本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，尤其涉及的是一種檢測(cè)brafv600e基因突變的試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

raf基因是癌癥基因的一類，raf家族中包括araf、braf、craf，其中braf基因突變常出現(xiàn)在癌變細(xì)胞中，如：黑色素瘤(>60％)和結(jié)直腸癌。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，酪氨酸受體依次與ras家族蛋白激酶，raf絲氨酸-蘇氨酸激酶，絲裂原活化蛋白激酶(map)連接，這一通路在癌癥細(xì)胞中被頻繁激活。map激酶，也被認(rèn)為是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(erk)，在多個(gè)重要的生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要作用，如表皮生長(zhǎng)因子(egf)。brafv600e突變蛋白在體外即可以激活人類黑色素瘤中的raf/mek/erk通路，同時(shí)也可以激活map通路。

皮膚黑色素瘤是最惡性的皮膚癌，每年全球發(fā)病約20萬(wàn)例，在未來(lái)的幾年里還會(huì)繼續(xù)增加，黑色素瘤中30％-60％存在braf基因突變。雖然brafv600e特異性抑制劑維羅非尼對(duì)brafv600e轉(zhuǎn)移型黑色素瘤有顯著的療效，然而在用藥8個(gè)月后，癌細(xì)胞就會(huì)對(duì)維羅非尼產(chǎn)生抗藥作用。盡管黑色素瘤占所有類型皮膚癌的4％，但是死亡率卻高達(dá)80％。存活率完全取決于所處的臨床階段，晚期和局部轉(zhuǎn)移患者的5年生存率分別為15％和60％，所以及早檢測(cè)確診，對(duì)黑色素瘤患者的治療至關(guān)重要。

目前已有的幾種檢測(cè)braf基因突變技術(shù)可分為篩選分析法和靶向分析法，篩選分析法能夠在整個(gè)擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)識(shí)別突變，靶向分析法能夠特異性地?cái)U(kuò)增突變片段。在篩選分析法中，雙向測(cè)序(sanger測(cè)序)和焦磷酸測(cè)序在臨床中的應(yīng)用最為廣泛，特異等位基因pcr(taqman)法是最常見(jiàn)靶向分析法。所有的檢測(cè)方法都經(jīng)過(guò)分析靈敏度、特異性、檢測(cè)限、成本和響應(yīng)延遲等方面的驗(yàn)證。篩選分析法中的雙向測(cè)序法的檢測(cè)限為20％，焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)限為5％-10％，而以實(shí)時(shí)pcr為基礎(chǔ)的靶向分析法的檢測(cè)為1％或者更低。相比于其他類型的腫瘤，黑色素瘤中braf突變存在多種限制因素，高濃度黑色素會(huì)對(duì)pcr產(chǎn)生影響，也已經(jīng)有研究報(bào)道其存在瘤內(nèi)異質(zhì)性。因此，需要開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法解決存在的問(wèn)題，避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

taqmanpcr是一種基于taqman的特異性等位基因pcr，在pcr反應(yīng)中突變特異等位基因引物(asp)與野生型特異等位基因阻滯子(asb)結(jié)合，利用阻滯分子完全抑制野生型等位基因片段的擴(kuò)增，從而排除突變等位基因擴(kuò)增的影響，提高特異性和靈敏度。雙盲測(cè)試比較直接測(cè)序、單鏈構(gòu)象分析(ssca)、高分辨熔煉分析(hrm)和cast-pcr，taqmanpcr顯示出對(duì)braf突變檢測(cè)的高靈敏度和速度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有brafv600e突變檢測(cè)技術(shù)中存在的不足，提供一種高效、快速、低檢測(cè)限的檢測(cè)brafv600e基因突變的試劑盒，本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)brafv600e基因突變的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)brafv600e基因突變的試劑盒，包括一對(duì)brafv600e特異性引物(上游引物、下游引物)、一種檢測(cè)brafv600e的taqman-mgb探針，其特征在于：所述的一對(duì)特異性引物和taqman-mgb探針?lè)謩e是：

上游引物：5’-agggtttccactgtcaaaca-3’

下游引物：5’-tcatcactcgactcccgtct-3’

taqman探針：fam-5’-ccacagcccttccgaccagc-3’-mgb

優(yōu)選的，所述的taqman探針的5’端包含有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3’端包含有淬滅基團(tuán)mgb。

優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括pcr緩沖液、taqdna聚合酶、mg²⁺、dntp混合物、rnasefreeh2o。

作為優(yōu)選，所述taqdna聚合酶的濃度為0.05u/ul，mg2+濃度為4mm，dntp混合物濃度為0.4mm。

一種檢測(cè)brafv600e基因突變的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)提取癌細(xì)胞的rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，稀釋cdna濃度至10ng/ul；

2)熒光定量pcr最優(yōu)反應(yīng)體系為20ul，具體包括：10×pcrbuffer2ul，上游引物1ul，下游引物1ul，dntp混合物1.6ul，taqdna聚合酶0.4ul，taqman-mgb探針1ul，mg²⁺1.6ul,cdna模板1ul，rnasefreeh2o10.4ul；

3)放入熒光定量pcr儀中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件如下：

4)收集后40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，用mutationdetector^tmsoftwareversion2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并計(jì)算樣本的突變率。

優(yōu)選的，步驟1)中cdna模板的稀釋使用rnasefreeh2o作為溶劑。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)中用brafv600e突變片段作為陽(yáng)性對(duì)照，rnasefreeh2o作為陰性對(duì)照。

本發(fā)明提供了檢測(cè)brafv600e基因突變的試劑盒，具體包括：一對(duì)brafv600e特異性引物(上游引物、下游引物)、一種檢測(cè)brafv600e的taqman-mgb探針、pcr緩沖液、taqdna聚合酶、mg²⁺、dntp混合物、rnasefreeh2o，本發(fā)明基于biorad平臺(tái)采用熒光定量pcr儀，對(duì)taqman探針進(jìn)行設(shè)計(jì)，該方法克服了傳統(tǒng)pcr技術(shù)操作復(fù)雜，檢測(cè)限高、準(zhǔn)確度低的缺點(diǎn)，利用taqman探針提高了檢測(cè)的特異性，taqman探針3’端的存在一個(gè)mgb淬滅基團(tuán)，相比較與傳統(tǒng)的淬滅基團(tuán)，mgb提高了探針的tm值，使pcr擴(kuò)增過(guò)程更穩(wěn)定，結(jié)果更可靠；mgb是不發(fā)光的熒光基團(tuán)，提高了熒光定量pcr的信噪比，從而提高了分辨率；從空間位置上看mbg更靠近報(bào)告基因，使結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性得到提高。使用本發(fā)明試劑盒對(duì)brafv600e基因突變進(jìn)行檢測(cè)，大大地提高了檢測(cè)效率和對(duì)癌癥的診斷效率，精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果也為癌癥診斷提供了有力的依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中，用引物對(duì)2作為特異性引物對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行熒光定量pcr分析的結(jié)果；

圖2為實(shí)施例3中，用引物對(duì)3作為特異性引物對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行熒光定量pcr分析的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

1)提取癌細(xì)胞的rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，稀釋cdna濃度至10ng/μl；

2)熒光定量pcr反應(yīng)體系為20ul，具體包括：10×pcrbuffer2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg²⁺1.6μl,cdna模板1μl，rnasefreeh2o10.4μl；

3)半定量pcr反應(yīng)條件如下：

4)對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

作為優(yōu)選，最初設(shè)計(jì)出四組brafv600e特異性引物對(duì)：

上游引物1：5’-agaggcgtccttagcagaga-3’

下游引物1：5’-gacttctggtgccatccaca-3’

上游引物2：5’-agacgggactcgagtgatga-3’

下游引物2：5’-gacttctggtgccatccaca-3’

上游引物3：5’-agggtttccactgtcaaaca-3’

下游引物3：5’-tcatcactcgactcccgtct-3’

上游引物4：5’-agaggacagtggtacctgca-3’

下游引物4：5’-atcggtctcgttgcccaaat-3’

從凝膠電泳的分析結(jié)果中初步篩選出沒(méi)有擴(kuò)增出非特異性片段的引物對(duì)2和3，作為本發(fā)明試劑盒中的特異性引物。

實(shí)施例2

1)提取癌細(xì)胞的rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，用rnasefreeh2o稀釋cdna濃度至10ng/μl，再對(duì)cdna分別進(jìn)行1:5、1:10、1：25、1:50、1:100的稀釋；

2)熒光定量pcr最優(yōu)反應(yīng)體系為20μl，具體包括：10×pcrbuffer2μl，上游引物21μl，下游引物21μl，dntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，taqman-mgb探針1μl，mg²⁺1.6μl,cdna模板1μl，rnasefreeh2o10.4μl；

上游引物2：5’-agacgggactcgagtgatga-3’

下游引物2：5’-gacttctggtgccatccaca-3’

taqman探針2：fam-5’-agacgggactcgagtgatga-3’-mgb

3)放入熒光定量pcr儀中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件如下：

4)收集后40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，用mutationdetectortmsoftwareversion2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

實(shí)施例3

1)提取癌細(xì)胞的rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，用rnasefreeh2o稀釋cdna濃度至10ng/μl，再對(duì)cdna分別進(jìn)行1:5、1:10、1：25、1:50、1:100的稀釋；

2)熒光定量pcr最優(yōu)反應(yīng)體系為20μl，具體包括：10×pcrbuffer2μl，上游引物31μl，下游引物31μl，dntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，taqman-mgb探針1μl，mg²⁺1.6μl,cdna模板1μl，rnasefreeh2o10.4μl；

上游引物3：5’-agggtttccactgtcaaaca-3’

下游引物3：5’-tcatcactcgactcccgtct-3’

taqman探針3：fam-5’-ccacagcccttccgaccagc-3’-mgb

3)放入熒光定量pcr儀中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件如下：

4)收集后40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，用mutationdetectortmsoftwareversion2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

參照附圖1和圖2，從附圖2中可以看出引物組3在低濃度樣本中達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)更少，即ct值更低，且從重復(fù)性方面分析，引物組2(附圖1)在樣本濃度較高時(shí)重復(fù)性稍強(qiáng)于引物組3，但是低濃度是引物對(duì)2重復(fù)性更好，綜合以上結(jié)果，本發(fā)明將優(yōu)選用引物組3作為試劑盒中的擴(kuò)增特異性引物和探針引物。

上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。