在體液中檢測(cè)疾病或病癥標(biāo)志的方法與流程
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年1月19日的題為“在體液中檢測(cè)疾病或病癥標(biāo)志的方法”的中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00980109695.4的分案申請(qǐng)。
相關(guān)的美國(guó)申請(qǐng)
本申請(qǐng)要求于2008年6月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/073,434號(hào)和于2008年1月18日提交的第61/022,033號(hào)的權(quán)益，將其每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文以供參考用于所有目的。
本發(fā)明涉及識(shí)別如胎兒性別的情況或從患者的體液獲得的細(xì)胞中的腫瘤基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組、糖組、糖蛋白組、脂質(zhì)組和/或脂蛋白組標(biāo)志的疾病的標(biāo)記物的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤起源于累積遺傳和外遺傳改變的正常細(xì)胞。該多步驟的過程涉及導(dǎo)致正常細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化成惡性表型的多個(gè)基因改變。這些改變包括不可逆的dna序列變化(如突變、缺失、易位)并導(dǎo)致癌基因的激活、腫瘤抑制基因的失活、和基因的融合。這些事件的隨機(jī)性賦予基因異質(zhì)性，其給出為它們提供獨(dú)特表型的指示癌癥的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分子指紋(例如，一種或多種細(xì)胞成分諸如dna、rna、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等)。因此，獨(dú)特基因組的標(biāo)記/標(biāo)志已知由各種腫瘤表達(dá)(perouetal.(2000)nature406:747；lobenhoferetal.(2001)healthperspect.109:881；van’tveeretal.(2002)nature415:530(2002)；liottaandkohn(2003)nat.genet.33:10；ginosetal.(2004)cancerres.64:65；liu(2005)proc.natl.acad.sci.usa102:3531；grigoriadisetal.(2006)breastcancerresearch8:r56)。
原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤都可以數(shù)年保持沉默并未被檢測(cè)到。然而，這些潛伏的和隱蔽的腫瘤，以及先前被診斷的原發(fā)和轉(zhuǎn)移實(shí)體瘤每天脫落到循環(huán)系統(tǒng)中大約為一至六百萬個(gè)細(xì)胞/克腫瘤。這些循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，稱為ctc的大部分經(jīng)歷凋亡和死亡，而不同的細(xì)胞群可能會(huì)發(fā)展成新陳代謝性疾病。腫瘤細(xì)胞凋亡體、nda、核小體、rna、和蛋白質(zhì)也在腫瘤患者的血中發(fā)現(xiàn)。holmgren等人，blood93,3956(1999)。已進(jìn)行努力來研究腫瘤的標(biāo)志是否可以被識(shí)別并且它們是否可以被用來檢測(cè)或監(jiān)控癌癥。參見，ransohoff,naturereviewscancer5,142(2005)和mclerranetal.，clin.chem.54,44(2008)。
dna可以很容易地轉(zhuǎn)染入各種真核細(xì)胞中，即，一旦它內(nèi)在化到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，則它能夠?qū)⑵浠蛘系剿拗骷?xì)胞的基因組中。例如，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以被快速且非常高效地(50％-90％)轉(zhuǎn)染。還已經(jīng)證明dna從原核細(xì)胞向真核細(xì)胞的傳代并認(rèn)為會(huì)在真核細(xì)胞之間發(fā)生。從腫瘤細(xì)胞釋放的dna具有高的轉(zhuǎn)化活性。將來自培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的上清培養(yǎng)基加入到正常細(xì)胞中導(dǎo)致與在用作為鈣沉淀物給予的克隆ras基因轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的那些一樣多的轉(zhuǎn)化焦點(diǎn)的外觀。此外，當(dāng)健康大鼠被注射來自腫瘤攜帶鼠的血漿(因此含有腫瘤dna)時(shí)，在它們的肺細(xì)胞dna中發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記基因，即腫瘤基因在肺細(xì)胞中已被轉(zhuǎn)錄。
白細(xì)胞開始于骨髓中的多能造血干細(xì)胞并且沿著骨髓譜系(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、和嗜堿性細(xì)胞)或淋巴譜系(t和b淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)發(fā)育。骨髓系細(xì)胞(例如，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的主要功能是對(duì)感染生物、活的不需要的受損細(xì)胞、衰老和死亡細(xì)胞(凋亡的和壞死的)的吞噬作用，以及細(xì)胞碎片的清除。來自健康動(dòng)物的吞噬細(xì)胞并不復(fù)制并且是二倍體，即，具有1的dna指數(shù)。平均上，每個(gè)細(xì)胞包含<10ng的dna、<20ng的rna、以及<300ng的蛋白。
變異的不同基因表達(dá)模式，例如，與細(xì)胞類型、性別、年齡、個(gè)體間差異等相關(guān)的那些，已經(jīng)在健康供體的wbc中被識(shí)別。例如，“淋巴細(xì)胞相關(guān)的”簇(聚簇)具有55個(gè)獨(dú)特的基因。在嗜中性粒細(xì)胞中，還已經(jīng)報(bào)道了52個(gè)獨(dú)特基因簇表達(dá)中的顯著變異性。該簇中的基因可以被歸類到3個(gè)日益增加的特異性家族：(i)在許多類型的循環(huán)免疫細(xì)胞中遍在表達(dá)的那些；(ii)由骨髓系細(xì)胞表達(dá)的那些；和(iii)與粒細(xì)胞特異性的那些。
不同的wbc亞群的壽命從幾天(例如，嗜中性粒細(xì)胞)到幾個(gè)月(例如，巨噬細(xì)胞)變化。如同其它細(xì)胞類型，白細(xì)胞會(huì)衰老并最終死亡。在它們的衰老過程中，人血液和組織來源的吞噬細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞)呈現(xiàn)出所有的程序化細(xì)胞死亡(即凋亡)的典型的標(biāo)記，包括caspase激活、固縮核、和染色質(zhì)斷裂。這些細(xì)胞在它們的質(zhì)膜的胞外表面上還呈現(xiàn)出許多“食我(eat-me)”標(biāo)記(例如，磷脂酰絲氨酸、糖)。因此，垂死和死亡的細(xì)胞以及其亞細(xì)胞片段被其它吞噬細(xì)胞從組織和血液中清除。
在它們的激活后，吞噬細(xì)胞的凋亡加快。例如，嗜中性粒細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌之后，磷脂酰絲氨酸在它們的質(zhì)膜上外在化，從而導(dǎo)致它們的通過巨噬細(xì)胞的快速吞噬。激活的單核細(xì)胞還表明使各種腫瘤細(xì)胞系與升高水平的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。
已知循環(huán)的吞噬細(xì)胞吞噬活的和死的ctc和它們的片段，該過程導(dǎo)致吞噬細(xì)胞的dna(和其它細(xì)胞成分)含量的增加。例如，凋亡的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)表明被巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞吞噬。對(duì)于這樣的吞噬細(xì)胞活性的后果，與從具有良性前列腺狀況的患者獲得的巨噬細(xì)胞相比，從前列腺癌患者獲得的血液巨噬細(xì)胞顯示出在細(xì)胞內(nèi)包含非常更高水平的前列腺特異性抗原。參見herwigetal.，clinicalprostatecancer3,184(2004)和herwigetal.，prostate62,290(2005)。這被認(rèn)為是吞噬腫瘤細(xì)胞的結(jié)果。已知胎兒干細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、胎兒淋巴細(xì)胞，以及大量的無細(xì)胞胎兒核酸在母體血液中循環(huán)。參見cheungetal.，nat.genet.14,264(1996)。
還已經(jīng)表明當(dāng)來自人伯基特淋巴瘤細(xì)胞的凋亡體(膜包封的細(xì)胞片段)與人單核細(xì)胞(吞噬的)或血管平滑肌細(xì)胞(非吞噬的)一起培養(yǎng)時(shí)，單核細(xì)胞表現(xiàn)出高百分比的愛波斯坦-巴爾病毒(ebv)特異性的腫瘤基因陽(yáng)性細(xì)胞，而平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出大約0.01％頻率的吸收和表達(dá)。
需要可以提供在個(gè)體中，如已知沒有疾病或患有復(fù)發(fā)性疾病的個(gè)體中早期診斷疾病(如腫瘤)的存在的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是便于在動(dòng)物，包括人的白細(xì)胞(wbc)亞群中檢測(cè)疾病特異性(如腫瘤特異性)標(biāo)記，如蛋白質(zhì)、rna、dna、碳水化合物和/或脂質(zhì)等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的實(shí)施方式是基于使用吞噬細(xì)胞來確定與某一疾病或病癥相關(guān)的標(biāo)記物的存在與否。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在血中循環(huán)的結(jié)合細(xì)胞和/或片段和/或其成分的吞噬細(xì)胞是特定疾病或病癥的標(biāo)志(標(biāo)記，特征)。吞噬細(xì)胞的內(nèi)容物(含量)提供了特定疾病或病癥的標(biāo)記譜(分布)，例如通過細(xì)胞中的dna和/或蛋白含量或通過細(xì)胞進(jìn)行的dna或蛋白表達(dá)。吞噬和非吞噬wbc的dna表達(dá)譜的比較導(dǎo)致在吞噬細(xì)胞內(nèi)腫瘤特異性、疾病特異性或病癥特異性dna標(biāo)志的檢測(cè)，其在非吞噬細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。類似地，吞噬和非吞噬wbc的蛋白表達(dá)譜導(dǎo)致在吞噬細(xì)胞中腫瘤特異性、疾病特異性或病癥特異性蛋白標(biāo)志的檢測(cè)，其在非吞噬細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法在懷疑患有癌癥的個(gè)體中識(shí)別實(shí)體瘤(例如，原發(fā)和轉(zhuǎn)移損傷)的存在和/或在病理標(biāo)志和癥狀表現(xiàn)前識(shí)別實(shí)體瘤的存在，并檢測(cè)疾病的復(fù)發(fā)。根據(jù)其它實(shí)施方式，本發(fā)明的方法通過從血液或其它體液識(shí)別特異性標(biāo)志來診斷某些疾病或其它病癥。
本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即，個(gè)體的血細(xì)胞成分如吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞可以理想地適于腫瘤特異性和正常的、非特異性標(biāo)志的容易識(shí)別和區(qū)別，并且因此消除由于固有的個(gè)體間差異(如年齡、性別、種族背景、健康狀態(tài))和基因表達(dá)中的短暫改變?cè)斐傻幕€的不平坦。
在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種用于在懷疑患有癌癥和/或一種或多種其它疾病或障礙或病癥的個(gè)體的wbc(從血液或其它體液，如尿、糞便、淋巴、腦脊液等中獲得)中識(shí)別腫瘤和/或其它疾病特異性標(biāo)志的方法。本發(fā)明的實(shí)施方式提供了患者特異性結(jié)果，并且不依賴于種群衍生的平均標(biāo)志譜和從“健康”對(duì)照獲得的值，即基線/本底標(biāo)志對(duì)被評(píng)價(jià)的個(gè)體的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組、糖組、糖蛋白組、脂質(zhì)組、和/或脂蛋白組譜是特異性的。本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種篩查、診斷和監(jiān)測(cè)疾病的個(gè)性化誘因。
在某些實(shí)施方式中并參照?qǐng)D1，本發(fā)明是基于吞噬細(xì)胞吞噬并消化下列物質(zhì)的能力：活的、垂死和死亡的細(xì)胞(例如，凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞)，微生物(如細(xì)菌(如，立克次氏體)、病毒、真菌、酵母、原生動(dòng)物等)亞細(xì)胞顆粒和/或它們的片段(卡哈爾體、細(xì)胞膜、中心粒、中心體、基因工程微生物(gems)、高爾基體、溶酶體、線粒體、核膜、細(xì)胞核、核仁、旁斑體、早幼粒細(xì)胞性白血病體(pml體)、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、空泡、泡囊、微囊等)，和細(xì)胞碎片，如染色體，dna(核的和線粒體的)，外顯子，基因，內(nèi)含子，蛋白質(zhì)，朊蛋白，碳水化合物結(jié)合蛋白，糖蛋白，脂蛋白，rna，微小rna，脂質(zhì)，凋亡小體，細(xì)胞核，微囊，外來體，核小體，多形間期核復(fù)合物(pika)，剪接斑等)，并且在非吞噬細(xì)胞中不存在這些標(biāo)志。因此，對(duì)dna(核的，線粒體的)、rna、微小rna、蛋白質(zhì)、朊蛋白、碳水化合物結(jié)合蛋白、糖蛋白、脂質(zhì)、脂蛋白、凋亡小體、核、微囊、外來體和/或核小體和/或吞噬wbc的表達(dá)譜的分析以及它們與從同一供體的血或其它體液獲得的非吞噬細(xì)胞的那些的比較提供了吞噬細(xì)胞(患者特異性標(biāo)志)中腫瘤和/或疾病特異性標(biāo)志的識(shí)別，其在非吞噬細(xì)胞中不表達(dá)或者顯著不同地表達(dá)(患者特異性噪聲)。由于吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞都由骨髓中相同的多能干細(xì)胞產(chǎn)生，因此如圖2所示，從吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志減去非腫瘤相關(guān)/誘導(dǎo)的標(biāo)志譜(在非吞噬細(xì)胞中識(shí)別)允許識(shí)別在特定患者樣本中腫瘤和/或疾病特異性標(biāo)志。根據(jù)某些其它實(shí)施方式，體液中的細(xì)胞碎片可以通過entosis(細(xì)胞吸收)、胞吞和胞飲作用而內(nèi)化。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式并參照?qǐng)D3，從具有包括吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞(如wbc)的血液樣品的患者中獲得血液樣品。吞噬細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、泡沫細(xì)胞)于是與非吞噬細(xì)胞(如t細(xì)胞、b細(xì)胞、裸細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分開。根據(jù)本發(fā)明，wbc的表型通過吞噬活的/垂死的/死亡的ctc(以及它的亞細(xì)胞片段)和/或血液中存在的腫瘤和/或疾病特異性dna、rna、蛋白、碳水化合物和/或脂質(zhì)而改變。吞噬作用導(dǎo)致這些腫瘤和/或疾病標(biāo)志內(nèi)化到吞噬的細(xì)胞中并且很可能使具有其腫瘤特異性體細(xì)胞突變(或其它疾病相關(guān)的突變)的腫瘤細(xì)胞dna整合到正常吞噬細(xì)胞dna中(即，其靶細(xì)胞的染色體的轉(zhuǎn)染)。吞噬細(xì)胞的“轉(zhuǎn)染”dna隨后轉(zhuǎn)錄成rna并且將rna翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)生了與非吞噬wbc不同的表型。
因此，利用從具有癌癥(和/或一種或多種其它疾病)的個(gè)體獲得的吞噬和非吞噬wbc(如圖3所示)的dna、rna、蛋白、和/或脂質(zhì)表達(dá)譜的領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的基因組、蛋白質(zhì)組的、代謝物組的、糖組的、糖蛋白組的、脂質(zhì)組的和/或脂蛋白組方法的比較用于識(shí)別吞噬細(xì)胞中選擇性的腫瘤特異性(和/或疾病特異性和/或病癥特異性)標(biāo)志和/或譜，其證實(shí)了在個(gè)體中存在隱伏腫瘤(或其它疾病或病癥)。根據(jù)本發(fā)明，如圖2所示，從非吞噬細(xì)胞減去吞噬細(xì)胞的dna、rna、蛋白、碳水化合物和/或脂質(zhì)譜提供了用于識(shí)別(即，在基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組、糖組、糖蛋白組、脂質(zhì)組和/或脂蛋白組的分析后)特定患者的血液樣品(和/或其它生物樣品)中的腫瘤特異(和/或疾病特異性)標(biāo)志的方法并意味著隱伏腫瘤和/或其它疾病的存在。
在某些示例性的實(shí)施方式中，將吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞(如，從血液或一種或多種其它生物樣品(如尿、糞便、唾液、淋巴、腦脊液等)中獲得的)分開。由于吞噬性wbc對(duì)ctc(以及其亞細(xì)胞片段)的吞噬作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)化到吞噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，因此吞噬細(xì)胞內(nèi)的dna、rna、蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂質(zhì)的量會(huì)比非吞噬細(xì)胞中的高。從而，吞噬細(xì)胞與非吞噬細(xì)胞之間的這些成分的量和譜的比較被用作癌癥存在的指示。
在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種用于診斷在個(gè)體中存在癌癥細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟：從來自個(gè)體的血液吞噬細(xì)胞中獲得第一表達(dá)譜(表達(dá)譜，表達(dá)曲線)，從來自該個(gè)體的血液非吞噬細(xì)胞中獲得第二表達(dá)譜，比較第一和第二表達(dá)譜，識(shí)別對(duì)第一表達(dá)譜特異的一種或多種標(biāo)記物的差異表達(dá)，以及將對(duì)第一表達(dá)譜特異的一種或多種標(biāo)記物的差異表達(dá)與個(gè)體中存在癌癥細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。
在某些示例性的實(shí)施方式中，提供了一種用于在具有癌癥的個(gè)體中識(shí)別腫瘤特異性標(biāo)志的方法。該方法包括以下步驟：從來自具有癌癥的個(gè)體的血液吞噬細(xì)胞中獲得第一表達(dá)譜，從來自具有癌癥的個(gè)體的血液非吞噬細(xì)胞中獲得第二表達(dá)譜，比較第一和第二表達(dá)譜，識(shí)別對(duì)第一表達(dá)譜特異的兩種或多種標(biāo)記物的差異表達(dá)，并使兩種或多種標(biāo)記物特異性的差異表達(dá)與具有癌癥的個(gè)體中的腫瘤特異性標(biāo)志相關(guān)聯(lián)。
在某些示例性實(shí)施方式中，提供了一種用于診斷個(gè)體中癌癥細(xì)胞的存在的方法，包括以下步驟：從來自個(gè)體的血液吞噬細(xì)胞中獲得第一表達(dá)譜，以及從來自個(gè)體的血液非吞噬細(xì)胞中獲得第二表達(dá)譜。該方法包括以下步驟：比較第一和第二表達(dá)譜，識(shí)別對(duì)第一表達(dá)譜特異的循環(huán)腫瘤細(xì)胞或其亞細(xì)胞片段的存在，并將循環(huán)腫瘤細(xì)胞或其亞細(xì)胞片段的存在與個(gè)體中癌癥細(xì)胞的存在相關(guān)聯(lián)。在某些方面，相對(duì)于第二表達(dá)譜，某個(gè)標(biāo)記物在第一表達(dá)譜中量的增加表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞或它的亞細(xì)胞片段的存在。
在某些示例性實(shí)施方式中并參照?qǐng)D4-圖6，提供了一種用于診斷個(gè)體中癌癥細(xì)胞的存在的方法，包括以下步驟：從個(gè)體中分離吞噬細(xì)胞群，以及將2n吞噬細(xì)胞與>2n吞噬細(xì)胞分開。該方法包括以下步驟：從2n吞噬細(xì)胞中獲得第一表達(dá)譜，從>2n吞噬細(xì)胞中獲得第二表達(dá)譜，比較第一和第二表達(dá)譜，以及識(shí)別對(duì)第一表達(dá)譜特異的一種或多種標(biāo)記物的差異表達(dá)。該方法還包括將對(duì)第一表達(dá)譜特異的一種或多種標(biāo)記物的差異表達(dá)與個(gè)體中癌癥細(xì)胞的存在相關(guān)聯(lián)的步驟。
在這里描述的方法的某些方面中，標(biāo)記物包括dna、rna、微小rna(例如，對(duì)應(yīng)于癌基因、致癌基因、抑制基因或它們的任何組合)、蛋白質(zhì)(例如，由癌基因、致癌基因、抑制基因或它們的任何組合編碼的蛋白或多肽)、脂質(zhì)、碳水化合物和/或它們的任何組合。在某些方面，血液吞噬細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜酸粒性細(xì)胞、泡沫細(xì)胞或它們的任何組合。在某些方面，血液非吞噬細(xì)胞是t細(xì)胞、b細(xì)胞、裸細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或它們的任何組合。在其它方面，血液吞噬細(xì)胞和血液非吞噬細(xì)胞利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法如抗體從全血中分離。在其它方面，血液吞噬細(xì)胞和血液非吞噬細(xì)胞利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法如熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(facs)從全血細(xì)胞的種群中分離。在其它方面，血液吞噬細(xì)胞和血液非吞噬細(xì)胞利用結(jié)合至在wbc群的質(zhì)膜上表達(dá)的分子受體的配體來分開。在其它方面，血液吞噬細(xì)胞和血液非吞噬細(xì)胞通過一種或多種方法包括過濾、基于梯度的離心、洗脫、微流體(微流體技術(shù))等來分離。在某些方面，個(gè)體患有一種或多種隱秘(隱性)(例如，潛伏的、未診斷的、隱藏的或隱蔽的)癌癥、先前診斷的原發(fā)癌癥和轉(zhuǎn)移癌癥。在某些方面，該方法包括將一種或多種標(biāo)記物的存在同癌癥治療的效能相關(guān)聯(lián)的步驟。
在某些示例性實(shí)施方式中，通過比較吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的表達(dá)譜以確定感染原或除了癌癥外的疾病的標(biāo)記物標(biāo)志的差異表達(dá)，上述方法被用來檢測(cè)、識(shí)別或診斷感染源或除癌癥外的疾病的存在。在又一方面，這里描述的一種或多種方法被用于檢測(cè)病原體(如病毒、細(xì)菌、立克次氏體、原生動(dòng)物、寄生蟲、真菌、酵母等)和其它疾病或病狀(如阿爾茨海默氏病、癡呆、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、遺傳性障礙、骨病、胃腸疾病、朊蛋白疾病、和感染性疾病)的dna、rna、蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂質(zhì)譜。
在此處描述的方法的某些方面中，標(biāo)記物包括病原體dna、病原體rna、病原體蛋白、病原體多肽、病原體脂質(zhì)以及它們的任何組合。在某些方面，感染原是病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、感染性蛋白以及它們的任何組合。在某些方面，該方法包括使一種或多種標(biāo)記物的存在與病原體治療的效能相關(guān)聯(lián)的步驟。
因此本文描述的方法和組合物可以在患者的血樣中容易地識(shí)別腫瘤特異性標(biāo)志，而無需依賴于種群衍生的平均標(biāo)志譜和由“健康”對(duì)照獲得的值。具體地，本處描述的方法和組合物可以容易且經(jīng)濟(jì)地：(i)在病理標(biāo)志或癥狀表現(xiàn)之前在個(gè)體中識(shí)別腫瘤(原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性損傷)的存在；(ii)在懷疑患有癌癥的個(gè)體中識(shí)別腫瘤(原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性損傷)的存在；和/或(iii)在經(jīng)受/伴隨各種治療的個(gè)體中檢測(cè)腫瘤(原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性損傷)復(fù)發(fā)。
因此，本處所描述的方法和組合物(i)提供癌癥的非侵入性篩查；(ii)允許診斷腫瘤，特別是在最早的時(shí)間點(diǎn)；(iii)在腫瘤進(jìn)程的通路對(duì)更早的點(diǎn)進(jìn)行更有意義的干預(yù)，從而防止轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展；(iv)監(jiān)測(cè)常規(guī)或?qū)嶒?yàn)性治療的早期反應(yīng)；(v)預(yù)測(cè)常規(guī)或?qū)嶒?yàn)性治療的反應(yīng)；(vi)通過允許快速識(shí)別副作用可能不會(huì)被期待的益處平衡的無效治療來促進(jìn)有效治療的選擇；(vii)使患者的不適和失能最小化；(viii)使得腫瘤的檢測(cè)、診斷、和治療密切結(jié)合(例如，抗癌癥治療的個(gè)性化)；(ix)提供腫瘤類型和階段的預(yù)測(cè)和早期檢測(cè)；(x)提供治療選擇；(xi)確定腫瘤是否是轉(zhuǎn)移性的；(xii)提供用于監(jiān)測(cè)疾病的方法；和(xii)用于疾病預(yù)后的方法。
附圖說明
本專利或申請(qǐng)包含至少一幅以彩色繪制的附圖。通過請(qǐng)求官方和交付必要費(fèi)用后可以提供本專利或本專利申請(qǐng)公開的帶有彩色附圖的副本。通過以下結(jié)合附圖的示例性實(shí)施方式的詳細(xì)描述，本發(fā)明的前述和其它特征以及優(yōu)點(diǎn)將被更全面地理解，其中：
圖1示意性地示出了提出的通路，該通路在吞噬活的ctc、凋亡的ctc、破碎的ctc、由活的和/或凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤dna、rna、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)后，通過吞噬細(xì)胞獲得腫瘤特異性dna、rna、蛋白和/或脂質(zhì)標(biāo)志。應(yīng)當(dāng)注意，僅吞噬細(xì)胞(并且不是非吞噬細(xì)胞)獲得腫瘤標(biāo)志。
圖2示意性地示出了用于識(shí)別在患有卵巢癌(oc)患者的吞噬細(xì)胞中或由其表達(dá)的癌癥標(biāo)志的分析方法。
圖3示意性地示出了本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式的總體流程圖。
圖4示意性地示出了提出的通路，該通路在吞噬活的ctc、凋亡ctc、破碎的ctc、由活的和/或凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤dna、rna、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)后，通過血液吞噬細(xì)胞獲得腫瘤特異性dna、rna、蛋白和/或脂質(zhì)標(biāo)志。應(yīng)當(dāng)注意，吞噬作用后的吞噬細(xì)胞的dna含量為>2n。
圖5示意性地示出了在攜帶bc的動(dòng)物中識(shí)別乳腺癌(bc)標(biāo)志的分析途徑。
圖6示意性地示出了本發(fā)明的方法的另一實(shí)施方式的總體流程圖。
圖7示出了從lncap和llc1細(xì)胞分離的總rna的凝膠電泳分析。
圖8列出了從小鼠白細(xì)胞(wbc)獲得的rna的產(chǎn)率和質(zhì)量。*＝每組6個(gè)細(xì)胞制備的平均值。
圖9描述了這樣的陣列，該陣列示出了7個(gè)在來自lncap(人前列腺癌)腫瘤攜帶裸小鼠的嗜中性粒細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)的基因。(a)lncap腫瘤。(b)由攜帶lncap腫瘤的裸小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nt)。(c)由攜帶lncap腫瘤的裸小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)由非腫瘤攜帶裸小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)中和來自腫瘤攜帶小鼠的巨噬細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶的小鼠的巨噬細(xì)胞(d)和非吞噬t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在nt中的表達(dá)比在nn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖10描述了這樣的陣列，該陣列示出了3個(gè)在來自lncap(人前列腺癌)腫瘤攜帶裸小鼠的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)的、癌癥相關(guān)的基因。(a)lncap腫瘤。(b)由攜帶lncap腫瘤的裸小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mt)。(c)由攜帶lncap腫瘤的裸小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)由非腫瘤攜帶的裸小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)中和來自腫瘤攜帶小鼠的巨噬細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶的小鼠的巨噬細(xì)胞(d)和非吞噬的t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在mt中的表達(dá)比在mn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖11描述了這樣的陣列，該陣列示出了34個(gè)在來自ls174t(人結(jié)腸癌)腫瘤攜帶的裸小鼠的嗜中性粒細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)ls174t腫瘤。(b)從攜帶ls174t腫瘤的裸小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nt)。(c)從攜帶ls174腫瘤的裸小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)從非腫瘤攜帶的裸小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)和來自腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(d)和非吞噬t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在nt中的表達(dá)比在nn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖12描述了這樣的陣列，該陣列示出了3個(gè)在來自ls174t(人結(jié)腸癌)腫瘤攜帶裸小鼠的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)ls174t腫瘤。(b)從攜帶ls174t腫瘤的裸小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mt)。(c)從攜帶ls174腫瘤的裸小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)從非腫瘤攜帶的裸小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)和來自腫瘤攜帶小鼠的巨噬細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶小鼠的巨噬細(xì)胞(d)和非吞噬t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在mt中的表達(dá)比在mn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖13描述了這樣的陣列，該陣列示出了5個(gè)在來自llc1(小鼠轉(zhuǎn)移肺癌)腫瘤攜帶c57/b1小鼠的嗜中性粒細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)llc1腫瘤。(b)從攜帶llc1腫瘤的c57/b1小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nt)。(c)從攜帶llc1腫瘤的c57/b1小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)從非腫瘤攜帶的c57/b1小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)和來自腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(d)和非吞噬t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在nt中的表達(dá)比在nn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖14描述了這樣的陣列，該陣列示出了2個(gè)在來自llc1(小鼠轉(zhuǎn)移肺癌)腫瘤攜帶c57/b1小鼠的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)llc1腫瘤。(b)從攜帶llc1腫瘤的c57/b1小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mt)。(c)從攜帶llc1腫瘤的c57/b1小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)從非腫瘤攜帶的c57/b1小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)和來自腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(d)和非吞噬t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在mt中的表達(dá)比在mn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖15描述了這樣的陣列，該陣列示出了2個(gè)在來自b16f10(小鼠轉(zhuǎn)移黑色素瘤)腫瘤攜帶的c57/b1小鼠的嗜中性粒細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)b16f10腫瘤。(b)從攜帶b16f10腫瘤的c57/b1小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nt)。(c)從攜帶b16f10腫瘤的c57/b1小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)從非腫瘤攜帶的c57/b1小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nt)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)和來自腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶小鼠的嗜中性粒細(xì)胞(d)和非吞噬t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在nt中的表達(dá)比在nn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖16描述了這樣的陣列，該陣列示出了1個(gè)在來自b16f10(小鼠轉(zhuǎn)移黑色素瘤)腫瘤攜帶的c57/b1小鼠的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)b16f10腫瘤。(b)從攜帶b16f10腫瘤的c57/b1小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mt)。(c)從攜帶b16f10腫瘤的c57/b1小鼠獲得的t細(xì)胞(tt)。(d)從非腫瘤攜帶的c57/b1小鼠獲得的巨噬細(xì)胞
(mn)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(a)和來自腫瘤攜帶小鼠的巨噬細(xì)胞(b)中表達(dá)，并且在來自非腫瘤攜帶小鼠的巨噬細(xì)胞(d)和非吞噬的t細(xì)胞(c)中最低限度地表達(dá)。在mt中的表達(dá)比在mn和tt中的表達(dá)≥2倍。
圖17描述了這樣的陣列，該陣列示出了5個(gè)在來自患有頭頸癌(鱗狀細(xì)胞癌)的患者的嗜中性粒細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)正常組織(皮膚)活檢。(b)腫瘤組織活檢。(c)從患者血液獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nt)。(d)從患者血液獲得的t細(xì)胞(tt)。圈出的標(biāo)志在腫瘤細(xì)胞(b)和來自患者血液的嗜中性粒細(xì)胞(c)中表達(dá)，并在正常皮膚(a)或非吞噬t細(xì)胞(d)中最低限度地表達(dá)或沒有表達(dá)。在nt中的表達(dá)比在tt和皮膚中的表達(dá)≥2倍。
圖18描述了這樣的陣列，該陣列示出了23個(gè)在來自患有卵巢癌(腺癌)的患者的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)的上調(diào)(≥2倍)的、癌癥相關(guān)基因。(a)從患者血液獲得的巨噬細(xì)胞(mt)。(b)從患者血液獲得的t細(xì)胞(tt)。圈出的標(biāo)志在來自患者的巨噬細(xì)胞(a)中表達(dá)并在非吞噬t細(xì)胞(b)中最低限度地表達(dá)。在mt中的表達(dá)比在tt中的表達(dá)≥2倍。
圖19描述了一種用于在吞噬細(xì)胞中識(shí)別腫瘤標(biāo)志的方法。在該實(shí)例中，與來自同一動(dòng)物的t細(xì)胞(tt)相比，對(duì)在來自腫瘤攜帶動(dòng)物的巨噬細(xì)胞(mt)中的癌癥相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行量化，并且識(shí)別過表達(dá)>2倍的那些。接著，對(duì)mt中的所有表達(dá)的基因的強(qiáng)度進(jìn)行量化并與從非腫瘤攜帶動(dòng)物的巨噬細(xì)胞(mnt)中的那些進(jìn)行比較，并且識(shí)別了過表達(dá)>2倍的基因。選擇兩個(gè)列表共有的基因并與由同一腫瘤表達(dá)的那些基因(陰影區(qū)域(由腫瘤攜帶動(dòng)物的巨噬細(xì)胞表達(dá)的腫瘤標(biāo)志))相比較。
圖20描述了在(a)從攜帶lncap人前列腺腫瘤的裸小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(mlncap)和從相同動(dòng)物獲得的t細(xì)胞(t細(xì)胞lncap)，(b)mlncap和從非腫瘤攜帶小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(m非腫瘤)，(c)從攜帶lncap人前列腺腫瘤的裸小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞(nlncap)和從相同動(dòng)物獲得的t細(xì)胞(t細(xì)胞lncap)，以及(d)nlncap和從非腫瘤攜帶小鼠獲得的巨噬細(xì)胞(n非腫瘤)中的基因表達(dá)強(qiáng)度比較。以紅色表示的基因過表達(dá)>2倍；以綠色表示的那些基因向下表達(dá)>2倍。
圖21列出了吞噬的嗜中性粒細(xì)胞(n)和巨噬細(xì)胞(m)內(nèi)的癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。
圖22列出了與非吞噬t細(xì)胞相比，在患有卵巢癌的患者的吞噬巨噬細(xì)胞中上調(diào)(>2倍)的癌癥相關(guān)基因。*＝致癌基因。
圖23描述了從小鼠wbc獲得的蛋白樣品(5.9μg)的(10％)sds凝膠電泳。
圖24描述了從腫瘤攜帶小鼠獲得的t細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(m/m)中的tag-72和psa表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析，表明僅在吞噬細(xì)胞中存在標(biāo)志。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及一種這樣的方法，該方法基于吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物(含量)和/或表達(dá)譜而提供與疾病、感染原和身體狀況相關(guān)的患者特異性表達(dá)譜。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜與對(duì)于特定疾病狀態(tài)或病癥(狀況)的已知標(biāo)記物進(jìn)行比較，從而檢測(cè)和/或診斷特定的疾病狀態(tài)或病癥。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜與來自單一患者的血液的非吞噬細(xì)胞的內(nèi)容物和/或表達(dá)譜相比較。從吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜減去來自非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜產(chǎn)生了代表僅個(gè)體的疾病狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜。
根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方式，獲得來自個(gè)體的吞噬細(xì)胞群，并且將來自dna含量大于2n的群的吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜與來自dna含量為2n的同一群體的吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜相比較。根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方式，獲得來自個(gè)體的吞噬細(xì)胞群，并將來自rna、蛋白、碳水化合物和/或脂質(zhì)含量大于正常且dna指數(shù)大于1的群的吞噬細(xì)胞的表達(dá)譜與來自rna、蛋白、碳水化合物和/或脂質(zhì)含量正常和/或dna指數(shù)為1的相同群的吞噬細(xì)胞的表達(dá)譜相比較。
這樣的患者特異性表達(dá)譜消除了對(duì)特定疾病或感染原的種群衍生的平均標(biāo)志譜的依賴，這可能將誤差引入到個(gè)體特定疾病的檢測(cè)或診斷中。本發(fā)明的用于疾病狀態(tài)的這樣的患者特異性表達(dá)譜使得對(duì)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)、診斷和治療以個(gè)性化。
參考圖1-圖3并根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，對(duì)從攜帶大約3周齡的人皮下(s.c.)腫瘤(前列腺lncap腺癌或ls174t結(jié)腸腺癌)或小鼠腫瘤(b16f10轉(zhuǎn)移黑色素瘤，靜脈內(nèi)給予的，或llc1肺癌，皮下注射)的小鼠獲得的吞噬和非吞噬wbc的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較。結(jié)果表明從這些腫瘤攜帶小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)各種致癌基因和其它癌癥相關(guān)基因標(biāo)志，這些標(biāo)志還在每種相應(yīng)的腫瘤中表達(dá)。參見圖9-圖16和圖19-圖21。這些癌癥相關(guān)的基因和致癌基因(如，erbb2，jun，fos等)沒有被(i)從腫瘤攜帶小鼠分離的非吞噬t細(xì)胞，和(ii)從非腫瘤攜帶小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)或被最低限度地表達(dá)。并且，僅來自腫瘤攜帶小鼠的吞噬細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)表達(dá)腫瘤特異性蛋白。參見圖23和圖24。小鼠的血液中的ctc和/或腫瘤特異性dna和/或蛋白被吞噬，并且某些腫瘤細(xì)胞dna和它的腫瘤特異性突變和基因類似地通過轉(zhuǎn)染(不受理論約束)到正常的吞噬細(xì)胞dna中而整合，轉(zhuǎn)錄為rna，并翻譯成蛋白。
參考圖1-圖3并根據(jù)本發(fā)明的某些示例性實(shí)施方式，還比較了從患有頭頸腫瘤或卵巢癌的患者獲得的吞噬和非吞噬wbc的基因表達(dá)譜。結(jié)果表明從這些患者獲得的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)各種致癌基因和其它癌癥相關(guān)標(biāo)志，其還在每種相應(yīng)的腫瘤中表達(dá)。參見圖17-圖18和圖22。這些癌癥相關(guān)基因和致癌基因沒有被從同一個(gè)體患者分離的非吞噬t細(xì)胞中表達(dá)或最低限度地表達(dá)?；颊哐褐械腸tc和/或腫瘤特異性dna和rna被吞噬并且某些腫瘤細(xì)胞dna和/或rna，和它的腫瘤特異性突變和基因類似地通過轉(zhuǎn)染(不受理論約束)到正常的吞噬細(xì)胞dna中而整合，轉(zhuǎn)錄為rna，并翻譯成蛋白。
參考圖4-圖6并根據(jù)某些示例性實(shí)施方式，由(1)dna含量為>2n(pn>2)或(2)rna、蛋白、碳水化合物和/或脂質(zhì)含量大于正常，即具有吞噬的ctc和/或它們的亞細(xì)胞片段或dna/rna/脂質(zhì)(即，腫瘤特異性標(biāo)志或其它疾病特異性標(biāo)志)和/或具有大于1的dna指數(shù)的血液或一種或多種其它生物樣品(如尿、糞便、唾液、淋巴、腦脊液等)獲得的吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的dna(核的和/或線粒體的)、rna、微小rna、蛋白質(zhì)、和/或脂質(zhì)表達(dá)譜的定量分析，以及它們與(1)dna含量為2n(pn＝2)，或rna、蛋白、碳水化合物和/或脂質(zhì)含量正常，即具有未吞噬的ctc和/或它們的亞細(xì)胞片段并且具有1的dna指數(shù)的相同吞噬細(xì)胞群(如巨噬細(xì)胞)的比較，提供了一種檢測(cè)pn>2細(xì)胞中的腫瘤特異性(或其它疾病特異性)標(biāo)志(患者特異性標(biāo)志)的方法，該標(biāo)志在pn＝2細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(患者特異性噪聲)。參考圖6，從如圖5所示的pn>2減去pn＝2的dna、rna、蛋白、和/或脂質(zhì)譜提供了一種(例如，在一種或多種基因組的、蛋白質(zhì)組的、代謝物組的、糖組的、糖蛋白組的、脂質(zhì)組的和/或脂蛋白組的分析后)在患有癌癥(和/或其它疾病和/或身體狀況)的動(dòng)物和/或人的血樣(或一種或多種生物樣品如其它體液)中識(shí)別腫瘤特異性(和/或疾病特異性和/或病癥特異性)標(biāo)志并預(yù)示隱秘腫瘤和/或其它疾病和/或其它病癥的存在的方法。與使吞噬細(xì)胞的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組、糖組、糖蛋白組、脂質(zhì)組和/或脂蛋白組的圖譜與非吞噬細(xì)胞的那些相比的上面描述的方法不同，根據(jù)本發(fā)明的該分析檢測(cè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是：(i)它利用單個(gè)吞噬細(xì)胞亞群作為“腫瘤特異性”(例如，pn>2巨噬細(xì)胞)和“正常非特異性”(例如，pn＝2巨噬細(xì)胞)標(biāo)志的來源，即兩種共享相同的基線基因型；以及(ii)標(biāo)志獲取細(xì)胞(例如，pn>2嗜中性粒細(xì)胞)并不被沒有吞噬并因此沒有獲取的死亡ctc和/或其片段(例如，pn＝2嗜中性粒細(xì)胞)的那些稀釋。
參考圖4-圖6并根據(jù)某些示例性實(shí)施方式，由作為吞噬或內(nèi)化其它活的、垂死的或死亡的(例如，凋亡的或壞死的)細(xì)胞、凋亡小體、核、微囊、外泌體、核小體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)果的胞內(nèi)內(nèi)容物大于具有正常細(xì)胞內(nèi)容物(pnic)的相同吞噬細(xì)胞群(如吞噬細(xì)胞)的血液或一種或多種其它生物樣品或體液(如尿、糞便、唾液、淋巴、腦脊液等)獲得的吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的定量分析，即，不具有吞噬任何上述細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片(患者特異噪聲)的細(xì)胞，提供了一種在具有增加的胞內(nèi)內(nèi)容物的吞噬細(xì)胞(piic)中檢測(cè)腫瘤特異性(或其它疾病特異性或其它病癥特異性)標(biāo)志的方法，這些標(biāo)志在具有正常胞內(nèi)內(nèi)容物的吞噬細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(患者特異性噪聲)。參考圖6，從如圖5所示的piic減去pnic的dna、rna、蛋白和/或脂質(zhì)譜提供了一種在患有癌癥或其它疾病的動(dòng)物的血液樣品(或一種或多種其它生物樣品如其它體液)中識(shí)別(例如，在一種或多種基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組、糖組、糖蛋白組、脂質(zhì)組、和/或脂蛋白組的分析后)腫瘤特異性(和/或疾病特異性)標(biāo)志并預(yù)示隱秘腫瘤和/或其它疾病的存在的方法。與使吞噬細(xì)胞的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組、糖組、糖蛋白組、脂質(zhì)組和/或脂蛋白組的譜與非吞噬細(xì)胞的那些相比的上面描述的方法不同，根據(jù)本發(fā)明的該分析檢測(cè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是：(i)它利用單一的吞噬細(xì)胞亞群作為“疾病特異性”(如piic巨噬細(xì)胞)和“正常非特異性”(如pnic巨噬細(xì)胞)標(biāo)志的來源，即它們共享相同的基線基因型；以及(ii)標(biāo)志獲取細(xì)胞(例如，piic嗜中性粒細(xì)胞)不被沒有吞噬并因此沒有獲取的死亡ctc和/或其片段(例如，pnic嗜中性粒細(xì)胞)的那些稀釋。
這里描述的方法(i)具有高特異性、敏感性、和準(zhǔn)確性并應(yīng)當(dāng)能在血液樣品(或其它生物樣品如體液)中檢測(cè)腫瘤特異性(和/或其它疾病特異性)和正常非特異性標(biāo)志的存在；以及(ii)消除由于基因表達(dá)中的內(nèi)在(如年齡、性別、種族背景、健康狀態(tài)等)和短暫變化引起的在個(gè)體中已知出現(xiàn)的“基線的不平坦”。因此，在某些方面，本發(fā)明提供了非侵入性分析，用于在患者中早期檢測(cè)隱秘的原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤(和/或一種或多種其它疾病或病癥)，即，在可以通過常規(guī)成像技術(shù)(如pet、mri、ct等)診斷疾病之前，并且因此提供了一種用于相對(duì)于需要的改善的決策和用于對(duì)具有癌癥的個(gè)體干預(yù)、防止和治療的策略的基礎(chǔ)。
如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“腫瘤特異性標(biāo)記物”旨在包括但不限于，一種或多種細(xì)胞成分如一個(gè)或多個(gè)dna序列、一個(gè)或多個(gè)rna序列、一種或多種蛋白、一種或多種多肽、一種或多種脂質(zhì)等。在某些方面，腫瘤特異性標(biāo)記物存在于一種或多種wbc，例如，嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞中。
如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥相關(guān)基因”是指這樣的基因，例如癌基因、致癌基因和/或腫瘤抑制基因，其在癌細(xì)胞(例如wbc如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、t細(xì)胞等)中改變表達(dá)(例如，當(dāng)與非癌細(xì)胞相比增加表達(dá)或降低表達(dá))。許多癌癥相關(guān)基因在本領(lǐng)域中是已知的。癌癥相關(guān)基因包括，例如，但不限于，erbb2、jun、rb1、supp1、mdm2、map2k1、pdgfb、plaur、fgr、mycl1、blym、nras1、pe1、ski、trk、abl2、mycn、rab1、rel、ralb、lco、erbb4、raf1、ect2、kit、fgf5、gro1、gro2、gro3、fms、pim、krasip、fyn、myb、ros1、mas1、rala、myclk1、gli3、araf2、met、braf、mos、lyn、mybl1、myc、ovc、vav2、bmi1、ret、hras、spi1、rela、sea、ems1、ets1、kras2、erbb3、gli、flt、brca2、rbi、fos、akt1、elk2、fes、maf、tp53、crk、erba1、nf1、evi2、erbbb2、int4、brca1、yes1、jund、junb、mel、lpsa、vav1、akt2、fosb、rras、hkr1、hkr2、erbal2、src、mybl2、ets2、erg、araf1、yuasa、hs2、int3、sno、rmyc、bmyc、hrasp、tc21、tim、pti-1、jak、cea家族中的一種或多種成員(參見，例如zhouetal.(2001)gene264:105)、psa、muc-16等。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指各種類型的惡性贅生物，它們中的大多數(shù)可以侵入周圍組織，并且可以轉(zhuǎn)移至不同部位(參見，例如pdrmedicaldictionary，第一版(1995)，將其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文用于所有目的)。術(shù)語(yǔ)“贅生物”和“腫瘤”是指通過比正常組織更快細(xì)胞增殖而生長(zhǎng)并且在去除起始的增殖刺激后繼續(xù)生長(zhǎng)的異常組織。同樣，這樣的異常組織顯示出部分或完全缺少結(jié)構(gòu)組織和與可能是良性的(即，良性瘤)或惡性的(即，惡性瘤)的正常組織的功能協(xié)調(diào)。
癌癥的總體分類的實(shí)例包括，但不限于，惡瘤(癌)(即，來自上皮細(xì)胞的惡性瘤，如乳腺、前列腺、肺和結(jié)腸癌的普通形式)、肉癌(即，來自結(jié)締組織或間葉細(xì)胞的惡性瘤)、淋巴瘤(即，來自造血細(xì)胞的惡變)、白血病(即，來自造血細(xì)胞的惡變)、胚細(xì)胞瘤(即，來自全能細(xì)胞的瘤)。在成年人中，最通常在睪丸和卵巢中發(fā)現(xiàn)；在胎兒、嬰兒和幼童中，最通常在身體中線，尤其是尾骨的尖端發(fā)現(xiàn))，產(chǎn)孢腫瘤(即，類似未成熟或胚胎組織的典型的惡性瘤)等。
旨在被本發(fā)明涵蓋的贅生物的類型的實(shí)例包括但不限于與神經(jīng)組織、血形成組織、乳腺、皮膚、骨、前列腺、卵巢、子宮、宮頸、肝、肺、大腦、喉、膽囊、胰腺、直腸、甲狀旁腺、甲狀腺、腎上腺、免疫系統(tǒng)、頭和頸、結(jié)腸、胃、支氣管，和/或腎的癌癥相關(guān)的那些贅生物。
在某些示例性的實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物被用來檢測(cè)、識(shí)別和/或診斷與胎兒染色體異常(如唐氏綜合癥、自閉癥和相關(guān)的自閉癥譜系障礙(包括但不限于，亞斯普杰氏綜合癥和廣泛發(fā)育障礙-沒有以其它方式明確的)、鐮狀細(xì)胞貧血、地中海貧血等)的存在有關(guān)的障礙，由于在母血中存在胎兒細(xì)胞和dna。這些障礙中的一種或多種的篩查和診斷可以利用此處描述的方法和/或組合物來實(shí)施以檢測(cè)母體血液吞噬細(xì)胞中的一種或多種染色體標(biāo)記，如dna和rna等。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物可以用來通過檢測(cè)在懷孕婦女的血液內(nèi)的胎兒來源的蛋白質(zhì)組的、脂質(zhì)組的和/或基因組的標(biāo)志的存在作為胎兒干細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、胎兒淋巴細(xì)胞、以及已知在母血中循環(huán)的顯著量的無細(xì)胞胎兒核酸來測(cè)試懷孕婦女體內(nèi)的胎兒的性別。根據(jù)此處描述的方法，將吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜與來自懷孕婦女的血液的非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜相比較。從吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜中減去來自非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜形成了代表由孕婦懷有的胎兒的性別的細(xì)胞內(nèi)容物和/或表達(dá)譜。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物可以通過檢測(cè)垂死的/死亡的肌細(xì)胞和/或它的片段(如dna、蛋白等)的存在而被用來檢測(cè)、識(shí)別和/或診斷與患有或有發(fā)展心臟病(如心肌梗塞、慢性心力衰竭、缺血性心臟病、心血管死亡等)風(fēng)險(xiǎn)的受試者的血液內(nèi)蛋白質(zhì)組的和/或基因組的肌細(xì)胞標(biāo)志的存在相關(guān)的障礙。利用此處描述的方法和/或組合物來進(jìn)行這些障礙中的一種或多種的篩查和診斷以在血液吞噬細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物如dna、rna、蛋白質(zhì)等。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物可以用來在具有或有發(fā)展作為冠狀動(dòng)脈狹窄、腹主動(dòng)脈瘤等的結(jié)果的動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的受試者的血液中檢測(cè)、識(shí)別和/或診斷與蛋白的、脂質(zhì)的和/或基因標(biāo)志的存在有關(guān)的障礙。利用此處描述的方法和/或組合物進(jìn)行這些障礙的篩查和診斷以檢測(cè)血液吞噬細(xì)胞內(nèi)的一種或多種標(biāo)記物，如dna、rna、蛋白質(zhì)等。
活檢確認(rèn)排斥，一種用于診斷同種異體移植物排斥的方法，是侵入性的并且易于產(chǎn)生取樣誤差。因此，檢測(cè)用于診斷和管理移植器官排斥的分子生物標(biāo)記的非侵入性分析的發(fā)展通過以下可用于移植受體的管理中：(a)檢測(cè)在排斥前使治療性干預(yù)引起移植物功能障礙的排斥前譜，(b)改善排斥診斷的敏感性和特異性，(c)發(fā)展將改善預(yù)后的新的用于排斥的分類系統(tǒng)，以及(d)為設(shè)計(jì)個(gè)體化的免疫抑制配方提供信息，其在最小化藥物毒性的同時(shí)可以防止排斥。
因此，在某些示例性的實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物通過在血液吞噬細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物，如dna、rna、蛋白等可以在患有經(jīng)受器官移植的受試者的血液內(nèi)用來檢測(cè)、識(shí)別或診斷與蛋白、脂質(zhì)和/或基因標(biāo)志的存在有關(guān)的障礙。
線粒體疾病由線粒體的損傷產(chǎn)生。接著細(xì)胞損傷并且甚至細(xì)胞死亡。線粒體的疾病似乎導(dǎo)致腦、心臟、肝、骨骼肌、腎的細(xì)胞和內(nèi)分泌和呼吸系統(tǒng)的主要損傷以及糖尿病、呼吸并發(fā)癥、抽搐、阿爾茨海默病、視覺/聽覺問題、乳酸性酸中毒、發(fā)育遲緩、對(duì)感染的敏感度，和癌癥。
因此，在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物通過在血液吞噬細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種基因組、線粒體相關(guān)的dna標(biāo)記物，可以被用于篩查、診斷和/或檢測(cè)線粒體疾病。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物通過在血液吞噬細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物，如dna、rna、蛋白等，可以被用于篩查、診斷和/或檢測(cè)阿爾茨海默氏病和/或癡呆。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)是一種影響各種器官和系統(tǒng)的復(fù)雜自體免疫障礙。因此，在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物通過在血液吞噬細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物，如dna、rna、脂質(zhì)、蛋白等可以被用于篩查、診斷和/或檢測(cè)sle。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物通過在血液吞噬細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物，如dna、rna、蛋白質(zhì)等可以被用于篩查和/檢測(cè)可用于發(fā)展治療的基因組和/或蛋白質(zhì)組的標(biāo)志和/或成像分子。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種方法和/或組合物通過在血液吞噬細(xì)胞中檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物，如dna、rna、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等可以被用于篩查、診斷和/或檢測(cè)基因組的、蛋白質(zhì)組的和/或脂質(zhì)組的標(biāo)志改變，所述標(biāo)志可用于檢測(cè)由于一種或多種外在或內(nèi)在損傷(如，臟彈暴露、輻射暴露、化學(xué)物質(zhì)暴露、放射療法、放射藥物給予、治療性分子暴露、氡暴露、石棉暴露、污染暴露等)的結(jié)果的疾病和病狀。
如此處所采用的，術(shù)語(yǔ)“生物體”包括但不限于，人個(gè)體、非人靈長(zhǎng)類、牛、馬、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、小鼠、大鼠、沙鼠、青蛙、蟾蜍和它們的轉(zhuǎn)基因物種。術(shù)語(yǔ)“生物體”進(jìn)一步包括病原生物，包括但不限于，病原如寄生蟲、酵母細(xì)胞、酵母四分體、酵母群落、細(xì)菌、細(xì)菌菌落、病毒粒子、病毒顆粒、病毒樣顆粒和/或這些中的任何的培養(yǎng)物等。
在某些示例性實(shí)施方式中，此處描述的分析可以用于檢測(cè)感染原和/或診斷與通過感染原的細(xì)胞、組織、器官等的感染相關(guān)的障礙。在某些方面，利用此處描述的方法和/或組合物進(jìn)行感染原的檢測(cè)和/或與感染相關(guān)的障礙的診斷，以從一種或多種感染原中檢測(cè)一種或多種感染原標(biāo)記物，如dna、rna、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等。
如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“感染原”包括，但不限于，病原生物體如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、感染性蛋白等。
病毒包括但不限于，dna或rna動(dòng)物病毒。如此處使用的，rna病毒包括但不限于，病毒家族如小核糖核酸病毒屬(picornaviridae)(如，脊髓灰質(zhì)炎病毒)、呼腸弧病毒屬(reoviridae)(如，輪狀病毒)、披膜病毒屬(togaviridae)(如，腦炎病毒、黃熱病病毒、風(fēng)疹病毒)、正粘病毒屬(orthomyxoviridae)(如，流感病毒)、副粘病毒屬(如，呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒)、彈狀病毒屬(如，狂犬病病毒)、冠狀病毒屬、布尼亞病毒屬、黃病毒屬、線狀病毒屬、舞臺(tái)病毒屬、布尼亞病毒屬和逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(如，人t細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒(htlv)、人免疫缺陷病毒(hiv))。如此處采用的，dna病毒包括但不限于病毒家族如乳多空病毒屬(如，乳頭瘤病毒)、腺病毒屬(如，腺病毒)，皰疹病毒屬(如，單純皰疹病毒)，和痘病毒屬(如，天花病毒)。
細(xì)菌包括但不限于，革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、耐酸菌等。
如此處所使用的，革蘭氏陽(yáng)性菌包括但不限于，actinomedurae、衣布放線菌、炭疽桿菌、蠟狀芽胞桿菌、肉毒梭菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、科里氏桿菌、糞腸球菌、單核細(xì)胞增生桿菌、諾卡氏菌、瘡皰丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、變異鏈球菌、肺炎鏈球菌等。
如此處所使用的，革蘭氏陰性菌包括但不限于，貓阿菲波菌、擬桿菌、桿菌狀巴爾通氏體、百日咳桿菌、伯氏疏螺旋體、回歸熱疏螺旋體、布魯氏菌、肉芽腫鞘桿菌、彎曲桿菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、陰道加德納氏菌、埃及嗜血菌、杜氏嗜血菌、流感嗜血菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、問號(hào)鉤端螺旋體、腦膜炎奈瑟氏球菌、牙齦卟啉單胞菌、providenciasturti、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、沙雷氏菌、波伊德氏志賀氏菌、念珠狀鏈桿菌、釀膿鏈球菌、蒼白密螺旋體、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、鼠疫耶爾森氏菌等。
如此處所使用的，耐酸菌包括但不限于，鳥分枝桿菌、麻分分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌等。
如此處所使用的，不屬于其它三類的其它細(xì)菌包括但不限于，漢氏巴爾通氏體、鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體、伯氏考克斯氏體、肺炎支原體、螨立克次氏體、普氏立克次氏體、立氏立克次氏體、恙蟲熱立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體、解脲尿支原體、肺炎雙球菌、恰菲埃里希氏體、屎腸球菌、腦膜炎球菌等。
如此處所使用的，真菌包括但不限于、曲霉菌、念珠菌、白念珠菌、粗球孢子菌、隱球菌、以及它們的組合。
如此處所使用的，寄生微生物包括但不限于，結(jié)腸小袋纖毛蟲、隱性芽胞蟲菌、卡晏環(huán)孢子球蟲、腦炎原蟲、溶組織內(nèi)阿米巴、感染腸微孢子蟲(畢氏腸微孢子蟲)、藍(lán)氏賈第蟲、利什曼原蟲、瘧原蟲、剛地弓形蟲、錐體蟲、梯形變形蟲等。
如此處所使用的，寄生蟲包括蟲(如，蠕蟲)，特別是腸內(nèi)寄生蟲，包括但不限于，線蟲類(蛔蟲類，如，鞭蟲、鉤蟲、蟯蟲、蛔蟲、血絲蟲等)、絳蟲類類(如，絳蟲)。
如此處所使用的，感染性蛋白包括朊病毒。由朊病毒引起的障礙包括但不限于，人類障礙如克雅氏病(cjd)(包括如醫(yī)原性克雅氏病(icjd)、變異克雅氏病(vcjd)、家族型克雅氏病(fcjd)、和偶發(fā)性克雅氏病(scjd)、gerstmann-
在某些示例性實(shí)施方式中，提供了在生物樣品中檢測(cè)標(biāo)記物如核酸序列(如dna、rna等)、蛋白、多肽、脂質(zhì)、多糖等的方法。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”旨在包括dna分子(如，cdna或基因組dna)和rna分子(如，mrna)以及使用核苷酸類似物生成的dna或rna的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括含有堿性氨基和酸性羧基的有機(jī)化合物。包括在該術(shù)語(yǔ)內(nèi)的為天然氨基酸(如，l-氨基酸)、修飾氨基酸和稀有氨基酸(如，d-氨基酸和β-氨基酸)、以及已知在生物體以自由或結(jié)合形式存在但通常并不存在于蛋白中的氨基酸。存在天然蛋白氨的基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、和纈氨酸。天然非蛋白氨基酸包括精氨基琥珀酸、瓜氨酸、半胱亞磺酸、3,4-二羥基苯丙氨酸、同型半胱氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、3-單碘化酪氨酸、3,5-二碘化酪氨酸、3,5,5-三碘化甲腺原氨酸、和3,3’,5,5’-四碘甲腺原氨酸。修飾氨基酸和稀有氨基酸包括d-氨基酸、羥賴氨酸、4-羥脯氨酸、n-cbz-保護(hù)的氨基酸、2,4-二氨基丁酸、高精氨酸、正亮氨酸、n-甲基氨基丁酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、α-苯基脯氨酸、叔亮氨酸、4-氨基環(huán)己基丙氨酸、n-甲基正亮氨酸、3,4-脫氫脯氨酸、n,n-2甲基氨基甘氨酸、n-甲基氨基甘氨酸、4-氨基吡啶-4羧酸、6-氨基己酸、反式-4-(氨甲基)環(huán)己烷羧酸、2-、3-、和4-(氨甲基)苯甲酸、1-氨基環(huán)戊烷羧酸、1-氨基環(huán)丙烷羧酸、以及2-芐基-5-氨基戊酸。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“肽”包括由通過肽鍵連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的化合物。肽可以具有小于10,000道爾頓、小于5,000道爾頓、或小于2,500道爾頓的分子量。術(shù)語(yǔ)“肽”還包括包含肽成分和非肽成分的化合物，諸如假肽或擬肽殘基或其它非氨基酸成分。這樣的包含肽成分和非肽成分的化合物也可以稱作“肽類似物”。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白”包括由以直鏈排列的并通過羧基與相鄰氨基酸的氨基之間的肽鍵連接在一起的氨基酸組成的化合物。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”包括合成的或天然存在的通常為兩親的和生物相容的化合物。脂質(zhì)典型地包括親水成分和疏水成分。示例性的脂質(zhì)包括但不限于脂肪酸、中性脂肪、磷脂、糖脂等。如此處采用的，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)組合物”是指包含脂質(zhì)化合物的組合物，通常在含水介質(zhì)中。示例性的脂質(zhì)組合物包括但不限于，懸浮液、乳濁液、泡囊組合物等。
在生物樣品中用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記物的多肽或核酸的存在與否的示例性方法包括從測(cè)試受試者中獲得生物樣品(如，體液樣品(如血)和/或腫瘤樣品)，并使該生物樣品與能夠檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物(如dna、rna、蛋白、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)等)的化合物或藥劑接觸。
這里描述的檢測(cè)方法可以用來在生物樣品中體外以及體內(nèi)檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物(如dna、rna、蛋白、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)等)。例如，用于檢測(cè)mrna的體外技術(shù)包括rna雜交和原位雜交。用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的多肽的體外技術(shù)包括酶聯(lián)吸附劑分析(elisa)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光。用于檢測(cè)基因組dna的體外技術(shù)包括dna雜交。此外，用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的多肽的體內(nèi)技術(shù)包括向受試者體內(nèi)引入針對(duì)該多肽的標(biāo)記的抗體。例如，抗體可以用放射活性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，該放射活性標(biāo)記在受試者中的存在和位置可以通過標(biāo)準(zhǔn)的成像技術(shù)來檢測(cè)。
用于分析生物樣品中的脂質(zhì)含量的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如，kangetal.(1992)biochim.biophys.acta.1128:267；weylandtetal.(1996)lipids31:977；j.schilleretal.(1999)anal.biochem.267:46；kangetal.(2001)proc.natl.acad.sci.usa98:4050；schilleretal.(2004)prog.lipidres.43:499)。脂質(zhì)分析的示例性方法是從生物樣品中提取脂質(zhì)(例如，利用含有0.005％丁基化羥基甲苯(bht，作為抗氧化劑)的氯仿:甲醇(2:1，vol:vol)，制備脂肪酸甲酯(如14％bf3-甲醇試劑)，以及對(duì)定量化的脂肪酸甲酯進(jìn)行定量(例如，通過hplc、tlc，通過利用商購(gòu)的氣相色譜儀、質(zhì)譜儀和/或組合氣相色譜儀/質(zhì)譜儀的氣相色譜-質(zhì)譜法)。脂肪酸的質(zhì)量通過比較各種分析的脂肪酸的面積與固定濃度的內(nèi)標(biāo)的面積來確定。
診斷和預(yù)測(cè)分析的一般原則涉及在適當(dāng)?shù)臈l件下以及足以使標(biāo)記物和探針相互作用和結(jié)合的時(shí)間，制備可以包含標(biāo)記物(例如，dna、rna、蛋白、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)等中的一種或多種)和探針的樣品或反應(yīng)混合物，由此形成在反應(yīng)混合物中可以被去除和/或檢測(cè)的復(fù)合物。這些分析可以通過多種方式來進(jìn)行。
例如，進(jìn)行這樣的分析的一種方法包括將標(biāo)記或探針錨定到固相支持物，也稱作基質(zhì)上，并且在反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定在固相上的目標(biāo)標(biāo)記物/探針復(fù)合物。在這樣的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，來自受試者的待用于分析標(biāo)記物的存在和/或濃度的樣品可以錨定到載體或固相支持物上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，相反的情況是可能的，其中探針可以被錨定至固相并且可以使來自受試者的樣品與分析的非錨定成分反應(yīng)。
存在許多用于將分析成分錨定至固相的確立的方法。它們包括但不限于通過生物素和鏈霉親和素的結(jié)合而固定的標(biāo)記或探針分子。這樣的生物素化的分析成分可以利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)(例如，biotinylationkit，piercechemicals,rockford,il)由生物素-nhs(n-羥基-琥珀酰亞胺)制備，并且固定在鏈霉親和素包覆的96孔板(piercechemical)的孔內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，可以預(yù)先制備具有固定的分析成分的表面并保存。
用于這些的分析的其它的合適載體或固相支持物包括任何能夠結(jié)合標(biāo)記或探針?biāo)鶎俚念惖姆肿拥牟牧?。熟知的支持物或載體包括但不限于，玻璃、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯、尼龍、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖、和磁鐵礦。
為了利用上面提到的方法來進(jìn)行分析，將非固定的成分加入到其中錨定有第二成分的固相上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以在這樣的條件下除去未復(fù)合的成分(例如，通過洗滌)使得形成的任何復(fù)合物將仍固定在固相上。錨定至固相的標(biāo)記/探針復(fù)合物的檢測(cè)可以以本文概述的許多方法來完成。
在某些示例性實(shí)施方式中，當(dāng)其為未錨定的分析成分時(shí)，探針可以用本文討論的并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的可檢測(cè)標(biāo)記來直接或間接地進(jìn)行標(biāo)記，用于分析的檢測(cè)和讀出的目的。
還可以直接檢測(cè)標(biāo)記/探針復(fù)合物的形成，而無需進(jìn)一步操作或標(biāo)記任一成分(標(biāo)記或探針)，例如通過利用熒光能量傳遞的技術(shù)(參見，例如，美國(guó)專利第5,631,169號(hào)和第4,868,103號(hào))。選擇第一“供體”分子上的熒光標(biāo)簽，使得在用適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)的入射光激發(fā)后，其發(fā)出的熒光能量會(huì)被第二“受體”分子上的熒光標(biāo)簽吸收，其由于吸收的能量又能夠發(fā)熒光?？商鎿Q地，“供體”蛋白分子可以簡(jiǎn)單地利用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇發(fā)出不同波長(zhǎng)的光的標(biāo)記，使得“受體”分子標(biāo)簽可以不同于“供體”。由于標(biāo)簽之間的能量傳遞的效率與隔開分子的距離有關(guān)，因此分子之間的空間關(guān)系可以被估計(jì)。在其中分子間發(fā)生結(jié)合的情況下，分析中的“受體”分子標(biāo)簽的熒光發(fā)射應(yīng)該達(dá)到最大。fet結(jié)合事件可以通過本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測(cè)手段(例如，利用熒光儀)來常規(guī)地進(jìn)行測(cè)量。
在另一實(shí)施方式中，通過利用如實(shí)時(shí)生物分子相互作用分析(bia)的技術(shù)(參見，例如，sjolander,s.andurbaniczky,c.,1991,anal.chem.63:23382345andszaboetal.,1995，curropin.struct.biol.5:699705)可以實(shí)現(xiàn)探針識(shí)別標(biāo)記的能力的確定，而無需標(biāo)記任一分析成分(探針或標(biāo)記物)。如此處所使用的，“bia”或“表面等離子體共振”是一種在無需標(biāo)記任何反應(yīng)物(如，biacore)的情況下用于實(shí)時(shí)研究生物特異性相互反應(yīng)的技術(shù)。結(jié)合表面的質(zhì)量變化(結(jié)合事件的指示)導(dǎo)致表面附近光的折射率的改變(表面等離子共振(spr)的光學(xué)現(xiàn)象)，產(chǎn)生了可以被用作指示生物分子之間的實(shí)時(shí)反應(yīng)的可檢測(cè)標(biāo)志。
可替換地，在另一實(shí)施方式中，類似的診斷和預(yù)測(cè)分析可以利用作為溶質(zhì)的標(biāo)記物和探針在液相中進(jìn)行。在這樣的分析中，復(fù)合的標(biāo)記物和探針可以通過許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中的任一種，包括但不限于：差速離心、色譜、電泳和免疫沉淀與未復(fù)合的成分分離。在差速離心中，標(biāo)記物/探針復(fù)合物可以通過一系列離心步驟與未復(fù)合的分析成分分離，這是因?yàn)榛谒鼈兊牟煌笮『兔芏?，?fù)合物的不同的沉降平衡(參見，例如，rivasandminton(1993)trendsbiochem.sci.18:284)。標(biāo)準(zhǔn)的色譜技術(shù)也可以用來將復(fù)合的分子與未復(fù)合的分子分開。例如，凝膠過濾色譜基于尺寸，并且通過利用柱形式的適當(dāng)?shù)哪z過濾樹脂來分離分子，例如，相對(duì)大的復(fù)合物可以與相對(duì)小的未復(fù)合的成分分開。類似地，與未復(fù)合的成分相比，標(biāo)記物/探針復(fù)合物的相對(duì)不同的帶電性質(zhì)可以用來區(qū)分復(fù)合物和未復(fù)合的成分，例如通過利用離子交換色譜樹脂。這樣的樹脂和色譜技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員來說是熟知的(參見，例如，heegaard(1998)j.mol.recognit.11:141；hageandtweed(1997)j.chromatogr.b.biomed.sci.appl.12:499)。凝膠電泳可以用來將復(fù)合的分析成分與未結(jié)合的成分分開。(參見，例如，ausubeletal.，currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork，19871999)。在該技術(shù)中，蛋白質(zhì)或核酸復(fù)合物基于例如大小或電荷而分開。為了在電泳過程中保持結(jié)合相互作用，在不存在還原劑情況下的非變性凝膠基質(zhì)材料和條件通常是優(yōu)選的。用于特定分析和其成分的適當(dāng)?shù)臈l件對(duì)于本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員來說將是熟知的。
在某些示例性實(shí)施方式中，對(duì)應(yīng)于標(biāo)記物的mrna的水平可以利用本領(lǐng)域中已知的方法在生物樣品中通過原位和/或通過體外的方式來確定。許多表達(dá)檢測(cè)方法利用分離的rna。對(duì)于體外方法，并不針對(duì)分離mrna選擇的任何rna分離技術(shù)可以用于從血細(xì)胞中純化rna(參見，例如，ausubeletal.ed.，currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork，19871999)。此外，大量細(xì)胞和/或樣品可以容易地利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來處理，例如，chomczynski的單步rna分離方法(1989，美國(guó)專利第4,843,155號(hào))。
分離的mrna可以用于雜交或擴(kuò)增分析，其包括但不限于，southern或northern分析、聚合酶鏈反應(yīng)分析和探針陣列。在某些示例性實(shí)施方式中，用于檢測(cè)mrna水平的診斷方法包括使分離的mrna與核酸分子(探針)接觸，其中所述核酸分子(探針)可以雜交于通過待檢測(cè)基因編碼的mrna。核酸探針可以是，例如，全長(zhǎng)cdna、或其一部分，如長(zhǎng)度為至少7、15、30、50、100、250或500個(gè)核苷酸并在嚴(yán)格條件下足以與編碼本發(fā)明的標(biāo)記物的mrna或基因組dna特異性雜交的寡核苷酸。此處描述了其它用于本發(fā)明的診斷分析中的合適的探針。mrna與探針的雜交表明所述的標(biāo)記物被表達(dá)。
在一種方式中，mrna被固定在固體表面上并與探針接觸，例如，通過使分離的mrna在瓊脂糖凝膠上流動(dòng)(運(yùn)行)并將mrna從凝膠轉(zhuǎn)移到例如硝酸纖維素的膜上。在可替換的方式中，一個(gè)或多個(gè)探針被固定在固體表面上并使mrna與所述探針接觸，例如，在基因芯片陣列中。普通技術(shù)人員可以容易地采用已知的mrna檢測(cè)方法，用于檢測(cè)由本發(fā)明的標(biāo)記物編碼的mrna水平。
用于在樣品中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記物的mrna水平的可替換方法包括核酸擴(kuò)增的方法，例如，通過rtpcr(在美國(guó)專利第4,683,195和4,683,202號(hào)中闡述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方式)、cold-pcr(lietal.(2008)nat.med.14:579)、連接酶鏈反應(yīng)(barany，1991，proc.natl.acad.sci.usa，88:189)、自激序列復(fù)制(guatellietal.,1990，proc.natl.acad.sci.usa，87:1874)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(kwohetal.(1989)proc.natl.acad.sci.usa，86:1173)、q-β復(fù)制酶(lizardietal.(1988)bio/technology6:1197)、滾環(huán)式復(fù)制(美國(guó)專利第5,854,033號(hào))或任何其它核酸擴(kuò)增方法，接著利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來檢測(cè)擴(kuò)增的分子。如果這樣的分子以非常低的數(shù)量存在，則這些檢測(cè)策略可特別用于核酸分子的檢測(cè)。如此處所使用的，擴(kuò)增引物被定義為一對(duì)可以與基因的5’或3’區(qū)(分別是正鏈和負(fù)鏈，或反之亦然)退火并包含中間的短區(qū)域的核酸分子。通常，擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度為約10至30個(gè)核苷酸并側(cè)接長(zhǎng)度為約50至200個(gè)核苷酸的區(qū)域。在適當(dāng)?shù)臈l件下并利用適當(dāng)?shù)脑噭?，這樣的引物允許包括被引物側(cè)接的核苷酸序列的核酸分子的擴(kuò)增。
對(duì)于原位方法，在檢測(cè)前，并不需要使mrna與樣品(如，體液(如血細(xì)胞))分離。在這樣的方法中，細(xì)胞或組織樣品利用已知的組織學(xué)方法來制備/處理。然后將樣品固定在支持物上，通常載玻片上，隨后與可以雜交于編碼標(biāo)記物的mrna的探針接觸。
作為基于標(biāo)記物的絕對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行確定的備選方案，確定可以是基于標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。通過比較標(biāo)記物的表達(dá)與并非標(biāo)記物的基因，例如構(gòu)成型表達(dá)的管家基因的表達(dá)來校正標(biāo)記物的絕對(duì)表達(dá)水平而使表達(dá)水平規(guī)格化。用于規(guī)格化的合適的基因包括管家基因如肌動(dòng)蛋白基因、或上皮細(xì)胞特異性基因。該規(guī)格化使來自一種來源的患者樣品中的表達(dá)水平與來自另一來源的患者樣品的表達(dá)相比較，例如，使來自個(gè)體的吞噬血細(xì)胞與來自所述個(gè)體的非吞噬血細(xì)胞相比較。
在另一示例性實(shí)施方式中，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo)記物的蛋白或多肽。在某些示例性實(shí)施方式中，用于檢測(cè)本發(fā)明的多肽的試劑是能夠結(jié)合至對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記物的多肽的抗體，如帶有可檢測(cè)標(biāo)簽的抗體?？贵w可以是多克隆的，或者更優(yōu)選地，單克隆的?？梢允褂猛暾目贵w、或其片段(如fab或f(ab’)2)。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”(相對(duì)于探針或抗體)旨在包括通過將可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理連接)至探針或抗體來直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與另一間接標(biāo)記的試劑的反應(yīng)性來間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括利用熒光標(biāo)記的二抗來檢測(cè)一抗以及用生物素末端標(biāo)記dna探針，使得其可以用熒光標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè)。
可以采用各種模式來確定樣品是否包含結(jié)合至給定抗體的蛋白。這些的模式的實(shí)例包括但不限于，酶免疫測(cè)定(eia)、放射性免疫測(cè)定(ria)、蛋白質(zhì)印跡分析、酶聯(lián)免疫吸收劑分析(elisa)等。普通技術(shù)人員可以容易地采用已知的蛋白/抗體檢測(cè)方法，用于確定細(xì)胞(例如，體液細(xì)胞，如血細(xì)胞)是否表達(dá)本發(fā)明的標(biāo)記物。
在一種模式中，抗體、或抗體片段可以用于如蛋白質(zhì)印跡或免疫熒光技術(shù)的方法中以檢測(cè)表達(dá)的蛋白。在這樣的應(yīng)用中，通常優(yōu)選將抗體或蛋白中的任一種固定在固體支持物上。合適的固相支持物或載體包括任何能夠結(jié)合抗原或抗體的支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖、磁鐵礦等。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將已知的用于結(jié)合抗體或抗原的許多其它合適的載體，并且能夠采用這樣的支持物用于本發(fā)明中。例如，從細(xì)胞(如，體液細(xì)胞如血細(xì)胞)分離的蛋白可以在聚丙烯酰胺凝膠電泳上流動(dòng)并固定到如硝酸纖維素膜的固相支持物上。然后用合適的緩沖液沖洗支持物，接著用可檢測(cè)標(biāo)記的抗體處理。然后第二次用緩沖液沖洗固相支持物以除去未結(jié)合的抗體。然后可以通過常規(guī)方式來檢測(cè)固相支持物上的結(jié)合標(biāo)簽的量。
在某些示例性實(shí)施方式中，提供了診斷性分析。在生物樣品中用于身體狀況、與癌癥相關(guān)的疾病和/或障礙、感染原、和/或其它疾病的存在與否的示例性方法包括從測(cè)試受試者中獲得生物樣品，然后使該生物樣品與能夠檢測(cè)與癌癥相關(guān)的疾病和/或障礙、感染原、和/或其它疾病或病癥的一種或多種標(biāo)記物的化合物或藥劑接觸，如標(biāo)記物核酸(如mrna、基因組dna)，或由標(biāo)記物核酸編碼的標(biāo)記物肽(如，多肽或蛋白)或標(biāo)記物脂質(zhì)，使得在生物樣品中檢測(cè)標(biāo)記物核酸或由核酸編碼的標(biāo)記物肽的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于檢測(cè)標(biāo)記物mrna或基因組dna的藥劑是能夠與標(biāo)記物mrna或基因組dna雜交的標(biāo)記物的核酸探針。核酸探針可以是，例如，全長(zhǎng)的標(biāo)記物核酸或其一部分。此處描述了用于本發(fā)明的診斷分析的其它合適的探針。
用于檢測(cè)標(biāo)記物肽的藥劑可以是能夠結(jié)合于標(biāo)記物肽的抗體，如帶有可檢測(cè)標(biāo)簽的抗體?？贵w可以是多克隆的或單克隆的?？梢允褂猛暾目贵w、或其片段(如fab或f(ab’)2)。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”(相對(duì)于探針或抗體)旨在包括通過將可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理連接)至探針或抗體來直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與另一間接標(biāo)記的試劑的反應(yīng)性來間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括利用熒光標(biāo)記的二抗來檢測(cè)一抗以及用生物素末端標(biāo)記dna探針，使得其可以用熒光標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè)。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”旨在包括從受試者分離的組織、細(xì)胞(如吞噬細(xì)胞、非吞噬細(xì)胞、2n細(xì)胞、>2n細(xì)胞等)和生物液體(如，全血、wbc等)，以及在受試者體內(nèi)存在的組織、細(xì)胞(如，吞噬細(xì)胞、非吞噬細(xì)胞、2n細(xì)胞、>2n細(xì)胞等)和體液(如，尿、全血、wbc等)。即，本發(fā)明的檢測(cè)方法可以用于體外以及體內(nèi)檢測(cè)生物樣品中的標(biāo)記物多肽、蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、寡糖、mrna、微小rna、基因組dna等。在一種實(shí)施方式中，生物樣品包含來自測(cè)試受試者的蛋白、多肽、脂質(zhì)和/或寡糖。可替換地，生物樣品可以包含來自測(cè)試受試者的mrna分子和/或來自所述測(cè)試受試者的基因組mrna分子。在一種實(shí)施方式中，生物樣品是通過常規(guī)方法從受試者分離的血清樣品、唾液樣品或活檢樣品。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括從對(duì)照受試者(如，非吞噬細(xì)胞或2n細(xì)胞)中獲得對(duì)照生物樣品，使對(duì)照樣品(如，非吞噬細(xì)胞或2n細(xì)胞)與能夠在生物樣品中檢測(cè)標(biāo)記物多肽、蛋白脂質(zhì)、寡糖、mrna、微小rna、基因組dna等的化合物或藥劑接觸，并將對(duì)照樣品中標(biāo)記物多肽、蛋白脂質(zhì)、寡糖、mrna、基因組dna等的存在與測(cè)試樣品(如，吞噬細(xì)胞或>2n細(xì)胞)中標(biāo)記物多肽、蛋白脂質(zhì)、寡糖、mrna、基因組dna等的存在相比較?？商鎿Q地，測(cè)試樣品(如，吞噬細(xì)胞或>2n細(xì)胞)中標(biāo)記物多肽、蛋白脂質(zhì)、寡糖、mrna、基因組dna等的存在可以與數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息或?qū)?dǎo)致檢測(cè)或診斷的圖表相比較。
本發(fā)明還包括用于在生物樣品中檢測(cè)一種或多種與癌癥和/或感染原相關(guān)的標(biāo)記物存在的試劑盒。例如，試劑盒可以包括能夠檢測(cè)生物樣品中的標(biāo)記物多肽、蛋白脂質(zhì)、寡糖、mrna、微小rna、基因組dna等的標(biāo)記的化合物或試劑；用于確定樣品中標(biāo)記物的量的裝置；以及用于將樣品中標(biāo)記物的量與標(biāo)準(zhǔn)物(如，非吞噬細(xì)胞或2n細(xì)胞)相比較的裝置。該化合物或藥劑可以包裝在合適的容器內(nèi)。該試劑盒可以進(jìn)一步包括使用該試劑盒以檢測(cè)標(biāo)記物肽或核酸的說明書。
在某些示例性實(shí)施方式中，提供了預(yù)測(cè)分析。此處描述的診斷方法可以另外用來識(shí)別具有病癥或發(fā)展與癌癥和/或感染原相關(guān)的疾病和/或障礙、或與此處描述的一種或多種標(biāo)記物的上調(diào)(或下調(diào))表達(dá)相關(guān)的本文描述的另一障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者。例如，此處描述的分析，如前面的診斷分析或隨后的分析可以用來識(shí)別具有或有發(fā)展與癌癥和/或感染原相關(guān)的疾病和/或障礙和/或本文描述的一種或多種其它障礙風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
此處描述的預(yù)測(cè)分析可以用來確定受試者是否可以給予藥劑(如激動(dòng)劑、拮抗劑、擬肽、蛋白、肽、核酸、小分子、或其它藥物候選物)，以治療與癌癥和/或感染原相關(guān)的疾病和/或障礙、或與此處描述的一種或多種標(biāo)記物相關(guān)的本文描述的一種或多種其它障礙。例如，這樣的方法可以用來確定受試者是否可以用藥劑來有效地處理，從而治療、緩解或減少與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀。因此，本發(fā)明提供了用于確定受試者是否可以利用用于與癌癥和/或感染原相關(guān)的疾病和/或障礙、和/或本文描述的一種或多種其它障礙的藥劑來有效地治療的方法。
本發(fā)明的方法還可以用來檢測(cè)標(biāo)記物基因的基因改變，從而確定具有改變的基因的受試者是否有發(fā)展與癌癥和/或感染原相關(guān)的疾病和/或障礙、和/或通過標(biāo)記物蛋白活性或核酸表達(dá)的誤調(diào)節(jié)表征的本文描述的一種或多種其它障礙，如癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在某些實(shí)施方式中，該方法包括在來自受試者的細(xì)胞(如，體液細(xì)胞如血細(xì)胞)的樣品中檢測(cè)通過影響編碼標(biāo)記物肽的基因和/或標(biāo)記基因的完整性的改變表征的基因改變的存在與否。例如，這樣的基因改變可以通過確定以下中的至少一種的存在來檢測(cè)：1)來自一種或多種標(biāo)記物基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失；2)一種或多種標(biāo)記物基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸增加；3)一種或多種標(biāo)記物基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換，4)一種或多種標(biāo)記物基因的染色體重排；5)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物基因的信使rna轉(zhuǎn)錄水平的改變；6)一種或多種標(biāo)記物基因的異常修飾，如基因組dna的甲基化模式；7)一種或多種標(biāo)記物基因的信使rna轉(zhuǎn)錄的非野生型剪接模式的存在；8)一種或多種標(biāo)記物蛋白的非野生型水平；9)一種或多種標(biāo)記物標(biāo)記物基因的等位丟失；以及10)一種或多種標(biāo)記物蛋白的不適當(dāng)?shù)姆g后修飾。如此處所描述的，存在大量本領(lǐng)域已知的可以用于檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物基因的改變的分析。
在某些實(shí)施方式中，改變的檢測(cè)包括將探針/引物用于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)(參見，例如，美國(guó)專利第4,683,195號(hào)、第4,683,202號(hào)和第5,854,033號(hào))，如實(shí)時(shí)pcr、cold-pcr、錨定pcr、回歸pcr或racepcr，或可替換地，用于連接鏈反應(yīng)(lcr)(參見，例如，landegranetal.(1998)science241:1077，prodromouandpearl(1992)proteineng.5:827；andnakazawaetal.(1994)procnatl.acad.sci.usa91:360)，后者特別可用于在標(biāo)記物基因中檢測(cè)點(diǎn)突變(參見abravayaetal.(1995)nucleicacidsres.23:675)。該方法可以包括以下步驟：從受試者中收集細(xì)胞的樣品，從細(xì)胞的樣品中分離核酸(如，基因組的，mrna或兩者)，使核酸樣品與一個(gè)或多個(gè)引物接觸，該一個(gè)或多個(gè)引物可以在標(biāo)記基因(如果存在)雜交和擴(kuò)增發(fā)生的條件下特異性地與標(biāo)記物基因雜交，并且檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否，或檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小并使所述長(zhǎng)度與對(duì)照樣品的長(zhǎng)度相比較?？梢灶A(yù)期，結(jié)合此處描述的用于檢測(cè)突變的任何技術(shù)，pcr和/或lcr可以期望被用作初級(jí)擴(kuò)增步驟。
可替換的擴(kuò)增方法包括：自激序列復(fù)制(guatellietal.，(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:1874)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(kwohetal.，(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:1173)、q-β復(fù)制酶(lizardietal.(1988)bio-technology6:1197)、或任何其它核酸擴(kuò)增方法，接著利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來檢測(cè)擴(kuò)增后的分子。如果這樣的分子以非常低的存在，則這些檢測(cè)策略特別可用于檢測(cè)核酸分子。
在可替換的實(shí)施方式中，來自樣品細(xì)胞的一種或多種標(biāo)記物基因中的突變可以通過限制酶酶切模式的改變來識(shí)別。例如，分離樣品和對(duì)照dna，可選地?cái)U(kuò)增，用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化，以及通過凝膠電泳確定并比較片段長(zhǎng)度大小。樣品與對(duì)照dna之間的片段長(zhǎng)度大小的不同表明在樣品dna中的突變。而且，序列特異性核酶的使用(參見，例如，美國(guó)專利第5,498,531號(hào))可以通過產(chǎn)生或失去核酶切割位點(diǎn)用來記錄特異性突變的存在。
在其它實(shí)施方式中，此處描述的一種或多種標(biāo)記物中的基因突變可以通過將樣品和對(duì)照核酸如dna或rna雜交于包含成百上千的寡核苷酸探針的高密度陣列來識(shí)別(croninetal.(1996)humanmutation7:244；kozaletal.(1996)naturemedicine2:753)。例如，如在cronin,m.t.等人上文中描述的，在包含產(chǎn)光dna探針的二維陣列中可以識(shí)別標(biāo)記物核酸中的遺傳突變。簡(jiǎn)單地，通過制造序列重疊探針的線性陣列，探針的第一雜交陣列可以被用來掃描通過樣品和對(duì)照中的長(zhǎng)段dna，以識(shí)別序列之間的堿基變化。該步驟允許識(shí)別點(diǎn)突變。該步驟之后是通過使用更小的與檢測(cè)的變異體或突變互補(bǔ)的專門探針陣列而允許特異性突變的表征的第二雜交陣列。每個(gè)突變陣列均由平行的探針組構(gòu)成，一個(gè)與野生型基因互補(bǔ)而另一個(gè)與突變基因互補(bǔ)。
在又一實(shí)施方式中，本領(lǐng)域中已知的各種測(cè)序反應(yīng)中的任一種可以被用來對(duì)標(biāo)記基因進(jìn)行直接測(cè)序，并通過比較樣品標(biāo)記基因的序列與相應(yīng)的野生型(對(duì)照)序列來檢測(cè)突變。測(cè)序反應(yīng)的實(shí)例包括基于maxam和gilbert((1977)proc.natl.acad.sci.usa74:560)或sanger((1977)proc.natl.acad.sci.usa74:5463)開發(fā)的技術(shù)的那些。還期待，當(dāng)進(jìn)行診斷分析((1995)biotechniques19:448)時(shí)，包括通過質(zhì)譜測(cè)序(參見，例如，pct國(guó)際公開號(hào)wo94/16101；cohenetal.(1996)adv.chromatogr.36:127-162；andgriffinetal.(1993)appl.biochem.biotechnol.38:147)，可以利用各種自動(dòng)測(cè)序程序中的任一種。
用于在標(biāo)記物基因中檢測(cè)突變的其它方法包括這樣的方法，其中可以使用由切割試劑的保護(hù)以檢測(cè)rna/rna或rna/dna異源雙鏈體(myersetal.(1985)science230:1242)中的錯(cuò)配堿基。通常，“錯(cuò)配切割”的本領(lǐng)域技術(shù)從提供包含(標(biāo)記的)rna或dna的野生型標(biāo)記序列與由組織樣品獲得的潛在突變r(jià)na或dna雜交而形成的異源雙鏈體開始。雙鏈的雙鏈體用切割雙鏈體的單鏈區(qū)域(諸如由于對(duì)照與樣品鏈之間的堿基錯(cuò)配而存在的)的藥劑處理。例如，rna/dna雙鏈體可以用rna酶處理并且dna/dna雜種用s1核酸酶處理以酶促消化錯(cuò)配的區(qū)域。在其它實(shí)施方式中，dna/dna或rna/dna雙鏈體都可以用羥胺或四氧化鋨和用吡啶處理以消化錯(cuò)配區(qū)域。在消化錯(cuò)配區(qū)域后，所得的物質(zhì)然后在變性聚丙烯酰胺凝膠上根據(jù)大小分開以確定突變的位點(diǎn)。參見，例如，cottonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:4397；saleebaetal.(1992)methodsenzymol.217:286。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以標(biāo)記對(duì)照dna或rna以用于檢測(cè)。
在又一個(gè)實(shí)施方式中，錯(cuò)配切割反應(yīng)采用一種或多種在規(guī)定系統(tǒng)中識(shí)別雙鏈dna的錯(cuò)配堿基對(duì)的蛋白(所謂的“dna錯(cuò)配修復(fù)”酶)，用于檢測(cè)和定位在由細(xì)胞樣品獲得的標(biāo)記物cdna中的點(diǎn)突變。例如，大腸桿菌的muty酶切割g/a錯(cuò)配處的a，而來自hela細(xì)胞的胸腺嘧啶dna糖基化酶切割g/t錯(cuò)配處的t(hsuetal.(1994)carcinogenesis15:1657)。根據(jù)示例性的實(shí)施方式，基于標(biāo)記序列如野生型標(biāo)記序列的探針雜交于來自測(cè)試細(xì)胞的cdna或其它dna產(chǎn)物。雙鏈體用dna錯(cuò)配修復(fù)酶處理，并且切割產(chǎn)物(如果有的話)可以根據(jù)電泳方案等進(jìn)行檢測(cè)。參見，例如，美國(guó)專利第5,459,039號(hào)。
在其它實(shí)施方式中，電泳遷移率的改變將可以用來識(shí)別標(biāo)記物基因中的突變。例如，單鏈構(gòu)型多態(tài)性(sscp)可以用來檢測(cè)突變與野生型核酸之間的電泳遷移率的差別(oritaetal.(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:2766，還參見cotton(1993)mutat.res.285:125；以及hayashi(1992)genet.anal.tech.appl.9:73)。將樣品和對(duì)照標(biāo)記物核酸的單鏈dna片段變性并使它們復(fù)性。單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)序列而變化，電泳遷移率所得的改變使得能夠檢測(cè)甚至單個(gè)堿基的改變。dna片段可以被標(biāo)記或用標(biāo)記的探針檢測(cè)。分析的敏感性可以通過利用rna(而不是dna)而提高，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)序列的改變是更敏感的。在一個(gè)實(shí)施方式中，主題方法利用異源雙鏈體分析以基于電泳遷移率的變化來分離雙鏈異源雙鏈體分子。(keenetal.(1991)trendsgenet.7:5)。
在又一個(gè)實(shí)施方式中，利用變性梯度凝膠電泳(dgge)對(duì)突變或野生型片段在含有梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中的移動(dòng)進(jìn)行分析(myersetal.(1985)nature313:495)。當(dāng)使用dgge作為分析的方法時(shí)，dna將被修飾以確保它不會(huì)被完全變性，例如通過pcr通過加入一個(gè)大約40bp的高熔點(diǎn)的富含gc的dna的gc封條。在另外的實(shí)施方式中，使用溫度梯度來代替變性梯度以確定對(duì)照和樣品dna遷移率的差異(rosenbaumandreissner(1987)biophys.chem.265:12753)。
用于檢測(cè)點(diǎn)突變的其它技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴(kuò)增或選擇性引物延伸。例如，可以制備寡核苷酸引物，其中已知的突變被置于中部，然后在只有當(dāng)發(fā)現(xiàn)完全匹配才允許雜交的條件下與靶dna雜交(saikietal.(1986)nature324:163；saikietal.(1989)proc.natl.acad.sci.usa86:6230)。當(dāng)寡核苷酸連接至雜交膜并用標(biāo)記的靶dna雜交時(shí)，這樣的等位基因特異性寡核苷酸雜交于pcr擴(kuò)增的靶dna或許多不同的突變。
可替換地，取決于選擇性pcr擴(kuò)增的等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)可以與本發(fā)明結(jié)合使用。用作用于特異性擴(kuò)增的引物的寡核苷酸可以攜帶在分子的中央(使得擴(kuò)增取決于不同的雜交)(gibbsetal.(1989)nucl.acidsres.17:2437)或在一個(gè)引物的最3’端感興趣的突變，其中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，錯(cuò)配可以防止或減少聚合酶延伸(prossner(1993)tibtech11:238)。此外，可以期望在突變的區(qū)域引入新的限制位點(diǎn)以產(chǎn)生基于切割的檢測(cè)(gasparinietal.(1992)mol.cellprobes6:1)?？梢云诖?，在某些實(shí)施方式中，也可以利用用于擴(kuò)增的taq連接酶進(jìn)行擴(kuò)增(barany(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:189)。在這些的情況中，僅當(dāng)在5’序列的3’末端存在完全匹配時(shí)連接才會(huì)發(fā)生，使得通過尋找擴(kuò)增的存在與否可以檢測(cè)在特異性位點(diǎn)已知突變的存在。
應(yīng)當(dāng)理解，已經(jīng)描述的本發(fā)明的實(shí)施方式僅是本發(fā)明的某些原則應(yīng)用的舉例說明。在不偏離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下，基于此處提供的教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行多種更改。本申請(qǐng)引用的所有文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文用于所有目的。
下面的實(shí)施例作為本發(fā)明的代表來闡述。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋成限制本發(fā)明的范圍，當(dāng)考慮到本發(fā)明的披露內(nèi)容、圖和所附的權(quán)利要求時(shí)，這些和其它等效實(shí)施方式將是顯而易見的。
實(shí)施例1
用于從非吞噬細(xì)胞分離吞噬細(xì)胞的代表性方法i和表達(dá)譜的分析
1.參照?qǐng)D2和圖3，用親和素(抗生物素蛋白)涂敷板。
2.向非吞噬細(xì)胞(如t細(xì)胞)中加入生物素化的抗體加到孔中，在室溫下孵育30分鐘，沖洗孔。
3.加入磁珠。
4.加入wbc血液樣品。
5.在37℃下孵育(30分鐘-1小時(shí))。
6.在通過吞噬細(xì)胞吞噬磁珠并將親和素-生物素抗體結(jié)合至非吞噬細(xì)胞后，將板置于磁鐵的頂部并洗滌(內(nèi)化磁珠的吞噬細(xì)胞和結(jié)合于抗體的非吞噬細(xì)胞會(huì)留下；所有其它細(xì)胞將會(huì)洗掉)。
7.去除磁鐵并收集吞噬細(xì)胞。
8.從吞噬細(xì)胞(例如，結(jié)合于磁珠的細(xì)胞)和非吞噬細(xì)胞(例如，通過抗-非吞噬細(xì)胞生物素化的抗體-親和素結(jié)合而附著于孔的底部的細(xì)胞)分離rna，制備cdna、crna并用來區(qū)分吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的基因譜(例如，全基因陣列和/或癌癥基因陣列)。
9.從每個(gè)細(xì)胞樣品分離dna并識(shí)別在吞噬細(xì)胞中選擇性存在(即，在非吞噬細(xì)胞中不存在)的腫瘤-dna標(biāo)志；比較譜(如，全基因陣列、在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的dna突變和/或snp)。
10.從每個(gè)細(xì)胞樣品分離蛋白，利用對(duì)被人腫瘤過度表達(dá)的蛋白已知的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(如，前列腺癌中的psa和psma；結(jié)腸癌中的cea；以及卵巢癌中的ca125)，并且比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜(分布)。可替換地，使用質(zhì)譜來識(shí)別蛋白。
11.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離脂質(zhì)并比較數(shù)量和質(zhì)量，如利用hplc。
實(shí)施例2
用于從非吞噬細(xì)胞中分離吞噬細(xì)胞的代表性方法ii和表達(dá)譜的分析
1.參照?qǐng)D2和圖3，在血液樣品中裂解rbc。
2.將wbc細(xì)胞旋涂(cytospin)到載玻片上。
3.將細(xì)胞固定在丙酮/甲醇中(-20℃5分鐘)。
4.用蘇木精和曙紅染色劑以及抗t細(xì)胞抗體染色。
5.利用激光俘獲顯微鏡(lcm)來分離t細(xì)胞(非吞噬的)和巨噬細(xì)胞(吞噬的)。
6.從吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中分離rna，制備cdna、crna并用來區(qū)分吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的基因譜(如，全基因陣列和/或癌癥基因陣列)。
7.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離dna，運(yùn)行dna陣列，并且比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜(分布)(如，全基因陣列、dna突變和/或snp)。
8.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離蛋白，利用對(duì)被人腫瘤過度表達(dá)的蛋白已知的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(如，前列腺癌中的psa和psma；結(jié)腸癌中的cea；以及卵巢癌中的ca125)，并且比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜(分布)?？商鎿Q地，使用質(zhì)譜來識(shí)別蛋白。
9.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離脂質(zhì)并比較數(shù)量和質(zhì)量，如利用hplc。
實(shí)施例3
用于從非吞噬細(xì)胞中分離吞噬細(xì)胞的代表性方法iii和表達(dá)譜的分析
1.參照?qǐng)D2和圖3，從血液樣品中裂解紅細(xì)胞。
2.利用磁性抗體結(jié)合的珠以從全血中分離非吞噬細(xì)胞(如t細(xì)胞)和吞噬細(xì)胞(如，嗜中性粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞和/或單核細(xì)胞)。
3.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離rna，制備cdna、crna并用于區(qū)分吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的基因譜(如，癌基因陣列)。
4.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離dna，運(yùn)行dna陣列，并比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜。
5.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離蛋白，利用對(duì)被人腫瘤過度表達(dá)的蛋白已知的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(如，前列腺癌中的psa和psma；結(jié)腸癌中的cea；以及卵巢癌中的ca125)，并且比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜。可替換地，使用質(zhì)譜來識(shí)別蛋白。
6.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離脂質(zhì)并比較數(shù)量和質(zhì)量，如利用hplc。
實(shí)施例4
用于從非吞噬細(xì)胞中分離吞噬細(xì)胞的代表性方法iv和表達(dá)譜的分析
1.參照?qǐng)D2和圖3，用對(duì)特定細(xì)胞亞群(例如，嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、t細(xì)胞等)特異性的熒光抗體對(duì)wbc進(jìn)行染色。
2.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(例如，通過facs)。
3.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離rna，制備cdna、crna并用于區(qū)分吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的基因譜(如，癌基因陣列)。
4.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離dna，運(yùn)行dna陣列，并比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜。
5.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離蛋白，利用對(duì)被人腫瘤過度表達(dá)的蛋白已知的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(如，前列腺癌中的psa和psma；結(jié)腸癌中的cea；以及卵巢癌中的ca125)，并且比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜?？商鎿Q地，使用質(zhì)譜來識(shí)別蛋白。
6.從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離脂質(zhì)并比較數(shù)量和質(zhì)量，如利用hplc。
實(shí)施例5
用于從非吞噬細(xì)胞中分離吞噬細(xì)胞的代表性方法v和表達(dá)譜的分析
1.參照?qǐng)D5和圖6，用對(duì)每個(gè)細(xì)胞亞群(例如，嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、t細(xì)胞等)特異的熒光抗體對(duì)wbc進(jìn)行染色，然后用dna染料(例如，碘化丙啶)進(jìn)行染色。
2.將細(xì)胞(facs)分為t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞(2n)、嗜中性粒細(xì)胞(>2n)、巨噬細(xì)胞(2n)、巨噬細(xì)胞(>2n)、單核細(xì)胞(2n)、以及單核細(xì)胞(>2n)。
3.從t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞(>2n)、巨噬細(xì)胞(>2n)、和單核細(xì)胞(>2n)中分離rna。然后制備cdna、crna并用于區(qū)分吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的基因譜(例如，癌基因陣列)。
4.從t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞(>2n)、巨噬細(xì)胞(>2n)、和單核細(xì)胞(>2n)中分離dna。運(yùn)行dna陣列，并比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜。
5.從t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞(>2n)、巨噬細(xì)胞(>2n)、和單核細(xì)胞(>2n)中分離蛋白。利用對(duì)被人腫瘤過度表達(dá)的蛋白已知的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(如，前列腺癌中的psa和psma；結(jié)腸癌中的cea；以及卵巢癌中的ca125)，并且比較在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞中獲得的圖譜。可替換地，使用質(zhì)譜來識(shí)別蛋白。
6.從t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞(>2n)、巨噬細(xì)胞(>2n)、和單核細(xì)胞(>2n)中分離脂質(zhì)。比較脂質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，如利用hplc。
實(shí)施例6
用于分離吞噬細(xì)胞的代表方法iv和表達(dá)譜的分析
1.參照?qǐng)D5和圖6，用對(duì)一種或多種吞噬細(xì)胞(如，嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、或單核細(xì)胞)特異的熒光抗體對(duì)wbc進(jìn)行染色然后用dna結(jié)合染料(如碘化丙啶)進(jìn)行染色。
2.將細(xì)胞(facs)分成2n和>2n吞噬細(xì)胞。
3.從2n和>2n吞噬細(xì)胞中的每一個(gè)中分離rna。制備cdna、crna并用于區(qū)分2n吞噬細(xì)胞和>2n吞噬細(xì)胞的基因譜(如癌基因陣列)。
4.從2n和>2n吞噬細(xì)胞中的每一個(gè)中分離dna。運(yùn)行dna陣列，并比較由2n吞噬細(xì)胞和>2n吞噬細(xì)胞獲得的圖譜。
5.從2n和>2n吞噬細(xì)胞中的每一個(gè)中分離蛋白。利用對(duì)被人腫瘤過度表達(dá)的蛋白已知的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(如，前列腺癌中的psa和psma；結(jié)腸癌中的cea；以及卵巢癌中的ca125)，并且比較由吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞獲得的圖譜。
6.從2n和>2n吞噬細(xì)胞中的每一個(gè)中分離脂質(zhì)。比較脂質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，如利用hplc。
實(shí)施例7
檢測(cè)由腫瘤攜帶小鼠獲得的吞噬細(xì)胞中的腫瘤特異性基因標(biāo)志
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供了區(qū)分血液或其它體液中“正常非特異性噪聲”和“腫瘤特異性”和/或“疾病特異性”標(biāo)志的方法。來自腫瘤攜帶小鼠的血液?jiǎn)魏思?xì)胞/巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜與來自于同一供體鼠的非吞噬t細(xì)胞的進(jìn)行比較以識(shí)別吞噬細(xì)胞中的腫瘤特異性標(biāo)志，這些標(biāo)志在來自同一腫瘤攜帶鼠和來自非腫瘤攜帶鼠的非吞噬細(xì)胞中不表達(dá)或顯著不同地表達(dá)。
人前列腺lncap癌細(xì)胞
無胸腺的裸小鼠(n＝5)用人前列腺lncap癌細(xì)胞皮下注射(s.c.)。27天后(腫瘤大?。郊s0.4cm)，小鼠通過心臟穿刺放血(約1毫升/小鼠)入含edta的試管中，然后離心。分離血沉棕黃層并洗滌，分別利用抗小鼠嗜中性粒細(xì)胞的、巨噬細(xì)胞的、和t細(xì)胞免疫磁性dynabeads來分離嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和t細(xì)胞。從每個(gè)細(xì)胞樣品中分離rna
人ls174t結(jié)腸腺癌腫瘤，llc1癌細(xì)胞，b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞
利用從皮下注射有人ls174t結(jié)腸腺癌腫瘤(腫瘤大?。郊s0.3cm)的無胸腺裸小鼠(n＝5)，皮下注射有l(wèi)ewis肺小鼠llc1癌細(xì)胞(腫瘤大小＝約0.6cm)的c57b1小鼠(n＝5)，以及22天前靜脈內(nèi)注射有106b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞(當(dāng)腫瘤細(xì)胞是小鼠來源時(shí)，crna-b樣品與oligo
根據(jù)由這些實(shí)驗(yàn)獲得的和圖9-圖17中所示的數(shù)據(jù)，從注射有人前列腺或結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的小鼠和從攜帶小鼠肺癌或黑色素癌的小鼠獲得的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有各種癌癥相關(guān)基因標(biāo)志，這些標(biāo)志也在它們對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。這些癌癥相關(guān)基因沒有被(i)從腫瘤攜帶小鼠分離的非吞噬性t細(xì)胞；和(ii)由非腫瘤攜帶小鼠獲得的吞噬嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)或最低限度地表達(dá)。
例如，從攜帶lncap人前列腺癌細(xì)胞的裸小鼠的血液分離的嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)多種人腫瘤基因標(biāo)志(humancancerpathwayfindermicroarray)，這些標(biāo)志也在lncap細(xì)胞中表達(dá)(比較圖9的a和b中的陣列的圖譜(分布))。這些基因在由腫瘤攜帶小鼠獲得的t細(xì)胞或從正常小鼠分離的嗜中性粒細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(參見圖9的c和d中的圖譜(分布))。類似地，從攜帶llc1小鼠肺癌細(xì)胞的小鼠的血液分離的嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)多種小鼠腫瘤基因標(biāo)志(mousecancerpathwayfindermicroarray)，這些標(biāo)志在llc1細(xì)胞中表達(dá)(比較圖13的a和b中陣列的圖譜(分布))。
這些基因在由腫瘤攜帶小鼠獲得的t細(xì)胞或從正常小鼠分離的嗜中性粒細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(參見圖13的c和d中所示的圖譜(分布))。最后，掃描這些陣列，每個(gè)基因的密度利用由該公司提供的軟件定量，并且那些被吞噬細(xì)胞選擇性過渡表達(dá)的基因如圖19和圖20所示進(jìn)行識(shí)別。圖21和圖22列出了通過腫瘤攜帶小鼠的吞噬性wbc獲取并差異性呈現(xiàn)的基因標(biāo)志。如圖21所示，檢測(cè)到許多致癌基因(用紅色示出的基因，如erbb2和jun)并且它們經(jīng)常同時(shí)在巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中表達(dá)。
c57b1小鼠(n＝5)被皮下注射1e6lewis肺小鼠癌細(xì)胞(llc1)。20天后，小鼠被麻醉并通過心臟穿刺放血(約1毫升/小鼠)到含edta的試管中。在室溫下以2,000rpm離心5分鐘后，將血沉棕黃層被轉(zhuǎn)移至試管并用pbs洗滌。
抗小鼠巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞兔igg抗體(來自abdserotec,raleigh，nc的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物-f4/80-igg2b)與抗兔igg抗體磁珠(來自invitrogentm，carlsbad，ca的
抗小鼠嗜中性粒細(xì)胞兔igg(嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)記物nimp-r14-igg2a-santacruzbiotechnology,santacruz,ca)與抗兔igg抗體磁珠(
利用抗巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞珠從上面制備的wbc懸液中分離小鼠血巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。大體上，將珠加入到wbc樣品中并在它們孵育(4℃30分鐘)后，利用磁鐵分離巨噬細(xì)胞結(jié)合的珠并用pbs洗滌3次并保存在冰上。
然后從剩下的wbc中分離小鼠t細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說，將抗小鼠t細(xì)胞珠加入到wbc懸液中，孵育樣本(4℃30分鐘)，利用磁鐵分離t細(xì)胞結(jié)合的珠，用pbs洗滌，并保存在冰上。
最后，從剩下的wbc樣品中分離小鼠嗜中性粒細(xì)胞。將抗小鼠嗜中性粒細(xì)胞磁珠加入到細(xì)胞中，并孵育樣品(4℃30分鐘)。利用磁鐵分離嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合的珠，用pbs洗滌，并保存在冰上。
然后從每個(gè)樣品中分離rna(利用
人ls175t結(jié)腸腺癌腫瘤，llc1癌和b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞
利用從皮下注射有人ls174t結(jié)腸腺癌腫瘤(腫瘤大小＝約0.3cm)的無胸腺裸小鼠(n＝5)，皮下注射有l(wèi)ewis肺小鼠llc1癌細(xì)胞(腫瘤大?。郊s0.6cm)的c57/b1小鼠(n＝5)，以及22天前靜脈內(nèi)注射有106b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞(當(dāng)腫瘤細(xì)胞是小鼠來源時(shí)，crna-b樣品與oligo
根據(jù)由這些實(shí)驗(yàn)獲得的和圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15、圖16中所示的數(shù)據(jù)，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(從注射有人前列腺或結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的小鼠或攜帶小鼠肺癌或黑色素瘤的小鼠獲得的)具有多種癌癥相關(guān)基因標(biāo)志，這些標(biāo)志還在它們對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)(圖21)。這些癌癥相關(guān)基因沒有被(i)從腫瘤攜帶小鼠分離的非吞噬性t細(xì)胞；和(ii)由非腫瘤攜帶小鼠獲得的吞噬嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)或最低限度地表達(dá)。
例如，從攜帶lncap人前列腺癌細(xì)胞的裸小鼠的血液中分離的嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)也在lncap細(xì)胞中表達(dá)的7種人腫瘤基因標(biāo)志(humancancerpathwayfindermicroarry)(比較圖9的a和b中陣列的圖譜(分布))。這些基因在由腫瘤攜帶小鼠獲得的t細(xì)胞或從正常小鼠分離的嗜中性粒細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(參見圖9的c和d中的圖譜(分布))。最后，掃描這些陣列，每個(gè)基因的密度利用由該公司提供的軟件定量，并且那些被吞噬細(xì)胞選擇性過表達(dá)的基因如圖19和圖20所示進(jìn)行識(shí)別。圖21和圖22列出了通過腫瘤攜帶小鼠的吞噬性wbc獲取并差異性呈現(xiàn)的基因標(biāo)志。如圖21所示，檢測(cè)到許多致癌基因(例如erbb2和jun)并且它們經(jīng)常同時(shí)在巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中表達(dá)(通過以綠色突出的基因示出)。
實(shí)施例8
檢測(cè)從癌癥患者獲得的吞噬細(xì)胞中的腫瘤特異基因標(biāo)志
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，將來自癌癥患者的血液?jiǎn)魏思?xì)胞/巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜與來自同一供體個(gè)體的非吞噬t細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行比較，以識(shí)別吞噬細(xì)胞內(nèi)的腫瘤特異性標(biāo)志，這些標(biāo)志在非吞噬細(xì)胞中不表達(dá)或顯著不同地表達(dá)。
具有頭頸腫瘤的患者
從已知患有頸鱗狀細(xì)胞癌并計(jì)劃手術(shù)的患者獲得10毫升靜脈血(到含有edta的試管)。在室溫下以2,000rpm離心5分鐘后，將血沉棕黃層轉(zhuǎn)移到試管中并用pbs洗滌。
采用t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞-兔抗人免疫磁性dynabeads(來自invitrogentm，carlsbad，ca)來分離細(xì)胞。大體上，將珠依次加入到wbc樣品中并在單獨(dú)的4℃、30分鐘孵育后，利用磁體來分離t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞結(jié)合的珠并用pbs洗滌3次。
然后從每個(gè)樣品中分離rna(利用
根據(jù)由這些實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(從頭頸癌患者獲得的)具有多種癌癥相關(guān)基因標(biāo)志，這些標(biāo)志也在它們對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。這些癌癥相關(guān)基因沒有被非吞噬t細(xì)胞表達(dá)或最低限度地表達(dá)。
例如，從一個(gè)這樣的患者的血液分離的嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)4個(gè)人腫瘤基因標(biāo)志(humancancerpathwayfindermicroarry)，這些標(biāo)志也在由同一患者獲得的腫瘤活檢中表達(dá)(比較圖17的b和c中陣列的圖譜(分布))。這些基因在正常皮膚活檢和從相同血液樣品分離的t細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(分別參見圖17的a和d中的圖譜(分布))。最后，掃描陣列，利用由該公司提供的軟件來定量每一基因的密度，并識(shí)別被吞噬細(xì)胞選擇性過度表達(dá)(>2倍)的以下基因：e26病毒致癌基因同系物(ets2)、hiv-1tat相互作用蛋白(htat1p2)、il8(嗜中性粒細(xì)胞激活和趨化)、jun致癌基因(jun)、和基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp9)。
卵巢癌患者
利用從患有卵巢癌的患者分離的細(xì)胞進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)由這些實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(從患病的婦女獲得的)表達(dá)許多癌癥相關(guān)基因，這些基因沒有被非吞噬t細(xì)胞表達(dá)或最低限度地表達(dá)。
例如，從卵巢癌患者的血液分離的巨噬細(xì)胞表達(dá)23個(gè)人腫瘤基因標(biāo)志(humancancerpathwayfindermicroarry)，這些標(biāo)志在從相同的血液樣品分離的t細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度地表達(dá)(比較圖18的a和b中的圖譜(分布))。最后，掃描陣列，利用由該公司提供的軟件定量每一基因的密度，并確定每種細(xì)胞類型中每種癌癥相關(guān)基因的密度。23個(gè)在巨噬細(xì)胞中不同上調(diào)/過度表達(dá)的癌癥相關(guān)基因的列表以及巨噬細(xì)胞與t細(xì)胞強(qiáng)度比均示于圖22中。應(yīng)當(dāng)注意，檢測(cè)到總共5個(gè)致癌基因(在圖21中用紅色示出)。
實(shí)施例9
檢測(cè)從攜帶人前列腺lncap腫瘤和人結(jié)腸ls174t腫瘤的小鼠獲得的巨噬細(xì)胞中的腫瘤特異性蛋白標(biāo)志
使用蛋白純化試劑盒(norgen,incorporated,product#23500)來從小鼠wbc、t細(xì)胞、和巨噬細(xì)胞中分離和純化蛋白。該分析非常簡(jiǎn)單快速(大約30分鐘)并且具有高質(zhì)量和優(yōu)異的產(chǎn)率(每4毫升血液117.6+10.60μg，n＝5)的分離的蛋白可以用于許多下游的應(yīng)用，如圖23所示的sds-page分析和蛋白質(zhì)印跡。
從攜帶lncap和ls174t腫瘤的小鼠獲得的吞噬(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)和非吞噬(t-淋巴細(xì)胞)細(xì)胞中分離蛋白樣品，其被選擇用于這些研究，這是由于前者的細(xì)胞系表達(dá)psa(denmeadeetal.(2001)prostate48:1；linetal.(2001)j.urol.166:1943)而后者呈現(xiàn)出腫瘤特異性糖蛋白(tag-72)，一種高分子量粘蛋白(colcheretal.(1981)proc.natl.acad.sci.usa78:3199)；colcheretal.(1984)cancerres.44:5744；kassisetal.(1996)j.nucl.med.37:343。蛋白質(zhì)印跡分析采用16μg純化的蛋白樣品進(jìn)行。大體上，每個(gè)樣品與2體積的sds加載緩沖液混合并在10％sds-page上與未染色的精確度加蛋白標(biāo)準(zhǔn)(biorad)一起在tris-甘氨酸-sds緩沖液(ph8.4)中以200伏運(yùn)行。利用minitrans-blot(biorad)裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(在40℃下過夜)，并且轉(zhuǎn)移含有25mmtris、ph8.4、192mm的甘氨酸，和20％甲醇的緩沖液。膜用5％脫脂奶粉封閉(在室溫(rt)下60分鐘)，然后用b72.3，一種小鼠抗人tag-72的單克隆抗體，或er-pr8，一種小鼠抗人psa的單克隆抗體孵育(1小時(shí)，室溫)。洗滌雜交物(blots)然后與immun-star山羊抗小鼠-hrp結(jié)合物(biorad)，對(duì)小鼠igg特異的二抗一起孵育，并通過用魯米諾和過氧化物緩沖液(biorad)的1:1混合物孵育(5分鐘，rt)顯影，接著進(jìn)行放射自顯影。
數(shù)據(jù)清晰地表明來自lncap腫瘤攜帶小鼠的吞噬細(xì)胞對(duì)于psa是陽(yáng)性的，而這種蛋白在來自同一動(dòng)物的非吞噬t細(xì)胞中不能檢測(cè)到，如圖24所示。類似地，tag-72通過由ls174t腫瘤攜帶小鼠獲得的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞來表達(dá)并在來自同一動(dòng)物的t細(xì)胞中完全不存在。這些發(fā)現(xiàn)表明通過吞噬細(xì)胞“獲取”和表達(dá)腫瘤特異性蛋白標(biāo)志。
雖然這些數(shù)據(jù)是對(duì)患有癌癥的動(dòng)物和由小鼠的血液獲得的吞噬和非吞噬細(xì)胞是特異性的，但是描述的方法在人和用從其它體液獲得的吞噬和非吞噬細(xì)胞診斷和/或檢測(cè)一種或多種其它障礙和/或疾病中也是有用的。
實(shí)施例10
圖譜實(shí)驗(yàn)
血液吞噬細(xì)胞的分離
從患者中獲得血液樣品。將血(約5毫升)轉(zhuǎn)移至含有50微升0.5medta(終edta濃度＝約4.8mm)的50ml試管中。輕輕旋轉(zhuǎn)試管并加入25mlrbc裂解緩沖液(norgen,incorporated)。再次輕輕旋轉(zhuǎn)試管，在室溫下孵育直到溶液的顏色變?yōu)榱良t色(3-5分鐘)，并以2,000rpm離心3分鐘。在小心吸出上清后，用40ml沒有ca/mg的0.1mpbs(含有2％fbs，2mmedta，和20mm葡萄糖)洗滌wbc，然后將細(xì)胞(106/ml)與細(xì)胞染色溶液一起孵育(30分鐘，4℃，在暗處)，所述染色溶液包含(i)dna，活細(xì)胞滲透染色劑hoechst33342(4μg/ml；em＝483nm)，(ii)抗人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞單克隆抗體(alexa
基因譜
制備人全基因組基因譜。對(duì)于從人腫瘤細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞(nn＝2，nn>2)和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(m/mn＝2，m/mn>2)獲得的rna樣品，將使用通過affymetrix,incorporated的
癌癥誘導(dǎo)相關(guān)基因的上調(diào)/下調(diào)
利用triazol(invitrogen，incorporated)來分離rna并利用設(shè)置在試劑盒中的小試管(cartridges)進(jìn)行純化。rna質(zhì)量和數(shù)量將利用bioanalyzer2100(agilenttechnologies，incorporated，paloalto，ca)和degradometer軟件版本1.41(網(wǎng)址：dnaarray.org)來評(píng)價(jià)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有助于辨別由于腫瘤存在的結(jié)果而擾亂的分子通路。
微陣列實(shí)驗(yàn)的分析
產(chǎn)生的大尺度/高通量分子表達(dá)數(shù)據(jù)的分析將強(qiáng)烈依賴于以下能力：(i)識(shí)別具有dna含量>2n的吞噬細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，(ii)注釋識(shí)別的基因，和(iii)將注釋的基因分配給那些被特異性腫瘤表達(dá)的注釋基因?？梢岳缋胐chip軟件包來進(jìn)行微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所述軟件包可以在它的“分析/比較樣本(analysis/comparesamples)”菜單中容納這種類型的基因列表構(gòu)造。當(dāng)采用affymetrixgenechips時(shí)，將采用一個(gè)或多個(gè)基因芯片和相關(guān)的方法以確認(rèn)原初的微陣列數(shù)據(jù)的量(gautieretal.(2004)bioinformatics20:307)。此外，還將采用各種背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化步驟來達(dá)到用于探針組的標(biāo)準(zhǔn)化和歸納化的最佳方案(來產(chǎn)生表達(dá)價(jià)值)(huberetal.(2002)bioinformatics18(suppl.1):s96；wuetal.(2004)journaloftheamericanstatisticalassociation99:909；seoandhoffman(2006)biomedcentralbioinformatics7:395)。在2步過濾步驟中，我們將比較pn＝2與pn>2的基因譜并構(gòu)建表達(dá)的基因的列表，然后將這些基因與對(duì)于每個(gè)腫瘤細(xì)胞系識(shí)別的腫瘤特異基因相比較-如圖5所示在過濾pn＝2的基因譜后。例如，(i)從乳腺癌患者獲得血液；(ii)分離嗜中性粒細(xì)胞(n>2和n＝2)并且以一式三份確定它們的基因譜；(iii)計(jì)算每組的每一識(shí)別基因的平均值(來自3個(gè)樣品)和其各自的標(biāo)準(zhǔn)誤差(se)(nn>2和nn＝2)；(iv)然后比較兩組的基因譜并根據(jù)welch改進(jìn)的2樣本t試驗(yàn)，基于絕對(duì)值≥2倍對(duì)數(shù)變化(nn>2/nn＝2)來識(shí)別表達(dá)基因的列表(l-1)；(v)比較nn＝2和乳腺癌(由腫瘤和正常乳腺組織活檢獲得)的基因表達(dá)譜并識(shí)別表達(dá)基因的列表(l-2)；以及(vi)通過比較l-1和l-2中的基因(“分析/比較樣本/聯(lián)合比較”，dchip)并過濾共有的基因來識(shí)別由nn>2獲得/表達(dá)的乳腺癌特異性基因標(biāo)志
蛋白譜
使來自每種細(xì)胞的50-100微克的總蛋白變性并且在60℃下用tris-(2-羧乙基)膦胰蛋白酶(1mm)和0.02％十二烷基磺酸鈉還原1小時(shí)。隨后封閉半胱氨酸，并且在37℃下用胰蛋白酶消化總蛋白12-16小時(shí)。所得的肽(用標(biāo)簽113-119和121)itraq標(biāo)記1小時(shí)(4叢或8叢，取決于待比較的細(xì)胞類型的數(shù)量)。標(biāo)記后，將分開標(biāo)記的樣品合并并注射到裝備有強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(appliedbiosystems4.6×100多孔的)的agilent1200系列hplc系統(tǒng)中。然后將96個(gè)收集的部分(流分)匯聚成14個(gè)部分，并且在反相條件下(lcpackings15cm×75μm分析柱)將每個(gè)部分注射到lcpackingsultimatehplc系統(tǒng)中用于第二輪分級(jí)(分離)。利用lcpackingsprobot將反相部分直接點(diǎn)樣到靶板上并且用質(zhì)譜(appliedbiosystems4800plusproteomicsanalyzer)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)獲取后，利用protienpiot軟件包(appliedbiosystemsmdssciex)處理光譜，并且利用proteinpilottm軟件來識(shí)別每個(gè)細(xì)胞類型中的單獨(dú)的蛋白和它們的相對(duì)表達(dá)水平(癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)組標(biāo)志的分析和識(shí)別與圖5概述的用于基因組標(biāo)志的類似)。
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