本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種果蠅轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的調(diào)控方法。

背景技術(shù)：

在經(jīng)典模式生物黑腹果蠅drosophilamelanogaster中，gal4/uas系統(tǒng)是目前最常用的轉(zhuǎn)基因表達(dá)工具。gal4(galactose4)是酵母半乳糖/蜜二糖代謝系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活因子，可結(jié)合dna序列uas(upstreamactivatingsequence)的特異性位點(diǎn)并激活其下游基因的表達(dá)(johnstonandhopper,1982；ginigeretal.,1985)。fischer等(1988)首次發(fā)現(xiàn)果蠅中轉(zhuǎn)基因gal4可特異性激活uas轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。brand和perrimon(1993)基于轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)，選用特定啟動(dòng)子(或增強(qiáng)子)驅(qū)動(dòng)的gal4，結(jié)合uas序列后可驅(qū)動(dòng)下游靶基因的異位過表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的操控。根據(jù)rnai原理，uas下游設(shè)計(jì)靶基因特異性序列，可實(shí)現(xiàn)對內(nèi)源基因表達(dá)的特異性干擾(dietzlg,etal.,2007)。

然而在gal4/uas系統(tǒng)中，過度升高或干擾基因表達(dá)水平往往引起細(xì)胞凋亡和早期致死等作用，影響對基因功能的研究。果蠅器官中，一些重要基因產(chǎn)物如信號分子以濃度梯度方式擴(kuò)散(例如dpp和wg)，不同濃度能激活不同的下游靶基因，如wg在高濃度時(shí)激活senseless(sens)，在中濃度時(shí)激活distal-less(dll)，在低濃度時(shí)激活vestigial(vg)，從而協(xié)調(diào)翅芽的整體發(fā)育(cousoetal.,1994；cooketal.,2004；歐俊等,2013)。因此，在研究基因功能時(shí)，需要按需操控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)度，否則不能全面揭示基因的功能機(jī)理。此外，不同細(xì)胞群對同一種基因信號改變的應(yīng)答效應(yīng)也不同，如dsnx3突變后，wg濃度在分泌細(xì)胞中升高，在接收細(xì)胞中下降(zhangetal.,2011)。因此轉(zhuǎn)基因表達(dá)量的靈活控制在信號通路調(diào)控研究中極其重要。

目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平調(diào)控的研究甚少。前人研究發(fā)現(xiàn)，gal4驅(qū)動(dòng)uas轉(zhuǎn)基因過表達(dá)的能力幾乎是確定的，要調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，需要重新構(gòu)建品系，而構(gòu)建新的品系非常不便(pfeifferetal.,2010)。但是在較高溫度(29℃)比低溫(22℃)rna干擾的效率更高該規(guī)律同樣適用于果蠅gal4/uas系統(tǒng)中對靶基因的干擾研究(fortiereandbelotejm,2000)。然而以上兩種現(xiàn)象均未進(jìn)行系統(tǒng)地研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種果蠅轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的調(diào)控方法，解決現(xiàn)有重組品系轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平調(diào)控研究不系統(tǒng)、無法確定溫度轉(zhuǎn)變對重組品系轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的影響的技術(shù)問題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種果蠅轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的調(diào)控方法，其包括以下步驟：

1)假設(shè)靶基因?yàn)閤，首先將攜帶uas-x轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)果蠅品系和攜帶有另一個(gè)轉(zhuǎn)基因uas-x-rnai的rnai品系進(jìn)行重組，得到重組果蠅品系中包含uas-x和uas-x-rnai轉(zhuǎn)基因；

2)該重組品系與另一個(gè)gal4品系雜交，用gal4驅(qū)動(dòng)該重組品系的uas-x和uas-x-rnai轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使得靶基因x過表達(dá)和rnai介導(dǎo)的表達(dá)抑制得以同時(shí)進(jìn)行；

3)將步驟2)中g(shù)al4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代分別放置在16-18℃低溫下、25℃和29-30℃高溫下進(jìn)行培養(yǎng)，長至某一特定年齡時(shí)，檢測其靶基因表達(dá)水平；16-18℃低溫下靶基因x得到溫和的過表達(dá)，29-30℃高溫下靶基因表達(dá)受到抑制；

4)對步驟2)中g(shù)al4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代進(jìn)行16-18℃低溫培養(yǎng)，長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平，同期其它子代轉(zhuǎn)移至29-30℃高溫培養(yǎng)，繼續(xù)生長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平；在發(fā)育前期靶基因過表達(dá)，發(fā)育后期靶基因的表達(dá)受到抑制；

5)對步驟2)中g(shù)al4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代進(jìn)行29-30℃高溫培養(yǎng)，長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平，同期其它子代轉(zhuǎn)移至16-18℃低溫培養(yǎng)，繼續(xù)生長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平；在發(fā)育前期靶基因的表達(dá)受到抑制，發(fā)育后期靶基因過表達(dá)。

進(jìn)一步，所述果蠅轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的調(diào)控方法適用于其它gal4/uas的系統(tǒng)模式。

本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)序列和rnai序列重組后，檢測不同溫度下轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特征；然后檢測轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)序列和rnai序列重組后，經(jīng)過溫度轉(zhuǎn)變在不同發(fā)育時(shí)期目標(biāo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)變；通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度，在某一特定發(fā)育時(shí)期，將基因表達(dá)控制在特定水平，之后又調(diào)節(jié)至另一水平，實(shí)現(xiàn)深入基因的發(fā)育過程中的功能研究，提升基因研究的層次。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有操作簡單、可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)量的靈活控制的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是果蠅三齡幼蟲wg內(nèi)源表達(dá)部位和dpp-gal4驅(qū)動(dòng)uas-gfp表達(dá)部位檢測，其中：a：野生型果蠅中wg抗體染色顯示內(nèi)源wg在翅囊的輪廓以及d/v邊界表達(dá)；b：dpp-gal4驅(qū)動(dòng)uas-gfp轉(zhuǎn)基因在前隔間靠近a/p邊界處；

圖2是果蠅三齡幼蟲翅芽在不同溫度下dpp-gal4驅(qū)動(dòng)uas-wg后wg表達(dá)水平變化，其中：a：18℃；b：25℃；c：30℃；

圖3是果蠅三齡幼蟲翅芽在不同溫度下dpp-gal4驅(qū)動(dòng)uas-wg-rnai后wg表達(dá)水平變化，其中：a：18℃；b：25℃；c：30℃；

圖4是果蠅三齡幼蟲翅芽在不同溫度下dpp-gal4同時(shí)驅(qū)動(dòng)uas-wg和uas-wg-rnai后wg表達(dá)水平變化，其中：a：18℃；b：25℃；c：30℃；

圖5是果蠅翅芽不同發(fā)育時(shí)期溫度轉(zhuǎn)變后dpp-gal4同時(shí)驅(qū)動(dòng)uas-wg和uas-wg-rnai后wg表達(dá)水平變化，其中：a：18℃培養(yǎng)時(shí)三齡早期翅芽；b：從18℃轉(zhuǎn)移至30℃后三齡末期翅芽；c：30℃培養(yǎng)時(shí)三齡早期翅芽；d：從30℃轉(zhuǎn)移至18℃后三齡末期翅芽。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種果蠅轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的調(diào)控方法，其包括以下步驟：

1)假設(shè)靶基因?yàn)閣g，首先將攜帶uas-wg轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)果蠅品系和攜帶有另一個(gè)轉(zhuǎn)基因uas-wg-rnai的rnai品系進(jìn)行重組，得到重組果蠅品系中包含uas-wg和uas-wg-rnai轉(zhuǎn)基因；

2)該重組品系與另一個(gè)dpp-gal4品系雜交，用dpp-gal4驅(qū)動(dòng)該重組品系的uas-wg和uas-wg-rnai轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使得靶基因wg過表達(dá)和rnai介導(dǎo)的表達(dá)抑制得以同時(shí)進(jìn)行；

3)將步驟2)中dpp-gal4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代分別放置在18℃低溫下、25℃和30℃高溫下進(jìn)行培養(yǎng)，長至某一特定年齡時(shí)，檢測其靶基因表達(dá)水平；18℃低溫下靶基因wg得到溫和的過表達(dá)，30℃高溫下靶基因表達(dá)受到抑制；

4)對步驟2)中dpp-gal4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代進(jìn)行18℃低溫培養(yǎng)，長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平，同期其它子代轉(zhuǎn)移至30℃高溫培養(yǎng)，繼續(xù)生長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平；在發(fā)育前期靶基因過表達(dá)，發(fā)育后期靶基因的表達(dá)受到抑制；

5)對步驟2)中dpp-gal4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代進(jìn)行30℃高溫培養(yǎng)，長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平，同期其它子代轉(zhuǎn)移至18℃低溫培養(yǎng)，繼續(xù)生長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平；在發(fā)育前期靶基因的表達(dá)受到抑制，發(fā)育后期靶基因過表達(dá)。

如圖1至圖3所示，dpp-gal4與uas-wg雜交后子代三齡幼蟲在不同溫度下wg抗體染色后顯示wg表達(dá)水平無明顯差異；dpp-gal4與uas-wg-rnai雜交后子代三齡幼蟲在wg抗體染色后顯示wg表達(dá)水平隨溫度升高而降低。

如圖4所示，dpp-gal4與重組品系uas-wg-rnai；uas-wg雜交后子代三齡幼蟲在不同溫度下wg抗體染色后顯示wg表達(dá)水平在18℃過表達(dá)，且表達(dá)水平比圖1中明顯降低；25℃時(shí)，wg過表達(dá)水平較18℃低，但內(nèi)源wg表達(dá)正常；30℃時(shí)，dpp區(qū)域內(nèi)wg和內(nèi)源wg表達(dá)均明顯受抑制。

如圖5所示，dpp-gal4與重組品系uas-wg-rnai；uas-wg雜交后子代翅芽，18℃處理時(shí)三齡幼蟲早期wg過表達(dá)，轉(zhuǎn)到30℃長至末期后，wg表達(dá)被抑制；反之30℃處理時(shí)三齡幼蟲早期wg表達(dá)被抑制，轉(zhuǎn)到18℃長至末期后，wg過表達(dá)。

實(shí)施例2

一種果蠅轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的調(diào)控方法，其包括以下步驟：

1)假設(shè)靶基因?yàn)閛mb，首先將攜帶uas-omb轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)果蠅品系和攜帶有另一個(gè)轉(zhuǎn)基因uas-omb-rnai的rnai品系進(jìn)行重組，得到重組果蠅品系中包含uas-omb和uas-omb-rnai轉(zhuǎn)基因；

2)該重組品系與另一個(gè)dpp-gal4品系雜交，用dpp-gal4驅(qū)動(dòng)該重組品系的uas-omb和uas-omb-rnai轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使得靶基因omb過表達(dá)和rnai介導(dǎo)的表達(dá)抑制得以同時(shí)進(jìn)行；

3)將步驟2)中dpp-gal4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代分別放置在16℃低溫下、25℃和29℃高溫下進(jìn)行培養(yǎng)，長至某一特定年齡時(shí)，檢測其靶基因表達(dá)水平；16℃低溫下靶基因omb得到溫和的過表達(dá)，29℃高溫下靶基因表達(dá)受到抑制；

4)對步驟2)中dpp-gal4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代進(jìn)行16℃低溫培養(yǎng)，長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平，同期其它子代轉(zhuǎn)移至29℃高溫培養(yǎng)，繼續(xù)生長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平；在發(fā)育前期靶基因過表達(dá)，發(fā)育后期靶基因的表達(dá)受到抑制；

5)對步驟2)中dpp-gal4驅(qū)動(dòng)重組品系后的雜交子代進(jìn)行29℃高溫培養(yǎng)，長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平，同期其它子代轉(zhuǎn)移至16℃低溫培養(yǎng)，繼續(xù)生長至一定年齡時(shí)，檢測靶基因表達(dá)水平；在發(fā)育前期靶基因的表達(dá)受到抑制，發(fā)育后期靶基因過表達(dá)。

本發(fā)明能夠以多種形式具體實(shí)施而不脫離發(fā)明的精神或?qū)嵸|(zhì)，所以應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例不限于前述的細(xì)節(jié)，而應(yīng)在權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)廣泛地解釋，因此落入權(quán)利要求或其等效范圍內(nèi)的變化和改型都應(yīng)為權(quán)利要求所涵蓋。