)分鐘的懸浮處理，將其作為混合器處理靜置培養(yǎng)bc液。(3)解析將本實(shí)施例2(1)的攪拌培養(yǎng)bc液及本實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液分別滴加到硅板上并干燥后，將其供于紅外分光光度計(jì)(ft/ir-4200、日本分光株式會社)，在累計(jì)次數(shù)32次、分辨率2cm-1或4cm-1下進(jìn)行測定，獲得ir譜圖。其結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，使用bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基及甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基而獲得的攪拌培養(yǎng)bc液的ir譜圖與混合器處理靜置培養(yǎng)bc液的ir譜圖為同樣形狀。由該結(jié)果可確認(rèn)，以bdf-b、試劑甘油為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的生產(chǎn)物為纖維素。<實(shí)施例3>細(xì)菌纖維素在水中的分散性(1)含細(xì)菌纖維素的水的外觀準(zhǔn)備使用了實(shí)施例2(1)的bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液及實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液。此外，將市售的來自紙漿的纖維素納米纖維添加到水中并使其分散，將其作為來自紙漿的cnf液。將攪拌培養(yǎng)bc液、混合器處理靜置培養(yǎng)bc液及來自紙漿的cnf液靜置1天后觀察外觀。其結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，來自紙漿的cnf液觀察到了纖維素的沉淀。此外，混合器處理靜置培養(yǎng)bc液觀察到了塊狀的細(xì)菌纖維素，細(xì)菌纖維素的分散狀態(tài)不均一。與此相對地，攪拌培養(yǎng)bc液未觀察到沉淀、塊狀的細(xì)菌纖維素，觀察到細(xì)菌纖維素均一地分散的樣子。由這些結(jié)果可知，對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素與來自紙漿的纖維素納米纖維、對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素相比分散性高，在水等液體中均一地分散。(2)含細(xì)菌纖維素的水的光透過率[2-1]靜置培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素及來自紙漿的纖維素的比較在實(shí)施例2(1)所述的方法中，在主培養(yǎng)中，使用帶槳葉的燒瓶代替發(fā)酵罐，在150rpm、溫度為30℃的條件下進(jìn)行3天旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，調(diào)制攪拌培養(yǎng)bc液，將其作為樣品a(使用了甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基)及樣品b(使用了bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基)。此外，將使用了實(shí)施例2(1)的bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液作為樣品c、將使用了甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液作為樣品d。此外，分別準(zhǔn)備了實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液及實(shí)施例3(1)的來自紙漿的cnf液。將它們的纖維素終濃度調(diào)制為0.1±0.006％(w/w)后，在比色皿中分別加入1ml，供于分光光度計(jì)(u-2001型雙光束分光光度計(jì)、株式會社日立制作所)，測定波長500nm的光透過率。比色皿使用聚苯乙烯制一次性比色皿(半微量、光路長10mm、光路寬度4mm)，參比使用超純水。其結(jié)果如表1所示。[表1]如表1所示，樣品a、b、c及d的透過率分別為74.75％、70.53％、63.82％及49.66％，與混合器處理靜置培養(yǎng)bc液的19.19％及來自紙漿的cnf液的12.72％相比顯著大，在大約40％以上且80％以下的范圍。[2-2]培養(yǎng)基中有無cmc的比較在實(shí)施例2(1)所述的方法中，分別使用含2％(w/v)cmc的hs培養(yǎng)基和不含cmc的hs培養(yǎng)基獲得攪拌培養(yǎng)bc液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖來作為碳源。此外，使用糖蜜作為碳源時(shí)，在主培養(yǎng)第3天，培養(yǎng)基中的碳源幾乎變沒，因此將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為3天，來代替4天。然后，根據(jù)本實(shí)施例3(2)[2-1]所述的方法測定了含細(xì)菌纖維素的水的光透過率。其結(jié)果如下述表2所示。[表2]培養(yǎng)基中的cmc培養(yǎng)方法碳源透過率(％)含攪拌培養(yǎng)糖蜜57不含攪拌培養(yǎng)糖蜜18如表2所示，使用含cmc的hs培養(yǎng)基時(shí)的透過率為57％，與此相對，使用不含cmc的hs培養(yǎng)基時(shí)的透過率為18％。由以上的本實(shí)施例3(2)[2-1]及[2-2]的結(jié)果可知，含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的、用含cmc的培養(yǎng)基對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率為40％以上且80％以下。由此可知，通過用含cmc的培養(yǎng)基對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，從而獲得了在液體中的分散性顯著高、在液體中均一地分散的細(xì)菌纖維素。<實(shí)施例4>碳源不同的情況下的透過率及細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)速度的比較利用實(shí)施例2(1)所述的方法獲得攪拌培養(yǎng)bc液。其中，使用糖蜜及試劑甘油代替葡萄糖來作為碳源。此外，使用糖蜜作為碳源時(shí)，將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為3天，來代替4天。然后，利用實(shí)施例3(2)[2-1]所述的方法測定含細(xì)菌纖維素的水的光透過率。此外，將攪拌培養(yǎng)bc液干燥，測定細(xì)菌纖維素的絕干重量，基于測定結(jié)果算出每1l培養(yǎng)基的細(xì)菌纖維素的濃度，將其作為細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)量(bc生產(chǎn)量、g/l)。此外，算出將bc生產(chǎn)量除以主培養(yǎng)的天數(shù)而得的值，將其作為細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)速度(bc生產(chǎn)速度、g/l/天)。其結(jié)果如圖6所示。如圖6的表及左側(cè)的棒圖所示，使用糖蜜作為碳源時(shí)的透過率為57％，與使用試劑甘油作為碳源時(shí)的57％為相同的值。由該結(jié)果可知，通過以糖蜜作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，與以試劑甘油作為碳源時(shí)同樣地獲得了含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率顯著高的細(xì)菌纖維素。由此表明，通過將糖蜜作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可獲得分散性高、在液體中均一地分散的細(xì)菌纖維素。此外，如圖6的表及右側(cè)的棒圖所示，將糖蜜作為碳源時(shí)，bc生產(chǎn)速度為1.48g/l/天，比以試劑甘油為碳源時(shí)的0.95g/l/天大約1.5倍。由該結(jié)果可知，通過將糖蜜作為碳源對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可在短時(shí)間內(nèi)大量獲得分散性高的細(xì)菌纖維素。<實(shí)施例5>細(xì)菌不同的情況下的透過率及細(xì)菌纖維素生產(chǎn)速度的比較利用實(shí)施例2(1)所述的方法獲得攪拌培養(yǎng)bc液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖來作為碳源。此外，作為細(xì)菌，分別使用了nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株。此外，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)，在主培養(yǎng)的第3天，培養(yǎng)基中的碳源幾乎變沒，因此將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為3天，來代替4天。另一方面，使用dsm11804株時(shí)，在主培養(yǎng)的第4天，培養(yǎng)基中的碳源的減少程度還很小，因此將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為5天，來代替4天。然后，利用實(shí)施例3(2)[2-1]所述的方法測定含細(xì)菌纖維素的水的光透過率。此外，利用實(shí)施例4所述的方法算出bc生產(chǎn)量(g/l)及bc生產(chǎn)速度(g/l/天)，對于透過率及bc生產(chǎn)速度其數(shù)值示于棒圖中。其結(jié)果如圖7所示。如圖7的表及左側(cè)的棒圖所示，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)的透過率為57％，與此相對地，使用漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株時(shí)的透過率分別為20％、33％、29％、27％、9％及13％。由該結(jié)果可知，含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的、培養(yǎng)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長500nm的光透過率比培養(yǎng)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以外的菌株而獲得的含細(xì)菌纖維素的水的該透過率顯著大，為35％以上。由此可知，通過對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以獲得分散性高、在液體中均一地分散的細(xì)菌纖維素。此外，如圖6的表及右側(cè)的棒圖所示，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)的bc生產(chǎn)速度為1.48g/l/天，與此相對地，使用漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株時(shí)的bc生產(chǎn)速度分別為1.05g/l/天、1.03g/l/天、1.11g/l/天、1.10g/l/天、0.42g/l/天及0.43g/l/天。即，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)的bc生產(chǎn)速度顯著大于使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以外的菌株時(shí)的bc生產(chǎn)速度。該結(jié)果表明，通過對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以在短時(shí)間內(nèi)大量獲得分散性高的細(xì)菌纖維素。<實(shí)施例6>細(xì)菌纖維素的分子量準(zhǔn)備實(shí)施例3(2)的樣品a、b、c及d以及來自紙漿的cnf液作為試樣。將這些試樣冷凍干燥，加入57～59％四丁基氫氧化磷水溶液，在35℃下靜置溶解，然后加入水，使四丁基氫氧化磷的濃度為40～42％(w/w)、試樣的濃度為0.2％(w/w)。然后進(jìn)行離心分離而使雜質(zhì)沉淀，回收上清。將該上清在下述條件下供于凝膠滲透色譜，測定色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積。同一上清在同一條件下測定3次。其結(jié)果如表3所示，且隨機(jī)選擇的色譜圖如圖8所示。凝膠滲透色譜的條件機(jī)器：高效液相色譜(株式會社島津制作所)柱：填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內(nèi)徑為6.0mm及長度為15cm的柱(tskgelsuperawm-h：東曹公司)保護(hù)柱：內(nèi)徑為4.6mm、長度為3.5cm(tskguardcolumsuperaw-h：東曹公司)柱溫度：35℃送液速度：0.07ml/分鐘樣品注入量：10μl洗脫液：40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液洗脫液中的細(xì)菌纖維素的終濃度：0.2％(w/w)對照樣品：分子量為85.3×104的普魯蘭多糖(shodexstandardp-82)[表3]如表3及圖8所示，樣品a、b、c及d的峰頂?shù)谋Ａ趔w積以平均計(jì)分別為2.79ml、2.81ml、2.82ml及2.76ml，小于來自紙漿的cnf液的3.04ml及普魯蘭多糖的3.24ml。該結(jié)果表明，對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的平均分子量大于來自紙漿的纖維素，以普魯蘭多糖換算大于85.3×104。此外，如表3所示，樣品a、b、c及d的峰頂?shù)谋Ａ趔w積在2.737～2.849ml的范圍，因此表明在將對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素在上述條件下供于凝膠滲透色譜時(shí)，色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積為2.5ml以上且小于3.0ml。<實(shí)施例7>細(xì)菌纖維素的形態(tài)(1)纖維寬度的測定準(zhǔn)備使用了實(shí)施例2(1)的甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液及實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液。將它們的纖維素濃度調(diào)制為約0.001％(w/w)后，分別將10μl滴加到包覆有聚乙烯醇縮甲醛(福姆瓦)的銅網(wǎng)上并風(fēng)干。然后，滴加5μl5％(w/v)醋酸釓水溶液，10秒后用濾紙除去多余的液體，由此進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡在加速電壓為80kv、觀察倍率為30000倍條件下觀察，基于觀察圖像測定纖維素纖維的寬度。其結(jié)果如圖9所示。如圖9所示，對于攪拌培養(yǎng)bc液，其纖維素纖維的寬度為17±8nm，與混合器處理靜置培養(yǎng)bc液的纖維素纖維的寬度55±22nm相比顯著小，且標(biāo)準(zhǔn)偏差也小。由該結(jié)果可知，對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的是細(xì)菌纖維素細(xì)、纖維間的寬度偏差小的均一的纖維。(2)纖維寬度的均一性及聚集狀態(tài)的確認(rèn)準(zhǔn)備使用了實(shí)施例2(1)的bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液及實(shí)施例3(1)的來自紙漿的cnf液。將它們的纖維素濃度調(diào)制為約0.01％(w/w)后，將噴霧到包覆有聚乙烯醇縮甲醛的銅網(wǎng)上并用干燥器使其干燥的操作反復(fù)進(jìn)行10次。然后，滴加5μl5％(w/v)醋酸釓水溶液，用濾紙除去多余的液體。進(jìn)而，將滴加5μl的超純水后用濾紙除去多余的液體的一系列操作反復(fù)進(jìn)行2次，然后風(fēng)干，由此進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡，在加速電壓為80kv、觀察倍率為10000倍的條件下觀察。其結(jié)果如圖10所示。此外，使用偏光顯微鏡通過正交尼科爾棱鏡進(jìn)行了觀察。其結(jié)果如圖11所示。如圖10所示，對于攪拌培養(yǎng)bc液觀察到較多的納米級的同等寬度的纖維素纖維，與此相對地，對于來自紙漿的cnf液則觀察到各種寬度的纖維素纖維，在較大的纖維中觀察到了纖維寬度為約500nm以上的纖維。由該結(jié)果再次確認(rèn)了對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素為納米級的寬度均一的纖維。此外，如圖11所示，如箭頭標(biāo)記所示，在來自紙漿的cnf液中明確觀察到較粗的纖維，與此相對地，對于攪拌培養(yǎng)bc液，在用虛線包圍的部分觀察到模糊地影像。由該結(jié)果可知，對于來自紙漿的纖維素，存在亞微纖維(submicrofiber)、微纖維等較粗的纖維，而對nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素為納米級的細(xì)纖維均一地分散著。<實(shí)施例8>細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力的評價(jià)(1)靜置培養(yǎng)中的生產(chǎn)能力調(diào)制在lb培養(yǎng)基中添加了經(jīng)過了前處理的bdf-b及試劑甘油代替葡萄糖來作為碳源的培養(yǎng)基，作為lb/bdf-b培養(yǎng)基及l(fā)b/甘油培養(yǎng)基。將nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、木葡糖醋桿菌atcc53582株、漢森葡糖醋桿菌atcc23769株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株接種到lb/甘油培養(yǎng)基及l(fā)b/bdf-b培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行7天靜置培養(yǎng)，由此使其生成凝膠狀膜。在其中加入1％(w/v)naoh水溶液并進(jìn)行高壓釜處理，將該操作反復(fù)進(jìn)行至凝膠狀膜變?yōu)榘咨?。然后，將加水進(jìn)行高壓釜處理的操作反復(fù)進(jìn)行至ph為7以下，進(jìn)行精制。精制后，測定干燥而獲得的細(xì)菌纖維素的絕干重量。其結(jié)果如圖12所示。如圖12所示，在lb/甘油培養(yǎng)基及l(fā)b/bdf-b培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中，漢森葡糖醋桿菌atcc23769株的細(xì)菌纖維素的重量均小。此外，木葡糖醋桿菌atcc53582株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株在lb/甘油培養(yǎng)基中細(xì)菌纖維素的重量較大，但在lb/bdf-b培養(yǎng)基中沒有確認(rèn)到細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。與此相對地，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)在lb/甘油培養(yǎng)基及l(fā)b/bdf-b培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中細(xì)菌纖維素的重量為同等大小。這些結(jié)果表明，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)不僅可將試劑甘油為碳源，也可將bdf-b作為碳源，通過靜置培養(yǎng)有效地生產(chǎn)細(xì)菌纖維素?？蓪df-b作為碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的特征是其它比較株所不具有的特征，在可利用副產(chǎn)物的實(shí)用方面也是有利的，且非常有助于降低生產(chǎn)成本。(2)攪拌培養(yǎng)中的生產(chǎn)能力在10ml的hs培養(yǎng)基中接種nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、atcc53582株及atcc23769株，在30℃下進(jìn)行3天靜置培養(yǎng)，由此進(jìn)行前前培養(yǎng)。然后，將進(jìn)行前前培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)液接種在10ml的hs培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行3天靜置培養(yǎng)，由此進(jìn)行前培養(yǎng)。然后，在帶槳葉的三角燒瓶中裝入100ml的實(shí)施例2(1)的甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基，對各菌株接種相當(dāng)于相同菌體數(shù)的量的前培養(yǎng)液，在150rpm、30℃的條件下進(jìn)行3天振蕩培養(yǎng)，由此進(jìn)行主培養(yǎng)。然后，利用實(shí)施例2(1)所述的方法對主培養(yǎng)液中的細(xì)菌纖維素進(jìn)行精制。其中，在60℃、80rpm下振蕩4～5小時(shí)后，再在20℃下振蕩一晚。使精制后的細(xì)菌纖維素干燥后測定絕干重量。其結(jié)果如圖13所示。如圖13所示，木葡糖醋桿菌atcc53582株在甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中均沒有確認(rèn)到細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。此外，漢森葡糖醋桿菌atcc23769株，在甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基中細(xì)菌纖維素的絕干重量較大，但在bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中沒有確認(rèn)到細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。與此相對地，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)在甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中，細(xì)菌纖維素的絕干重量均大。該結(jié)果表明，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)不僅可將試劑甘油作為碳源，也可將bdf-b作為碳源，不僅可通過靜置培養(yǎng)也可通過攪拌培養(yǎng)而有效地生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。當(dāng)前第1頁12